báo cáo thực hành nuôi cấy tế bào thực vật kỹ thuật cấy truyền mẫu mô thực vật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT Môn học : Nuôi cấy tế bào thực vật Mã môn học : 211207 Họ tên : Đinh Thuy Danh Lớp : Thứ 3_Tiết Mssv : 19126021 Tp.HCM, Tháng năm 2022 MỤC LỤC Bài GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG 1.Nồi hấp 1.1 Cấu tạo 1.2 Nguyên lý hoạt động Bài CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK) 2.1 Giới thiệu 2.2 Vật liệu – Trang bị 2.3 Phương pháp tiến hành 2.3.1 Pha stock môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) 2.3.2 Pha stock chất điều hòa sinh trưởng 2.4 Pha cồn 70º Bài CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 3.1 Giới thiệu 3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng pha mơi trường nuôi cấy 3.3 Cách tiến hành pha môi trường 3.3.1 Chuẩn bị đo môi trường nuôi cấy Bài KỸ THUẬT CẤY TRUYỀN MẪU MÔ THỰC VẬT in vitro 4.1 Vật liệu nuôi cấy 4.2 Cách tiến hành 4.3 Kết sau ngày cấy Bài KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY 10 5.1 Vật liệu nuôi cấy 10 5.2 Cách tiến hành 10 5.2.1 Khử trùng tủ cấy 10 5.2.2 Khử trùng mẫu cấy 11 5.2.2.1 Thao tác bên tủ cấy 11 5.2.2.2 Thao tác bên tủ cấy 12 Bài GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG Nồi hấp: 1.1 Cấu tạo: - Buồng tiệt trùng - Bộ điều khiển chương trình gia nhiệt - Lồng đựng dụng cụ, môi trường - Vale xả nước - Đồng hồ đo áp suất - Công tắc mở nguồn 1.2 Nguyên lý hoạt động: Buồng tiệt trùng buồng kín kim loại, phía đáy nồi có gắn điện trở giúp đun nóng nước tạo nước áp suất Cho khoảng lít nước vào nồi hấp (lưu ý nước phải vừa ngập điện trở) tiến hành đậy nấp nồi, vặn kín ốc xung quanh nấp mở công tắc gia nhiệt Khi nước đun sơi bay bay kín buồng chứa mẫu, dụng cụ môi trường tiếp xúc với nhiệt độ, áp suất cao khiến cho vi sinh vật bị tiêu diệt Sau thời gian định, thiết bị ngưng gia nhiệt tiến hành mở vale xả nước ngồi Đèn chng báo báo kết thúc trình, chờ cho thiết bị xả hết khí, đồng hồ báo hiệu mở nắp lấy dụng cụ Bài CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK) 2.1 Giới thiệu: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loại phận nuôi cấy, thưowngc bao gồm thành phần chính: - Đường (nguồn carbon), muối khống đa lượng, muối khoáng vi lượng, vitamin chất điều hịa sinh trưởng Ngồi cịn có thêm số thành phần khác acid amin, EDTA, nước dừa, dịch chiết nấm men, khoai tây, chuối,…Có nhiều cơng thức môi trường công bố sử dụng, mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962) sử dụng rộng rãi - Nhằm tiết kiệm thời gian công sức, thường pha dung dịch stock (hay gọi dung dịch gốc), dung dịch đậm đặc gấp 10 – 100 lần, bảo quản lạnh sử dụng lâu dài 2.2 Vật liệu – Trang thiết bị: Hóa chất cần thiết; cân điện tử, máy khuấy từ gia nhiệt; cốc thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, pipette, nước cất, dung môi HCl KOH 2.3 Phương pháp tiến hành: 2.3.1 Pha stock cho môi trường MS (Murashige Skoog, 1962): - Stock đa lượng: Pha riêng chất CaCl2.2H2O KH2PO4 dễ bị kết tủa liều lượng đậm đặc pha stock - Stock vi lượng - Stock Fe-EDTA - Stock vitamin Các bước tiến hành: - Tính khối lượng hố chất cần sử dụng; kiểm tra xếp hoá chất theo thứ tự - Cân riêng hoá chất cân điện tử - Hồ tan hố chất với lượng nhỏ nước cất đủ để làm tan hoá chất - Cho dung dịch thành phần vào cân định mức - Thêm nước cất vào bình định mức đến thể tích yêu cầu khuấy - Đổ dung dịch stock vào chai, ghi tên stock nồng độ lên chai; bảo quản lạnh Bảng Thành phần mơi trường MS Hố chất KNO3 Đa lượng Vi lượng Nồng độ Khối lượng Thể tích Thể tích dd (mg/l) (g) dd stock stock/lít mt 1900 190 lít H2 O 20 ml/l NH4NO3 1650 165 MgSO4.7H2O 370 37 CaCl2.2H2O 440 44 500 ml ml/l KH2PO4 170 17 500 ml ml/l CoCl2.6H2O 0,025 0,0025 CuSO4.5H2O 0,025 0,0025 H3BO3 6,2 0,62 500 ml ml/l KI 0,83 0,083 MnSO4.4H2O 22,3 2,23 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,025 ZnSO4.H2O 8,6 0,86 500 ml ml/l Fe-EDTA Na2EDTA.2H2O 37,3 3,73 FeSO4.7H2O 2,78 27,8 Vitamine Glycine 2,00 0,2 Myo-Inositol 100 10 Nicotinic acid 0,50 0,05 Pyridoxine HCl 0,50 0,05 Thiamine-HCl 0,10 0,01 200 ml ml/l 2.3.1 Pha stock chất điều hoà sinh trưởng: Pha stock nồng độ mg/ml: cân 0,1g hố chất, hồ tan lượng nhỏ (1 - 50 ml) dung mơi, sau thêm nước cất định mức lên 100 ml Bảo quản dung dịch stock chất điều hồ sinh trưởng lọ kín (riêng IAA, 2,4D; NAA cần lọ màu nâu để tránh ánh sáng) đặt ngăn đá tủ lạnh 2.4 Pha cồn 70°: Pha dung dịch cồn 70° từ dung dịch cồn 96° theo tỉ lệ 78 ml cồn 96° : 22 ml nước Bài CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 3.1 Giới thiệu Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật mô điều kiện sống môi trường bên ngoài, bao gồm thành phần dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon giá thể Với điều kiện vậy, sinh trưởng bình thường phát triển theo ý muốn người ni cấy với bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật Mỗi loại thích hợp với cơng thức mơi trường khác Các bình mơi trường sử dụng phải hấp tiệt trùng trước dùng 3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng để pha mơi trường ni cấy Thiết bị, dụng cụ Hố chất - Nồi hấp (Autoclave) - Máy cất nước - Máy đo pH - Đường - Máy khuấy từ - Cân điện tử - Agar (Cân số) - Dung dịch chuẩn độ (KOH - - Dung dịch stock môi trường cần chuẩn bị Becher, ống đong (50 ml, 10 1N, HCl 1N) ml) - Pipette thủy tinh (5ml, 2ml) - Đũa thủy tinh - Muỗng, vá 3.3 Cách tiến hành pha môi trường: 3.3.1 Chuẩn bị môi trường ni cấy: Cách pha lít mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) thực sau: - Cho khoảng 200 ml nước cất vào becher lít - Lần lượt thêm stock theo công thức môi trường cần pha với thể tích thích hợp (được ghi bình chứa stock) Sau lần thêm stock phải tráng ống đong, pipet với nước cất; cho thêm nước cất để tránh tượng kết tủa - Hòa tan đường (60 g/l) với nước cất, đổ vào becher - Thêm nước cất vào cho đủ lít dung dịch - Đo pH đạt 5,7 - 5,8 Nếu môi trường chưa đạt pH mong muốn dùng dung dịch chuẩn độ điều chỉnh pH (tăng pH nhỏ thêm vài giọt KOH, giảm pH nhỏ thêm vài giọt HCl) - Thêm agar 16 g/l (agar thêm vào chuẩn pH môi trường nuôi cấy xong) - Khuấy hỗn hợp môi trường chia bình ni cấy (40 - 50 ml/bình) - Đậy nút bình nút bơng, nút cao su nylon chịu nhiệt - Hấp khử trùng nhiệt độ 121°C áp suất 1,0 atm Bài KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN MẪU THỰC VẬT in vitro 4.1 Vật liệu ni cấy: Mẫu in vitro có sẵn phịng thí nghiệm 4.2 Cách tiến hành: - Bật đèn UV tủ cấy 15 phút, chờ 30 phút sau đèn tắt sử dụng - Cột tóc, xắn tay áo (nếu mặc áo dài tay), tháo đồng hồ trang sức - Rửa tay xà sau lau tay lại cồn 70° - Mặc áo blouse - Mở quạt, mở đèn tủ cấy, lau tủ cấy cồn 70° - Các dụng cụ phải hấp khử trùng trước sử dụng Để tất dụng cụ vào tủ cấy, ngâm pince, dao cồn 90° Hơ dụng cụ (pince, dao, dĩa) lửa đèn cồn Chú ý: không chạm tay vào mẫu cấy, không đưa tay qua nơi để dụng cụ mẫu cấy Ngâm pince vào cồn 90° hơ lửa đèn cồn sau thao tác - Lau bề mặt chai môi trường trước đặt vào tủ cấy - Hơ miệng bình chứa mẫu cần cấy chuyền, mở nắp bình - Gắp từ bình để dĩa có để sẵn giấy cấy - Dùng dao tách ra, cắt bớt rễ (nếu rễ nhiều > dài > cm) héo vàng Chú ý không làm tổn thương đến sau chuyển sang bình mơi trường Trong trường hợp tạo chồi từ protocom mô sẹo, cắt mẫu thành mảnh khoảng 0,5 cm cấy vào môi trường - Cấy vào chai mơi trường, bình khoảng mẫu mô - Ghi tên mẫu cấy, ngày cấy người cấy lên chai, sau đặt vào phịng tăng trưởng 4.3 Kết sau ngày cấy: Bài KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY 5.1 Vật liệu nuôi cấy: Các mẫu cấy thường sử dụng: lá, hoa, thân, rễ, đỉnh sinh trưởng hạt Cách chọn mẫu cấy: lấy mẫu cấy khỏe mạnh, không bị sâu bệnh Mẫu cấy sinh viên tự chọn (Hoa, hạt, thân cây, cành cây…) Bảng Các chất khử trùng thường sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật Tác nhân khử trùng Nồng độ sử dụng (%) Thời gian khử trùng (phút) Calcium hypochlorite - 10 - 30 Sodium hypochlorite 0,5 - 5,0 - 30 Hydrogen peroxide - 12 - 15 Ethyl alcohol 70 - 95 0,1 - 5,0 Silver nitrate - 10 0,1 - - 20 Mercuric chlorite 5.2 Cách tiến hành: 5.2.1 Khử trùng tủ cấy: - Bật đèn UV tủ cấy 15 phút, chờ 30 phút sau đèn tắt sử dụng - Cột tóc, xắn tay áo (nếu mặc áo dài tay), tháo đồng hồ trang sức - Rửa tay xà bơng sau lau tay lại cồn 70° - Mặc áo blouse - Mở quạt, mở đèn tủ cấy, lau tủ cấy cồn 70° - Các dụng cụ phải hấp khử trùng trước sử dụng Để tất dụng cụ vào tủ cấy, ngâm pince, dao cồn 90° Hơ dụng cụ (pince, dao, dĩa) lửa đèn cồn Chú ý: không chạm tay vào mẫu cấy, không đưa tay qua nơi để dụng cụ mẫu cấy Ngâm pince vào cồn 90° hơ lửa đèn cồn sau thao tác 10 5.2.2 Khử trùng mẫu cấy: 5.2.2.1 Thao tác bên tủ cấy: - Chọn mẫu cấy không bị sâu bệnh, khoẻ, sinh trưởng nhanh, mẫu sống sinh trưởng bình thường tạo Mẫu khơng q già non mẫu cây, mẫu hoa chọn hoa búp, mẫu hạt chọn hạt - Rửa mẫu vòi nước chảy khoảng phút cho trôi hết bụi bẩn - Rửa ngâm mẫu vào xà phịng lỗng (nước rửa tay rửa chén) khoảng 10 phút Đối với mẫu thân gỗ tăng thời gian ngâm lên 15 - 20 phút - Lấy lau thân rửa lại mẫu vòi nước chảy khoảng - phút - Dùng cồn 70° lau tồn thân sau bỏ vào bình tam giác khử trùng - Lau bình mẫu cồn 70° cho vào tủ cấy 11 5.2.2.2 Thao tác bên tủ cấy: - Rửa mẫu cồn 70°, lắc khoảng 30 giây - Rửa mẫu lại nước cất vô trùng lần (1 lần/3 - phút) - Dùng kẹp chuyển mẫu sang bình tam giác hấp khử trùng - Rửa mẫu nước Javel với nồng độ khoảng 30% (Javel:H2O tỷ lệ 3:7) tùy mẫu, cách vài phút lắc vài lần để dung dịch ngấm thuốc khử trùng khoảng 20 phút - Rửa mẫu nước cất vô trùng lần (1 lần/3 - phút) - Gắp mẫu từ bình để lên đĩa có sẵn giấy cấy - Dùng kéo cắt bỏ phần hoại tử màu trắng bỏ Cắt mắt nụ tiến hành cấy vào môi trường MS - Ghi tên, ngày cấy lên chai, sau đặt vào phòng tăng trưởng - Ghi nhận kết vô mẫu sau - ngày 12 ... nuôi cấy Bài KỸ THUẬT CẤY TRUYỀN MẪU MÔ THỰC VẬT in vitro 4.1 Vật liệu nuôi cấy 4.2 Cách tiến hành 4.3 Kết sau ngày cấy Bài KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY... (DUNG DỊCH STOCK) 2.1 Giới thiệu: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loại phận nuôi cấy, thưowngc bao gồm thành phần chính: - Đường (nguồn carbon),... VÔ TRÙNG MẪU CẤY 5.1 Vật liệu nuôi cấy: Các mẫu cấy thường sử dụng: lá, hoa, thân, rễ, đỉnh sinh trưởng hạt Cách chọn mẫu cấy: lấy mẫu cấy khỏe mạnh, không bị sâu bệnh Mẫu cấy sinh viên tự chọn