- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được ưu tiên áp dụng ở ĐTD, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với STD Màu sắc của mô s[r]
(1)Giáo trình thực tập CNSH thực vật BÀI : KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
1 VẤN ĐỀ LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG
Khi khởi nuôi cấy mô tế bào số đối tượng định,vấn đề đặt chọn môi trường sở để phối hợp tỷ lệ chất dinh dưỡng Cách thường làm qua tài liệu xuất bản, công trình nghiên cứu đối tượng họ tương đương xem tác giả sử dụng mơi trường loại Bước đầu giữ ngun mơi trường tác giả sở mà cải tiến cho phù hợp qua thí nghiệm thăm dị Trong hàng trăm mơi trường nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại khác nhau, nhiều mục đích ni cấy khác Về chia làm loại: - Mơi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình mơi truờng White, Knop Knudson C …
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: điển hình môi trường B5 Gamborg …
- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình mơi trường MS (Murashige-Skoog) …
Vì bắt đầu nghiên cứu ni cấy mơ số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước nên thăm dị so sánh loại môi trường xem đối tượng nghiên cứu phù hợp với loại mơi trường
Sau cần thử tìm tỉ lệ NO3 -/ NH4+ thích hợp Các tác giả phương Tâylàm việc với trồng cạn thường không đưa NH4+ vào môi trường Nhưng dinh dưỡng NH4 + mạnh lúa, việc thêm vào môi trường nuôi cấy tỉ lệ NH4 + thích hợp chắn có lợi Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa số môi trường cản trở nhiều tiến cơng tác số phịng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật Thuốc carốt loại kinh điển nuôi cấy mô thực vật Môi trường nuôi cấy loại xây dựng hồn chỉnh Tuy vậy, khơng thể dùng ngun mơi trường để nghiên cứu hoà thảo họ đậu mà khơng có cải tiến, sửa đổi Điều giải thích tiến chậm chạp ni cấy mơ số hoà thảo so với mầm
Hiện nay, môi trường MS coi mơi trường thích hợp vớinhiều loại giàu cân mặt dinh dưỡng Vì vậy, người tập làm nuôi cấy mô thường bắt đầu với mơi trường trước tìm mơi trường riêng
(2)Để thuận tiện cho việc pha môi trường nuôi cấy người ta khơng cân hố chất lần pha mà thường chuẩn bị trước dạng dung dịch đậm đặc (còn gọi stock), sau cần pha lỗng sử dụng Các stock thường bảo quản dài ngày tủ lạnh thường tủ lạnh sâu
2.1 Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog) Ký hiệu Thành phần Nồng
độ MT (mg/l)
Số lần nhân
Lượng hóa chất cần pha trong dd mẹ ( g)
S.lượng dd mẹ cần pha (ml) ( nước cất)
Lượng dd mẹ cần lấy để pha 1 lít MT
Đa lượng MS MS 1
NH4NO3 1650 100 165
1000 10
KNO3 1900 100 190
KH2PO4 170 100 17
MS 2 CaCl2.2H2O 440 100 44 1000 10
MS 3 MgSO4.7H2O 370 100 37 1000 10
Vi lượng MS
MS 4
H3BO3 6.2 100 620 mg
1000 10
MNSO4.7H2O 22.3 100 2230mg
ZnSO4.7H2O 8.6 100 860mg
Kl 0.83 100 83mg
Na2MoO4.2H20 0.25 100 25mg CuSO4 5H2O 25 100 2.5mg
CoCl2 25 100 2.5mg
MS5 Na2EDTA 37.5 100 3.75g 1000 10
FeSO4.7H2O 27.8 100 3.75g Vitamine
MS 6
mio-inosytol 100 200 20000mg
1000
Axit nicotinic 0.5 200 100mg Pyridoxin HCl 0.5 200 100mg Thiamin HCl 0.1 200 20mg
Glycine 0.2 200 400mg
Saccharose 30g/l Thạch – g/l pH từ 5.8 – 6.0
2.2 Cách pha dung dịch mẹ (stock) * Stock đa lượng MS : MS1
NH4NO3 165g
KNO3 190g
KH2PO4 17g
(3)Cân lượng hóa chất dùng nước cất hoà tan chất cốc đong cho tan hoàn toàn Dùng ống đong 1lít điều chỉnh cho đủ lít
* Stock đa lượng MS : MS 2 CaCl2.2H2O 44g
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng pha 1Lmơi trường MS 10 ml/L) Cân lượng hóa chất dùng nước cất hoà tan chất cốc đong cho tan hoàn toàn Dùng ống đong 1lít điều chỉnh cho đủ lít
Stock đa lượng MS : MS 3
MgSO4.7H2O 37g
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng pha 1Lmơi trường MS 10 ml/L) Cân lượng hóa chất dùng nước cất hoà tan chất cốc đong cho tan hoàn toàn Dùng ống đong 1lít điều chỉnh cho đủ lít
Stock Vi lượng MS : MS 4
H3BO3 620 mg
MNSO4.7H2O 2230mg ZnSO4.7H2O 860mg
Kl 83mg
Na2MoO4.2H20 25mg CuSO4 5H2O 2.5mg
CoCl2 2.5mg
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng pha 1L môi trường MS 10 ml/L) Cân lượng hóa chất dùng nước cất hoà tan chất cốc đong cho tan hoàn toàn Dùng ống đong 1lít điều chỉnh cho đủ lít
* Stock sắt MS: MS 5
Na2EDTA 3.75g
FeSO4.7H2O 2.78g
(Pha thành 1L với nồng độ sử dụng pha 1L mội trường MS 10ml/L) Cân hoà tan chất 500mL nước cất cốc riêng Đặt cốc dung dịch lên bếp gia nhiệt cho dung dịch ấm lên vừa có nóng bốc lên Khuấy đổ dung dịch Na2EDTA vào ống đong 1000 mL, cho từ từ dung dịch FeSO4 vào, vừa cho vừa khuấy Để nguội cho vào bình tối bảo quản tủ lạnh
* Stock Vitamin MS : MS 6
(4)Glycine 400mg
(Pha thành 1Lvới nồng độ sử dụng pha 1Lmôi trường MS ml/L)
Cân lượng hóa chất dùng nước cất hoà tan chất cốc đong cho tan hoàn toàn Dùng ống đong 1lít điều chỉnh cho đủ lít
* Thành phần chất điều hòa sinh trưởng thực vật (tính theo mg) Dung dịch BAP (1mg/mL)
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan 5mL NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100 mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg BAP Dung dịch IAA (1mg/mL)
Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan mL NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IAA
Dung dịch IBA (1mg/mL)
Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan 5mL NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg IBA
Dung dịch Kinetin (1mg/mL)
Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan mL NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg KIN
Dung dịch NAA ( 1mg/mL)
Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan 5mL NaOH 1N Cho thêm nước cất cho đủ 100mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg NAA
Dung dịch 2,4-D (1mg/mL)
Cân 100mg 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan 50mL ethanol 50% Cho thêm nước cất cho đủ 100mL Mỗi mL dung dịch có chứa 1mg 2,4-D
3 THỰC HÀNH
- Tiến hành pha dung dịch đậm đặc môi trường MS ( Pha stock đa lượng và vi lượng)
- Pha stock vitamin
(5)PHIẾU PHA MÔI TRƯỜNG Ngày pha : ………. Số lượng :1 lít
Loại mơi trường :Vào mẫu Ký hiệu : VM
Người pha : ………
Thành phần môi trường Số lượng Kiểm tra Ghi chú
MS
MS 1 10ml
MS 2 10ml
MS 3 10ml
MS 4 10ml
MS 5 10ml
MS 6 5ml
Chất kích thích
NAA IBA
BA 0.2ppm
Kinetin Các
chất khác
Đường 30gr
Agar 8gr
Than
* Trình tự pha chế môi trường : Trước pha chế môi trường cần phải : - Kiểm tra hóa chất
- Tính tốn lượng mơi trường theo phiếu mẫu ghi sẵn - Tính tốn lượng bình để pha chế
- Chuẩn bị loại nút đậy - Ghi nhãn giấy để bọc
Bước ; Đong lượng muối khoáng, vitamin theo nồng độ ghi phiếu yêu cầu Trước pha cần phải bổ xung 1/3 lượng nước cất vào cốc đong sau tiến hành lấy dung dịch để pha loãng
Bước : Bổ sung thêm đường khuấy đều
Bước 3: Bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng ( Tùy lồi ni cấy mà có loại chất khác nhau)
(6)Bước ; Nấu mơi trường: Trong q trình nấu dung dịch bắt đầu bốc ta cho lượng thạch theo yêu cầu vào , khuấy , để sôi tắt bếp
Bước : Phân chia lượng môi trường theo u cầu vào bình ni cấy. Thơng thường ngắn ngày ta đổ môi trường ( 40ml/1 bình)Cịn loại dài ngày ta đổ mơi trường ( 60ml/1 bình) để sử dụng đủ Đậy nút môi trường lại
Bước : Khử trùng môi trường nhiệt độ 121o thời gian từ 25 phút sau để nguội di chuyển mơi trường đến phịng vơ trùng
Lưu ý : Trong q trình pha chế mơi trường , không làm ô nhiễm dung dịch mẹ lúc sử dụng pipet trực tiếp mà phải đổ cốc đong lượng mơ phịng tương đương Tốt loại nên sử dụng dụng cụ riêng
BÀI : GIEO HẠT IN-VITRO 1 CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY
1.1 Chọn lựa mơ cấy
Khơng có hướng dẫn cụ thể việc chọn mô cấy Về nguyên tắc, trừ mơ cấy hóa gỗ, mơ khác thể thực vật dùng làm mơ cấy Tuy nhận xét chung mô phát triển, thịt non, non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh… đặt vào mơi trường có chứa lượng chất sinh trưởng thích hợp có khả phân chia phân hóa Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vơ tính định, trước tiên người ta ý đến chồi nách mô phân sinh Cần biết mang lượng thông tin di truyền nhau, mơ khác sinh trưởng phát triển với khả tái sinh chồi, rễ hay hoàn chỉnh khác
(7)sáng ổn định Tuỳ vào mục đích nghiên cứu mà có chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn q trình tạo mơ sẹo cần bóng tối hay ánh sáng, trình tái sinh nhân giống vơ tính thiết phải có ánh sáng Nhiệt độ phịng ni nên giữ ổn định 25+20C máy điều hòa nhiệt độ Cường độ chiếu sáng khoảng từ 2000 –3000 lux
1.2 Xử lý vô trùng mẫu cấy
Mẫu đưa vào ni cấy invitro có nhiều nguồn gốc khác Có thể mẫu cấy vô trùng invitro cho nảy mầm điều kiện vô trùng; mẫu cấy chưa vơ trùng, lấy trực tiếp từ bên tự nhiên chồi non, lá, thân, củ, rễ… Thuận lợi sử dụng mẫu cấy vô trùng lẽ phương pháp vô trùng mẫu cấy trực tiếp thường nhiều gây hại cho mẫu cấy chất khữ trùng gây
Có nhiều phương thức vơ trùng mẫu cấy: a Vô trùng hạt:
- Rửa hạt xà phòng, lắc 2-3 phút Với loại hạt nhỏ, thường đựng hạt túi vải mùng
- Rửa xà phòng nước máy vòi nước chảy mạnh - Vô trùng sơ cồn 70%, lắc 1-2 phút - Rửa cồn nước vô trùng - Cho hạt vào dung dịch khử trùng NaOCl 1-15% Thêm vài giọt bám dính Tween20 Khử trùng 15-20 phút tuỳ mẫu
- Rửa chất khử trùng nhiều lần nước vô trùng (khoảng lần) hết mùi javel
- Hạt vơ trùng ni cấy mơi trường tạo mẫu vô trùng b Các phương thức khác vô trùng hạt
- Khử trùng lần thứ với NaOCl 5,25%
- Khử trùng lần thứ hai với HgCl2 0,1 –1%, thêm vài giọt HCl 0,5% 10 phút
- Rửa mẫu với H2O2 6% vô trùng trước rửa lại nước vô trùng - Có thể khử trùng sơ hạt acid sulfuric 2-10 phút
- Với hạt có vỏ cứng, dùng phương pháp đốt để khử trùng sơ c Vô trùng chồi non, thân cỏ:
- Vô trùng sơ cách ngâm mẫu vào cồn 70% 1-3 phút, thời gian xử lý tuỳ thuộc vào độ cứng hay mềm mẫu
(8)- Rửa lại nước vơ trùng cho hồn tồn chất khử trùng d Vô trùng củ, rễ
- Mẫu nuôi cấy phải rửa vòi nước chảy mạnh cho thật đất cát bám mẫu, sau ngâm nước xà phịng lỗng 10 phút
- Vơ trùng sơ cồn 70% 1-5 phút
- Vơ trùng với chất khử trùng có nồng độ thời gian thay đổi tuỳ mẫu - Rửa lại nước vô trùng cho thật chất khử trùng
e Tránh hoại mẫu
Trong q trình ni thường xuất nhiễm q trình ni cấy để bào tử khơng khí rơi vào hay mẫu cấy chưa vơ trùng hồn tồn Sau thời gian bào tử phát triển nhanh chóng làm chết mẫu cạnh tranh chất dinh dưỡng làm mẫu không phát triển
Hoại mẫu thường nấm mốc (khuẩn lạc có dạng sợi) khuẩn (khuẩn lạc có dạng ván nhầy) Nếu nấm khuẩn mọc tr6en bề mặt môi trường, thường nhiễm thao tác cấy chưa tốt; có khắp mơi trường nhiễm mơi trường chưa tiệt trùng hồn tồn; cịn khuẩn nấm xuất phát từ gốc mẫu lan mẫu chưa khử trùng triệt để Tuỳ theo quan sát dựa vào kinh nghiệm người cấy mà có nhận định xác ngun nhân gây hoại mẫu để tìm cách khắc phục tình trạng Trong trường hợp bình ni cấy bị nhiễm, cần hấp bỏ trước đem rửa để tránh lây lan nguồn nhiễm khu vực cấy
2 THỰC HÀNH 2.1 Mục đích
Giúp cho sinh viên làm quen với thao tác vô trùng mẫu cấy kỹ thuật cấy vô trùng
2.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 2.2.1 Dụng cụ:
- Bình tam giác (250mL) - Giấy cấy vô trùng
- Bécher (cốc đốt thuỷ tinh) 500mL, 1000mL - Forceps (kẹp), dao cấy, đèn cồn
(9)- Tủ sấy
- Tủ cấy (laminar) - Tủ lạnh
- Cân kỹ thuật
- Máy cất nước lần - Máy khuấy từ - pH kế
2.2.3 Hoá chất
- Dung dịch stock môi trường MS - Đường saccharose
- Agar
- Nước cất vô trùng - Cồn 90%, 70%
- Dung dịch hypochloride calcium 10% - Xà phòng bột
2.3 Các bước tiến hành 2.3.1 Chuẩn bị môi trường (thành phần cho 1L môi trường) - Stock MS1 : 10ml
- Stock MS : 10ml - Stock MS : 10ml - Stock MS : 10ml - Stock MS : 10ml - Stock MS6 : 5ml - Sucrose: 30g - pH :5,8 - Agar:7g
2.3.2 Nguyên liệu thực vật:
(10)- Cho hạt vào bécher có chứa nước xà phịng lỗng, rửa hạt cho chất nhớt bám xung quanh hạt
- Rửa hạt cho xà phòng nước cất Ngâm hạt 2phút cồn 70% - Rửa hạt etanol nước cất Sau ngâm hạt 10phút dung dịch hypochloride calcium 10%
- Trong tủ cấy vô trùng, rửa hạt cho chất khử trùng cách lắc hạt nước cất vô trùng (3 lần)
- Tiến hành tách áo hạt kẹp dao mổ vô trùng Cho hạt vừa tách bỏ vỏ áo vào đĩa petri vô trùng có chứa giấy thấm vơ trùng làm ẩm giấy thấm nước cất vơ trùng
- Gieo hạt: gieo 4-5 hạt vào bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy hấp khử trùng
- Đậy nắp bình cấy ghi rõ họ tên, ngày cấy, số nhóm, tên giống mơi trường
2.4 Yêu cầu
- Thực pha môi trường gieo hạt
- Thực thao tác vô trùng nuôi cấy kỹ thuật gieo hạt - Thu vô trùng ống nghiệm
- Ghi nhận giai đoạn tăng trưởng nảy mầm từ hạt
(11)1 GIỚI THIỆU
Trong nuôi cấy invitro, phương thức đơn giản thường hay sử dụng để tái sinh chồi invitro nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hiểu cách nghĩa ni cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần mô phân sinh với 3-4 tiền phát khởi lá, tức đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1 – 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng Kỹ thuật phức tạp, phải thực kính lúp khả sống sót mẫu cấy có kích thước nhỏ thường khơng cao, do tiến hành cần ni cấy với mục đích tạo invitro virus
Trên thực tế người ta thường ni đỉnh chồi non với kích thước khoảng vài mm Đó đỉnh chồi đỉnh chồi nách Mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi cấy điều kiện thích hợp tạo hay nhiều chồi chồi phát triễn thành hoàn chỉnh Xét nguồn gốc đó, có ba khả năng:
- Cây phát triển từ chồi
- Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ
- Cây phát triển từ chồi phát sinh, ví dụ: ni cấy đoạn trụ hạ diệp mãng cầu (Annona squamosa) cho nhiều mầm (buds) mô cấy một số mầm sau phát triễn thành chồi sau thành invitro hồn chỉnh Tuy nhiên thơng thường khó phân biệt chồi phá ngủ chối phát sinh Các phương thức phát triễn hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy sau:
* Phát triển trực tiếp:
Chủ yếu đối tượng hai mầm (dicotyledon) khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc… Ví dụ: Khoai tây (Solanum tuberosum):
Mầm (đỉnh sinh trưởng) → Chồi nách → Cây * Phát triển thông qua giai đoạn protocorm
Chủ yếu gặp dối tượng mầm (monocotyledon) phong lan, dứa, huệ… Cùng lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm (proembryo) protocorm tiếp tục phân chia thành
protocorm phát triển thành hoàn chỉnh Bằng phương thức thời gian ngắn người ta thu hàng triệu cá thể, ví dụ: Hoa lan (Orchidaceae):
Đỉnh sinh trưởng → Protocorm → Cây
(12)sinh trưởng Đất bẩn dội sách đưới vòi nước chảy lột sách thấy rõ chồi bên Chồi non lúc nhúng vào cồn 70% khử trùng dung dịch khử trùng 10%(v/v) Các chồi bên lấy rửa nước cất vơ trùng Sau đó, chúng khử lại thêm 10 phút dung dịch khử trùng 3% có chứa Tween80 rửa lại nước cất vô trùng Trong tủ cấy vô trùng, phần gốc chồi nhỏ cắt bỏ việc cấy tiến hành Trên chồi lớn hơn, trước hết tách bỏ phần gốc bị chết tác động chất khử trùng,sau cấy vào mơi trường Phải thời gian tương đối dài protocorm thành lập Các rotocorm cắt cấy chuyền vào môi trường Ngày nay, người ta thường cấy đỉnh chồi lớn (mang 3-4 tiền phát khởi lá) dễ thành cơng cấy đỉnh chồi có tiền phát khởi Nếu protocorm khơng cắt khỏi mẫu cấy phát triễn thành cồi rễ; tách khỏi mẫu cấy có thành lập protocorm bất định từ peotocorm ban đầu Khi cấy đỉnh sinh trưởng Cymbidium có vùng xung quanh tiền phát khởi u lên cuối tạo thành protocorm Sự thành lập protocorm tạo mà khơng cần có đỉnh sinh trưởng Khi cấy đỉnh sinh trưởng Cattleya, mô thường nhanh chóng hố nâu Vì lý do mà đỉnh sinh trưởng cắt môi trường lỏng ước cất vô trùng vấy môi trường lỏng, nhờ chất nâu dễ khuyếch tán vào trong mơi trường gây ảnh hưởng đến mơ cấy (Fast, 1980) Ở Cattleya, người ta thường tách chồi (3-5mm) với nhiều tiến phát khởi Môi trường cấy Cattleya thường phức tạp môi trường cấy Cymbidium (Fast, 1980 và Champanat,1977) đơi có chứa auxin, cytokinin, nước dừa peptone Sự thành lập protocorm Cattleya nhiều thời gian tạo phần gốc già nhất; thực tế đỉnh sinh trưởng khơng đóng vai trị mất Việc cấy tiền phát khởi Cattleya đápứng cho thành lập protocorm
Mơi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơn giản giống môi trường gieo hạt cho nhiều giống lan káhc Cymbidium thường nuôi cấy môi trường khoáng Knudson C Vacin & Went
Đỉnh sinh trưởng thường cấy môi trường đặc (ngoại trừ
Cattleya)nhưng protocorm thường nhân lên môi trường lỏng, và
(13)Chất điều hoà sinh trưởng thực vật nói chung khơng cần thiết, diện chúng mơi trường làm hội cho đột biến lớn Nhiệt độ tối ưu cho nhân giống từ 22-280C Ánh sáng đèn huỳnh quang thường sử dụng với 12-16 chiếu sáng/ngày Có thể ni cấy cường độ chiếu sáng thấp cần gia tăng ánh sáng giai đoạn tạo chồi từ protocorm
Nói chung thực việc nhân giống lan từ đỉnh sinh trưởng theo cách: môi trường đặc môi trường lỏng Trong mơi trường lỏng cần lắc vịng với vận tốc khác tuỳ theo loài hầu hết nhà nghiên cứu thường thực với vận tốc thấp 2-5 vịng/phút Sự nhân giống mơi trường lỏng thường tốt mơi trường đặc lắc cung cấp O2 chất dinh dưỡng cho mẫu cấy hiệu Khi cao khoảng 5-7cm với 3-4 mang trồng vườn ươm
Các đối tượng hoa lan mang lại hiệu kinh tế đặc biệt cao Sau kết quả chi Cymbidium Morel (1966) người ta thu kết quả tốt 22 chi khác họ Sở dĩ nhân giống vơ tính hoa lan đạt thành cơng lớn ứng dụng rộng rãi hoa lan có phương thức sinh sản qua protocorm Nhờ có phương thức nhân giống nhanh rẻ tiền mà hoa lan vốn đắt trở nên có giá phải nhiều người ưa chuộng Những thành công họ Lan
chứng mà mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật loài khác
2 THỰC HÀNH 2.1 Mục đích
- Khử trùng mẫu đỉnh chồi
- Khảo sát tái sinh trực tiếp từ nuôi cấy đỉnh chồi - Khảo sát thành lập protocorm từ nuôi cấy đỉnh chồi 2.2 Nuôi cấy phát triển thành trực tiếp
2.2.1 Nguyên vật liệu
Đoạn thân non cam chanh, hoa cúc
2.2.2 Môi trường nuôi cấy ( pha môi trường theo phiếu hướng dẫn) Môi trường MS bổ sung BA 2ppm NAA 0,2ppm
2.2.3 Tiến hành:
- Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm cắt bỏ hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào bécher
(14)phòng nước máy nhiều lần vòi nước chảy mạnh
- Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm cồn 70% 2-3 phút - Rửa cồn nước cất vô trùng lần
- Xử lý mẫu Ca(OCl)2 6% 10 phút sau thay dung dịch Ca(OCl)2 5% phút
- Rửa mẫu nước cất vô trùng 6-7 lần cho hết mùi javel
- Cành mẫu cắt bỏ cuống đầu phần thân bị chất khử trùng tẩy trắng Chia cành mẩu thành đốt 1cm
- Cắm đốt vào môi trường nuôi cấy chuẩn bị, cho phần cuống hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm mặt thống mơi trường - Ni mẫu điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày 250C
2.3 Nuôi cấy phát triễn thông qua giai đoạn protocorm 2.3.1 Nguyên vật liệu
Các đoạn chồi Dendrobium cao 10cm 2.3.2 Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (cho 1L môi trường)
- Khoáng đa lượng Knudson 100mL - Khoáng vi lượng Heller 5mL - Skoog II MS : 2mL
- Vitamin Morel: 2mL - Glycin :2mL
- Inositol : 5mL - Vitamin B1: 5mL - Đường: 30g
- Nước dừa: 150mL - Khoai tây: 60g
- Than hoạt tính: 0,25g - pH: 5,5
- Agar: 6g
(15)- NH4NO3 : 500mg/L - NH4(SO4)2: 500mg/L - Ca(NO3)2 : 241,3mg/L - KCl : 250 mg/L
- KH2PO4 : 250 mg/L - MgSO4 : 122,15mg/L
* Khoáng vi lượng Heller (1953) - AlCl3.6H2O : 0,054 mg/L
- CuSO4.5H2O : 0,03 mg/L - H3BO3 : 6,2 mg/L
- KI : 0,01 mg/L
- MnSO4.H2O : 0,08 mg/L - NiCl2.6H2O : 0,03 mg/L - ZnSO4.7H2O :1,0 mg/L 2.3.3 Các bước tiến hành:
- Rửa chồi Dendrobium vòi nước chảy Dùng dao mổ lột hết lá non bao xung quanh chồi để lộ chồi bên chồi
- Ngân chồi nước xà phịng lỗng dùng gịn lau nhẹ lên thân chồi Rửa cho xà phòng vòi nước chảy
- Lắc chồi cồn 70% phút Sau xử lý với dung dích javel thương phẩm theo tỉ lệ 1:5 vòng 25-30 phút CaClO2 ( 5%)
- Trong tủ cấy, dùng kẹp vơ trùng cho chồi vào bécher có chứa nước cất vô trùng lắc 3-5 lần cho hết mùi javel
- Đặt chồi lên giấy vô trùng.dùng dao cắt riêng chồi bên chồi khỏi chồi mẹ ban đầu Nhớ cắt bỏ hết mô chết bị chất khử trùng làm trắng phần gốc chồi Cấy chồi vào ống nghiệm có chứa mơi trường chuẩn bị
- Ni phịng sáng
- Ghi rõ tên nhóm, ngày cấy, giống vào tất ống nghiệm 2.4 Yêu cầu
(16)BÀI :NUÔI CẤY MƠ SẸO 1 GIỚI THIỆU
Ni cấy mơ sẹo khâu quan trọng nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo nguyên liệu khởi đầu cho nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mơ tế bào, chọn dịng tế bào, ni cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học… Mơ sẹo khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ mơ quan phân hóa điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý chất điều hoà sinh trưởng thực vật…) Các tế bào thuộc mô quan phải chịu phản phân hóa trước lần phân chia Nhìn chung tạo mơ sẹo invitro (nhờ auxin tác động) trình:
- Sự phản phân hóa tế bào nhu mơ (ít nhiều sâu bên quan) bao gồm tế bào nhu mô mộc libe, nhu mô vỏ hay lõi
- Sự phân chia tượng tầng: tế bào tượng tầng phần lớn STD dễ dàng phân chia tác động auxin thấm chí khơng cần auxin ngoại sinh loài cỏ hay dây leo
- Sự xáo trộn mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) trình ưu tiên áp dụng ĐTD, tượng tầng thiếu nhu mơ khó phản phân hố so với STD Màu sắc mô sẹo không giống môi trường nuôi cấy khác hay phận khác chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…
Nồng độ loại kích thích tố sử dụng môi trường nuôi cấy yếu tố có ảnh hưởng đến hình thành phát triển mơ sẹo Thường mơ sẹo hình thành mơi trường giàu auxin; dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với kết hợp với cytokinin tuỳ loại Hàm lượng hormon nội sinh chiều di chuyển hormon mẫu cấy có ảnh hưởng đến phát sinh mơ sẹo Vì nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến phát sinh mô sẹo dẫn đến phản ứng khác mẫu cấy
Với số vấn đề khơng quan trọng có số chịu ảnh hưởng lớn
2 THỰC HÀNH 2.1 Mục đích:
(17)2 Vật liệu
2.2.1 Môi trường ni cấy
MS (20g/l đường) có bổ sung 0.1μM 2,4-D 1μM 2,4-D 2.2.2 Nguyên liệu thực vật
Cây thuốc in- vitro
2.2.3 Hoá chất dụng cụ
- Nuớc cất vô trùng
- Dao, kẹp, đĩa cấy, giấy cấy… 2 Các bước thực hiện
Cẩn thận gắp in-vitro khỏi bình ni cấy Tránh kẹp q mạnh làm dập mẫu cấy (hình A)
- Dùng dao cấy cắt đoạn rễ, lóng thân chuyển qua dĩa cấy khác để xử lý mẫu (hình B)
- Lá: cắt bỏ gân rìa Phần lại cắt thành nhiều mảnh nhỏ với kích thước 0,8 -1mm x –10mm Đặt mảnh nuôi đĩa petri chứa môi trường MS + 1μM 2,4-D
- Lóng thân: chọn đoạn lóng thân có đường kính 2-2,5mm cắt lát mỏng 0,05 – 0,1mm lưỡi dao thật sắc Các lát cắt đặt nằm đĩa petri chứa môi trường MS + 1μM 2,4-D
- Rễ: Rửa agar nước cất vô trùng, cắt nhỏ thành đoạn 1- 1,5mm đặt lên đĩa petri có chứa môi trường MS + 0.1μM 2,4-D
- Dùng nhựa nylon quanh mép đĩa petri để đảm bảo vô trùng thời gian nuôi
- Ghi rõ số nhóm, tên mẫu cấy, tên mơi trường ngày cấy - Đặt nuôi tối
4 Yêu cầu:
- Thao tác xử lý mẫu cấy tốt, lát cắt dứt khoát mỏng tốt; tránh dập mẫu