Đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha grushv )

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT o0o NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thị Phương Trang Hà Nội - 2018 LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, hướng dẫn khoa học giúp đỡ tận tình TS Nguyễn Thị Phương Trang Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới hướng dẫn Trong q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn này, tác giả nhận quan tâm giúp đỡ nhiệt tình nhiều mặt Ban lãnh đạo Viện ST & TNSV,cán phụ trách đào tạo Viện, TS Đặng Tất Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử Di truyền bảo tồn Chân thành cảm ơn anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS Nguyễn Giang Sơn, TS Hồ Thị Loan, TS Phạm Thế Cường, ThS Lê Thị Mai Linh ln nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, bảo bước ban đầu lĩnh vực nghiên cứu khoa học Cuối cùng, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình ln bên cạnh động viên giúp đỡ suốt q trình hồn thành luận văn Luận văn hồn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song phương Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Thị Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16 Tác giả xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tơi thực hiện, số liệu thu thập kết phân tích đề tài trung thực, đề tài không trùng với đề tài nghiên cứu khoa học Những thơng tin tham khảo khóa luận trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Ngày tháng năm 2018 Học viên thực ( Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Hồng Mai MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC .v TỪ VIẾT TẮT, DANH MỤC vi KÝ CÁC DANH HIỆU BẢNG MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Giới thiệu chi Sâm (Panax 1.2 Tổng quan linh .3 sâm L.) ngọc 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Phân bố tự nhiên sâm ngọc linh 1.2.3 Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học sâm ngọc linh 1.2.4 Cơng trình nghiên cứu loài sâm ngọc linh 1.2.5 Hiện trạng loài sâm ngọc linh Việt Nam 1.3 Phương pháp luận cận 10 cách tiếp CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng 16 2.2 Địa điểm cứu 16 thời 2.3 Phương pháp 16 nghiên gian nghiên cứu nghiên cứu 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số 16 2.3.2 Lựa chọn mồi SSR 17 2.3.3 Phân tích số liệu SSR 18 2.3.4 Thiết kế mồi đọc trình tự 19 2.3.5 PCR khuếch đại gen 20 2.3.6 Điện di gel agarose 21 2.3.7 Kiểm tra khả bắt cặp BLAST 21 2.3.8 Đọc trình tự gen 21 2.3.9 Xây dựng phát sinh chủng loại 21 CHƯƠNG KẾT 23 QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 23 3.2 Lựa chọn mồi SSR 23 3.3 Kết phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh 25 3.4 Kết khuếch đại gen từ cặp mồi đặc hiệu 30 3.5 Kết phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử vùng gen rbcL, rpoB, ITS 32 18S loài sâm ngọc linh 3.6 Kết phân tích mối quan hệ di truyền sâm ngọc linh với số loài chi Panax sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS - sơ đồ mối quan hệ di truyền chúng 47 3.7 Kết so sánh khả phân loại sâm ngọc linh loài chi Panax khác ba .50 vùng gen nghiên cứu 3.8 Kết đăng ký mã số vùng gen nghiên cứu ngân hàng gen 55 KẾT LUẬN .56 KIẾN NGHỊ .57 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN CỦA TÁC GIẢ 58 TÀI LIỆU THAM 59 KHẢO PHỤ LỤC 65 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU AFLP Đa hình độ dài đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) bp base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool CBOL Consortium for the Barcode of Life DNA Deoxyribo Nucleic Acid ME Phương pháp Minimum Evolution Method MP Phương pháp Maximum Parasimony Method NJ Phương pháp Neighbor Joining PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RAPD Đa hình đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) RFLP Đa hình độ dài đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats) UPGMA Unweighted Pair Group Method Analysis VQG Vườn Quốc Gia DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền 17 Bảng 2.2 Bảng trình tự cặp mồi dùng khuếch đại đọc trình tự gen.20 Bảng 2.3: Danh sách lồi/thứ Genbank sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.1: Thơng số đa dạng di truyền lồi sâm ngọc linh dựa phân tích thị SSR 26 Bảng 3.2 Kết so sánh Nu sai khác vùng gen rbcL (gồm rbcLa rbcLc) sâm ngọc linh loài khác thuộc chi Panax 37 Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền gen rbcL lồi sâm ngọc linh (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) so sánh với lồi /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44 Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền gen rpoB lồi sâm ngọc linh ( phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) so sánh với lồi /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 44 Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền vùng gen ITS loài sâm ngọc linh 45 (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) so sánh với lồi /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 45 Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền mồi 18S lồi sâm ngọc linh (phía bên trái) số lượng nucleotide sai khác (phía bên phải) so sánh với lồi /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh sâm ngọc linh Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh chín Hình 2.1 Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh 15 Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số điện di gel agarose 1% 22 Hình 3.2 Một số hình ảnh alen ghi nhận phân tích SSR mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 PG - 1481 23 Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S điện di gel agarose 1% 30 Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc điện di gel agarose 1% 30 Hình 3.5 Ví dụ hình ảnh peak giải trình tự 31 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với lồi Panax ngân hàng gen 35 Hình 3.7 Kết so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với lồi Panax ngân hàng gen 36 Hình 3.8 Kết so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với lồi Panax ngân hàng gen 39 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự nucleotide gen ITS với lồi Panax ngân hàng gen 41 Hình 3.10: Sơ đồ hình (NJ) mối quan hệ di truyền sâm ngọc linh với loài khác chi Panax dựa phân tích trình tự vùng gen ITS rbcL 48 Hình 3.11 Thứ tự ghép nối đoạn gen nghiên cứu 50 Hình 3.12 Kết so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa so sánh vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) kết hợp chúng 53 Hình 3.13 Sơ đồ mối quan hệ di truyền chín lồi thuộc chi Panax phân tích dựa kết hợp trình tự gen rbcL ITS 54 10 Lê Thị Thu Hiền, Hugo de Boer, Nông Văn Hải, Lê Thanh Hương, Nguyễn Mai Hương, Lars Bjork (2012) “ Mã vạch phân tử DNA hệ thống dự liệu mã vạch sống” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 10(3): 393-405 11 Nguyễn Thị Thu Hương, (2003) “Kết nghiên cứu tác dụng dược lý Sâm Việt Nam” Hội thảo bảo tồn phát triển Sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr 7690 12.Đào Kim Long Nguyễn Châu Giang (1991), “Sơ lược trình phát sâm đốt trúc vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum)”, Tập viết lịch sử ngành Dược khu tỉnh Quảng Nam - Đà Nẵng, Liên chi hội Dược học tỉnh Quảng Nam – Đà 60 Nẵng xuất bản, tr 138146 13 Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thị Mai Linh, Lê Thanh Sơn, 2014 “Mối quan hệ di truyền mẫu Sâm thu Lai Châu sở phân tích trình tự nucleotide vùng matK ITS –rDNA”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 12(2): 327-337 14.Trần Công Luận (2003), “Kết nghiên cứu hoá học sâm Việt Nam 1978 – 2002”, Hội thảo bảo tồn phát triển sâm Việt Nam, Tam Kỳ, tr 6275 15 Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hương (2013) “Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.) Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng đầy triển vọng Việt Nam” Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5: 1152-1158 16 Nguyễn Thới Nhâm, Phan Văn Đệ, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (1993), “Sâm Việt Nam-Kết nghiên cứu từ 1978-1992” - Báo cáo nghiệm thu đề tài khoa học cấp Nhà nước thuộc chương trình 64C, chủ biên: Trung Tâm Sâm Việt Nam-Bộ Y tế 1-97 17 Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Thanh Trăng, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Yăn Phượng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân lồi Mỡ Hải Nam (Manglietỉa hainanensis Dandy) thị RAPD cpSSR”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, số 2, tr 918-925 18.Dương Tấn Nhựt, 2010, Nghiên cứu nhân giống vơ tính sản xuất sinh khối rễ Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.), Phân viện Sinh học Đà Lạt 61 19 Dương Tấn Nhựt, 2011 Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu chương trình phát sinh hình thái bảo tồn Sâm ngọc linh, (đề tài Quỹ phát triển khoa học Công nghệ Quốc Gia) 20 Khuất Hữu Thanh (2005), Kỹ thuật gen -Nguyên lý ứng dụng, tr 36-40 NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 21 Nguyễn Tập (2005), “Các loài chi Panax L Việt Nam ”, Tạp chi Dược liệu, 10(3),7176.29 62 22 Nguyễn Thị Phương Trang, Lê Thanh Sơn, Nguyễn Giang Sơn, Phan Kế Long, 2011 Phát loài sâm Panax sp (Araliaceae) Việt Nam Tạp chí Dược học, 10: 5963 23 Phạm Quang Tuyến, cộng (2018) “Đánh giá đa dạng di truyền số mẫu giống sâm thu thập Lai Châu”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Việt Nam 60(2) 2.2018 24 Lê Minh Thảo, 2014, Xây dựng dẫn địa lý “Ngọc Linh” cho sản phẩm Sâm củ hai tỉnh Quảng Nam Kontum, Trung tâm ứng dụng Thông tin KHCN tỉnh Quảng Nam 25 Lê Thanh Sơn Nguyễn tập (2006), “Những đặc điểm sinh thái sâm ngọc linh”, Tạp chí Dược liệu, 14 (4), 145147 Tài liệu Anh Tiếng 26.Avise CJ (1992), Molecular population structure and the biogeographic history of regional fauna: a case history with lessons for conservation biology Oikos No 63: pp: 62-76 27 Bahulikar R A., Lagn M D., Kulkarrnu B G., Pandit S S., Suresh H S., Rao M K V., Ranjekar P K., Gupta V S (2004), “Genetic diversity among spatially isolated populations of Eurya nitida Korth (Theaceae) based on inter-single sequence repeats“, Current Science, 86(6): 824-831 28 Cascante A., Quesada M., Lobo J J.,Fuchs E A.(2002), “Effects of dry tropical forest fragmentation on the reproductive success and genetic structure of 63 the tree Samanea saman“, Journal of Society of Conservation Biology, pp 137147 29 CBOL (2009), Plant Working Group, DNA barcode for land plants, PNAS 106(31), 1279497 30 Choi I.J., Kim H., Kim N.H., Choi B.S., Ahn I.O., Lee J.S., and Yang T.K., 2011 Development of reproducible EST-derived SSR markers and assessment of genetic diversity in Panax ginseng cultivars and related species Journal of Ginseng 64 reseach, 412 vol.35 399- 31.Chen X, Liao B, Song J, Pang X, Han J, Chen S (2013) A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding Gene 530(1): 39-43 32.Doyle J J and Doyle J L (1987), “A rapid DNA isolation procedure for small qualities of fresh leaf material” Phytochemical Bull 19: 11-15 33.Godt M J W., Johnson B R., Hamrick J L (1996), “Genetic diversity and population for multiple size of four southern Appalachian plant specie“ Cons Biol., 10: 796-805 34 Galina D Reunova, I.L.Kat, T.I.Muzarok, T.T.P.Nguyen, T.T.Dang, E.V.Brenner and Yu.N.Zhuravlev, (2011) Diversity of Microsatellite loci in the Panax vietnamensis Ha & Grushv (Araliaceae) population Doklady Biological Sciences, vol 441, 408-411 35 Galina D Reunova, Olga G Koren, Tamara I Muzarok, Yury N Zhuravlev, (2014) Microsatellite analysis of Panax ginseng natural populations in Russia Chinese medicine, vol 5, 231-243 36 Ha, T D and Grushvitzky, I.V.,(1985) “New species in Panax (Araliaceae) in Việt Nam”, J Botany, vol.70, pp 518 – 522 37 Hillis DM, Moritz C & Mable BK (1996) Molecular Systematics edition Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc 38 Komatsu K., Zhu S., Fushimi H., Qui T.K., Cai S., Kadota S., (2001) Phylogenetic analysis based on 18S-rDNA gene and MatK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species Planta Med, 67 (5): 461-465 39 Kress W J., Wurdack K J., Zimmer E A., Weight L A., Janzen D H (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants” Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 102: 8369–8374 65 40 Kress W J and Erickson D L (2007), “A two-locus global DNA barcodefor plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region” PLoS-ONE 2(6):e508 66 41.Keller L F and Waller D M (2002), “Inbreeding effects in wild population”, Trends in Trends in Ecology and Evolution, 11, pp 424-429 42 Kim J., Jo B.H., Lee K.L., Yoon e.S., Ryu G.H., Chung K.W., (2007) Identification of new microsatellite markers in Panax ginseng Molecules and Cell, vol 24, 60-68 43 Komatsu K, Zhu S, Fushimi H, Qui T, Cai S, Kadota S (2001) Phytogenetic analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences of Panax vietnamensis and five related species Planta Med 67(5): 461-465 44 Litt, M and Luty, J.A (1989) A Hypervariable Microsatellite Revealed by in Vitro Amplification of a Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin Gene American Journal of Human Genetics, 44, 397-401 45 Lahaye R., van der Bank M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Gigot G., Maurin O., Dathoit S., Barraclough T.G., Savolainen V (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots” PNAS, 105(8), 2923-2928 46 Lee C, Wen J (2004) Phylogeny of Panax using chloroplast trnC–trnD intergenic region and the utility of trnC–trnD in interspecific studies of plants Mol Phylogenet Evol 31: 894-903 47 Hollingsworth PM (2008).DNA barcoding plants in biodiversity hot spots: progress and outstanding questions Heredity (Edinb) 101(1): 12 48 Lahaye R., van der Bank M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Gigot G., Maurin O., Dathoit S., Barraclough T.G., Savolainen V (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots” PNAS, 105(8), 2923-2928 49 Nguyen Thu Huong, Matsumoto K., Kasai R., Yamasaki K., Watanable H., 1999 Effects of Vietnam ginseng on psychological stress-induced changes in pharmacological respones Pharmacological reseach on traditional medicines, (editors: Watanable H And Shibuya T Harwood Academic publisher), pp 77-92 67 50 Swofford D L (1993), PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony, version 3.1.1 Champaign, IL: Illinois Natural History Survey 68 51 Sudhir Kumar Glen Stecher Koichiro Tamura (2016), MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets Molecular Biology and Evolution, Volume 33, Issue 7, July 2016, Pages 1870– 1874 52 Zuo Y, Chen Z, Kondo K, Funamoto T, Wen J, Zhou S (2011) DNA barcoding of Panax species Planta Med 77(2): 182-187 53 Zhu S, Fushimi H, Cai S, Komatsu K (2003) Phylogenetic relationship in the genus Panax: Inferred from choloroplast trnK gene and nuclear 18S rDNA gene sequences Planta Med 69(7): 647-653 54 Wolfe KH, Li WH, Sharp PM (1987) Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochrondial Chloroplast, and nuclear DNAs Proc Natl Acad Sci USA 84: 9054-9058 55 Pennisi E (2007) Taxonomy Wanted: A barcode for plants Science 318(5848): 190-191 56 Yurry Um, Mei Lan Jin, Ok Tae Kim, Young Chang Kim, Seong Cheol Kim, Seon Woo Cha, Ki Wha Chung, Serim Kim, Chan Moon Chung, Yi Lee, 2016 Identification of Korean Ginseng (Panax ginseng) cultivars using Simple sequence repeat markers Plant Breed Biotech (1): 71-78 57 https://www.ncbi.nlm.nih.gov 58 http://www.technelysium.com.au/.ChromasPro.html 69 PHỤ LỤC Hình Sơ đồ peak giải trình tự gen rbcLa sâm ngọc linh 70 Hình Sơ đồ peak giải trình tự gen rbcLc sâm ngọc linh 66 Hình Sơ đồ peak giải trình tự gen rpoB sâm ngọc linh Hình Mối quan hệ di truyền số loài chi Panax (phương pháp Neighbor Joining) vùng gen rpoB 67 Hình 4: Sơ đồ peak giải trình tự gen ITS sâm ngọc linh 68 Hình Sơ đồ peak giải trình tự gen 18S sâm ngọc linh 69 ... sâm ngọc linh, so sánh với số loài Panax khác Mục tiêu cụ thể: - Xác định đặc điểm di truyền quần thể hai quần thể sâm ngọc linh thu tỉnh Quảng Nam Kon Tum - Đánh giá mối quan hệ di truyền sâm ngọc. .. dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), bộc lộ rõ biến đổi di truyền quần thể, cá thể, cha mẹ ; ( 3) kết phân tích DNA cho phép xác định xác lồi, quần thể tận cá thể. .. phương Đông mà toàn giới nhân sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất (Panax notoginseng) sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv. ) [6], [3], [9], [21] Ở Việt Nam,