Giáo trình thực vật có hoa part 7 ppsx

Số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy được gọi là số lượng thể nhiễm sắc cơ bản và được ký hiệu là X nó tương ứng với số lượng thể nhiễm sắc trong các giao tử của các loài lưỡng bội.. Hiện na

nhiễm sắc có kích thước nhỏ hơn nhiều so với các thể nhiễm sắc bình thường và thường có dạng cầu nhỏ gọi là thể nhiễm sắc bổ sung hay còn gọi là thể nhiễm sắc B

7.4.3 Kiểu nhân

ở các cơ thể sinh sản hữu tính trong tế bào sôma đều có bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội (diploide) và được ký hiệu 2n Bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội do sự tập hợp từ hai bộ đơn bội (haploide) (gặp ở tế bào sinh dục) và được ký hiệu là n Bộ thể nhiễm sắc khác nhau về chất lượng và tạo thành một thể thống nhất toàn vẹn được gọi là Jenôm (genom) Do đó trong giao

tử của loài lưỡng bội có một Jenôm còn trong tế bào sôma có 2 Jenôm

Số lượng thể thể nhiễm sắc thay đổi từ loài này sang loài khác nhất là trong quá trình tiến hóa Thông thường số lượng thể nhiễm sắc tăng lên so với số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy

Số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy được gọi là số lượng thể nhiễm sắc cơ bản và được ký hiệu

là X nó tương ứng với số lượng thể nhiễm sắc trong các giao tử của các loài lưỡng bội Hiện tượng tăng số lượng thể nhiễm sắc như vậy gọi là hiện tượng đa bội Các cơ thể đó gọi là thể

đa bội (polyploide) ở các loài đa bội chứa nhiều Jenôm Ví dụ đối với giống Lúa mì (Triticum) có các loài với số lượng thể nhiễm sắc tương ứng 14, 28, 42 như vậy số lượng thể nhiễm sắc đơn bội tương ứng của chúng: 7, 14, 21 Số lượng thể nhiễm sắc cơ bản của chúng

là A = 7 và công thức thể nhiễm sắc được viết như sau:

2n = 2x = 14 (loài chứa 2 Jenôm);

2n = 4x = 28 (loài chứa 4 Jenôm);

2n = 6x = 42 (loài chứa 6 Jenôm)

Trong thiên nhiên một số cơ thể xuất hiện do không có quá trình thụ tinh gọi là đơn tính sinh (apomixic) nên chúng có số lượng thể nhiễm sắc đơn bội Các cơ thể đơn bội như thế không có khả năng sinh sản bằng con đường hữu tính ví dụ như cây Bồ công anh (Taraxacum officinale) thuộc họ Cúc (Asteraceae)

Trong thế giới thực vật mỗi loài đều có một bộ thể nhiễm sắc đặc trưng về số lượng, hình dạng và kích thước Vì vậy người ta đã sử dụng chúng làm tiêu chuẩn phân loại Các thành tựu nghiên cứu thể nhiễm sắc đã góp phần hết sức quan trọng để hoàn thiện và chính xác hóa các sơ đồ phân loại hiện có Nhờ vậy đã giải quyết được nhiều vấn đề mà bằng phương pháp

so sánh hình thái không thể giải quyết được

Hiện nay khi khoa học di truyền học ngày càng thâm nhập vào hệ thống học, ngoài các chỉ

số về số lượng thể nhiễm sắc có khi chẳng có ý nghĩa gì hết vì nhiều loài cùng một họ thậm chí một chi có số lượng thể nhiễm sắc giống nhau, người ta tiến tới sử dụng chỉ tiêu về kiểu nhân (caryotype) và xây dựng nên sơ đồ thể nhiễm sắc (idiogramme) hay biểu đồ nhân (caryogramme) để so sánh và đánh giá

Kiểu nhân là tập hợp tất cả các đặc tính số lượng, chất lượng của bộ thể nhiễm sắc (Số lượng, kích thước, hình thái và cấu trúc thể nhiễm sắc) Biểu đồ nhân là hình ảnh cụ thể của chính bộ thể nhiễm sắc được sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ thể nhiễm sắc tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút và cuối vùng là thể nhiễm sắc SAT Biểu đồ nhân có thể dựa vào ảnh chụp hoặc dựa vào bản vẽ và sắp xếp theo hai cách: 1/ tất cả các thể nhiễm sắc được đặt mút dưới của các thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng và 2/ đặt các tâm động của các cặp thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng Trong hai cách thì cách thứ 2 được sử dụng phổ biến nhất

Biểu đồ thể nhiễm sắc hay còn gọi là thể nhiễm sắc đồ là dựa vào biểu đồ nhân rồi mô hình hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm động tương ứng với thể nhiễm sắc thực như trên biểu đồ nhân

Ví dụ : Kiểu nhân một loài Cúc (Anthemis ruthenica M.B như sau:2 đôi M (Tâm giữa), 5 đôi Sm (Tâm lệch) và 2 đôi A-SAT (Tâm mút với các thể kèm) (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1980): 2

M + 5 Sm + 2A-SAT

7.5 Phương pháp phân loại izoenzym

7.5.1 Định nghĩa izoenzym

Enzym hay izoenzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học ở trong cơ thể sống hoặc ở ngoài tế bào khi có đủ điều kiện cho các phản ứng đó xảy ra Izoenzym là thuật ngữ để chỉ các biến dạng của enzym, các dạng tồn tại trong quần thể tự nhiên, là kết quả của các phản ứng gây ra sự thay đổi các axit amin trong cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptide Cấu trúc này lại do trật tự của các nucleotid trong gen quy định Chính vì vậy khi sử dụng phương pháp điện di trên gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid cùng với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzym

Bởi vậy việc sử dụng các dẫn liệu về đa hình các izoenzym không những hiểu biết gen của

cá thể mà biết mức độ dị hợp của quần thể Mặt khác mỗi biến dạng phân tử enzym là một

“marker” của gen Vì vậy nó được sử dụng cho loài Trong nội bộ loài, việc sử dụng các dẫn liệu đa hình thông qua tần số alen của các locut cũng có thể chỉ ra tính chất đặc trưng cho các vùng phân bố của loài Trên cơ sở như vậy người ta dùng izoenzym để phân biệt các cá thể thuộc các đơn vị phân loại giữa các thứ hoặc giữa các loài, giữa các loài đồng hình, loài chị em

Phương pháp phân tích tính đa hình của izozym là một trong những phương pháp phân loại

ở mức độ phân tử do nó đã tiếp cận với những sản phẩm trực tiếp của quá trình dịch m• di truyền

Nhờ tính rõ ràng của kết quả và sự đa hình của các hệ enzym được sử dụng, kết quả phân tích mang độ chính xác cao và tin cậy

Nó được sử dụng rộng r•i trong việc nghiên cứu mối quan hệ trong và ngoài loài, góp phần xây dựng mối quan hệ xác thực trong hệ thống học của sinh giới, là công cụ đắc lực hỗ trợ cho các nhà phân loại trong trường hợp các khóa phân loại hình thái không đủ để giải quyết vấn đề Tất nhiên cũng cần nói rõ phương pháp này dù nó có phản ảnh bản chất di truyền của loài hay bất kỳ một taxôn nào khác nhưng nó không thể thay thế cho phương pháp phân loại truyền thống Nó sẽ giúp cho việc hoàn chỉnh và làm chính xác cách phân loại truyền thống trên cơ sở dựa vào các dấu hiệu hình thái bên ngoài Mỗi sự thay đổi của gen đều được thể hiện qua tính đa dạng của các izoenzym nhưng chưa chắc các biến đổi đó đã được di truyền lại cho các thế hệ mai sau Vì vậy phải tìm, phải sàng lọc và lựa chọn những biến đổi nào đặc trưng cho loài Đấy mới là điều quan trọng Chính vì vậy phương pháp này chỉ ra cho ta thấy mức độ đa dạng của các gen bên trong và qua đó giúp cho ta biết mối quan hệ huyết thống giữa các taxôn

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di

Phương pháp này được sử dụng rộng r•i trong nghiên cứu hệ thống học bởi 5 lý do sau:

1 Mẫu cần phân tích rất nhỏ

2 Một lần phân tích được nhiều mẫu

3 Các chất dùng cho chạy điện di không quá đắt tiền

4 Dụng cụ chạy điện di khá phổ biến

5 Kết quả thu được phản ảnh gián tiếp sự có mặt của các alen trong cơ thể đối tượng nghiên cứu

Tuy nhiên cũng cần chỉ rõ kết quả trên trước hết có ý nghĩa lớn để đánh giá mối quan hệ họ hàng giữa các taxôn, còn việc sử dụng phương pháp này cũng như các phương pháp phân tích ADN dùng trong phân loại không phải đơn giản Việc nhận dạng và suy luận kết quả của phép phân tích điện di cần phải tuân theo những nguyên tắc đặc thù và đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải am hiểu các phạm trù trong phân loại học, am hiểu đối tượng mà mình nghiên cứu và phải có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương pháp phân loại bằng hình thái làm

cơ sở Về giá trị phân loại của hai phương pháp này có tính hiện thực chỉ khi nào nghiên cứu một cách đầy đủ và trọn vẹn một taxôn nào đấy Trên cơ sở đó mới tìm ra các marker đặc trưng có ý nghĩa trong phân loại Nếu chỉ phân tích từng phần của một taxôn và không phân tích có tính hệ thống thì những số liệu đó chỉ mới nói lên tính đa dạng của taxôn đó hay chỉ dừng lại xem xét mối quan hệ họ hàng ở mức tương đối mà thôi và nếu tách phương pháp này khỏi phương pháp phân loại hình thái như một số nhà sinh học phân tử đã làm lại là một sai lầm không thể chấp nhận

7.5.2.1 Kỹ thuật điện di

Điện di là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng r•i để tách một hỗn hợp các hợp chất có khả năng ion hóa Điện di trên gel kết hợp dựa vào điện tích và quá trình tách dựa vào kích thước phân tử của các đối tượng tham gia điện di Một quá trình điện di cơ bản gồm các bước sau:

* Chuẩn bị mẫu cho phép điện di: Do sự xuất hiện và hàm lượng của các izoenzym là khác nhau ở các bộ phận trong cơ thể, các trạng thái phát triển, điều kiện môi trường Cần phải nghiên cứu để tìm ra vật liệu phù hợp cho việc tách mẫu ban đầu Mẫu phải được bảo quản trong điều kiện tránh sự phân huỷ của izoenzym

* Đổ gel: Tùy theo độ giống nhau của các izoenzym mà chọn nồng độ gel đảm bảo có

độ phân giải cao nhất đối với hệ izoenzym cần nghiên cứu

* Chuẩn bị dung dịch đệm: Dựa vào tài liệu tham khảo cũng như kinh nghiệm thực tế để chuẩn bị các dung dịch đệm có nồng độ và giá trị pH phù hợp và chính xác để đảm bảo kết quả phân tích sẽ lặp lại

* Lựa chọn các thông số về dòng điện, thế năng của nguồn điện di và thời gian chạy mẫu

* Cắt lát gel: Trong trường hợp chạy gel tinh bột, người ta cắt lát các lớp gel từ tấm gel dày ban đầu Các lớp này có thể dùng để nhuộm với các chất nhuộm màu đặc hiệu khác nhau

* Nhuộm gel hay hiện gel: Sau phép chạy điện di, các izozym chưa thể nhìn thấy mà phải làm cho chúng phát màu nhờ những phản ứng được xúc tác bởi các enzym đó Kết quả

của bước này phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của hỗn hợp phản ứng và điều kiện ủ cho phản ứng xảy ra như pH, nhiệt độ, cơ chất, tác nhân nhuộm,…

7.5.2.2 Đọc kết quả nghiên cứu

Để phục vụ cho nghiên cứu phân loại, việc xử lý thông tin sau khi chạy điện di cần phải dựa trên những kiến thức về di truyền học tiến hóa Đây là phần rất quan trọng vì kết quả điện

di chỉ là một hình ảnh chết nếu người nghiên cứu không hiểu được tương quan hệ nội hàm giữa các sản phẩm izoenzym và cấu trúc các alen trong hệ gen m• hóa cho các sản phẩm izoenzym Đọc kết quả điện di có thể hiểu là quá trình xây dựng bảng tương quan giữa vị trí của các băng điện di và số alen quy định các izoenzym

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra cấu trúc khác nhau của phân tử enzym có thể biểu hiện trên điện di đồ là khác nhau Xét một số trường hợp cụ thể sau:

a Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc monomer do một alen trên một locut gen gồm hai alen điều khiển, thì những cá thể đồng hợp tử trội mang kiểu gen AA và đồng hợp tử lặn mang kiểu gen aa sẽ có một băng (pattern), còn cá thể dị hợp tử mang kiểu gen Aa sẽ có hai băng (hình 7.15a)

b Trong trường hợp phân tử enzym là monomer, locut gen chứa ba alen đồng trội thì những cá thể đồng hợp tử mang kiểu gen AA, aa, a’a’ có một băng, còn cá thể dị hợp tử Aa, Aa’ và aa’ có biểu hiện bởi hai băng (hình 7.15b)

c Trong trường hợp phân tử enzym là dimer thì mỗi locut sẽ liên quan tới hai sợi polypeptide, giả sử có hai alen A và a, mỗi alen m• cho một chuỗi polypeptide, sự phân ly của kết quả điện di được minh họa trong hình 7.15c

Trong hình 7.15 ta thấy cá thể dị hợp tử (Aa) mang 3 băng, trong đó có một băng là biểu hiện của mức di truyền trung gian, là kết quả của sự kết hợp giữa hai chuỗi polypeptide do hai alen khác nhau của một locut gen kiểm soát

d Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc tetramer, nghĩa là phân tử này do 4 chuỗi polypeptide tạo thành Trong trường hợp này các cá thể đồng hợp tử biểu hiện một băng, còn

cá thể dị hợp tử biểu hiện 5 băng trên điện di đồ Ta đặt giả thiết alen A tổng hợp chuỗi polypeptide a và gen a tổng hợp chuỗi polypeptide b, cá thể lai biểu hiện 5 băng tương ứng (hình 7.15d)

Trong một số trường hợp phân tử enzym do một locut gen có hai alen kiểm soát trong đó

có một alen có hoạt tính và biểu hiện màu còn alen thứ hai không biểu hiện màu gọi là alen không (null allele) thì trên điện di đồ sẽ có 3 dạng kiểu hình, một dạng biểu hiện một băng nhuộm màu rõ nét, một dạng không biểu hiện là các cá thể đồng hợp tử, còn dạng có băng nhạt màu và mảnh là các cá thể dị hợp tử (hình 7.16)

7.5.2.3 Tính tần số alen

Sau khi xác định sự biểu hiện của các alen ta sẽ phân tích tần số của chúng trong đối tượng nghiên cứu theo các công thức sau:

Khi số alen là 2 (A, a), tần số xuất hiện

Với AA, Aa, aa là số cá thể mang kiểu gen tương

ứng, N là số cá thể mang phân tích * 25 và đảm bảo

thỏa m•n hệ số *2

Khi số alen là 3 (A, a, a1), tần số xuất hiện cũng

được tính tương tự

Tính hệ số tương đồng di truyền I hay khoảng cách

di truyền D:

Theo tác giả Nei hệ số tương đồng di truyền được

tính như sau:

trong đó:

XA ,YB là các tần số của alen tương ứng

Ví dụ: Quần thể muỗi QTx có:

Tần số A = 0,46 Tần số alen a= 0,54

Quần thể muỗi QTx có:

Tần số alen A= 0,88 Tần số alen =

0,12

Từ đó ta tính được :

Mức độ giống nhau về mặt di truyền là: 0,745

Từ hệ số tương đồng trên, khoảng cách di truyền D

được tính theo công thức:

7.5.2.4 Lập cây chủng loại phát sinh dựa trên

hệ số tương đồng I

Là phương pháp tính toán mối quan hệ huyết thống

của các nhóm tham gia quá trình phân loại Từ giá trị I

thu được của các nhóm khác nhau người ta lập bảng

và xây dựng cây chủng loại phát sinh

Nếu I >

0,5 thì các nhóm nghiên cứu thuộc về một loài, sự khác biệt của hệ Izozym chỉ mang ý nghĩa biến dị trong loài

Nếu I<0,5 thì có thể sơ bộ kết luận đó là hai loài riêng biệt

Ví dụ: Có 5 loài ký hiệu là L1, L2, L3, L4, L5

Có hệ số I giữa 2 loài

Quy thành nhóm như sau:

Tr−êng hîp a

AA Aa’ a’a’ Aa a’a aa

Tr−êng hîp b

Tr−êng hîp c

Tr−êng hîp d

Hình 7.15 Sơ đồ kết quả điện di

Hình 7.16

Sơ đồ kết quả điện di alen không

L4 0,53

Ở đây ta thấy giữa L2 L3 có số lớn nhất (0,83) - có quan hệ gần nhất được quy thành 1 nhóm:

Để tìm tiếp mối quan hệ giữa L4/5 và L1/2/3 ta cần nhóm tiếp như sau:

L4/5

L2/3 0,05 → 0,18

Cây chủng loại phát sinh của 5 loài trên được lập như sau:

7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN

Từ thập kỷ tám mươi của thế kỷ XIX việc phát triển các chỉ thị ADN hay còn gọi là dấu phân tử đã được tiến hành Đó là các chỉ thị về đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP, Botstein và cs, 1980); Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam và cs.1990); Tiểu vệ tinh (microsatellite, Litt và Luty, 1989) hay còn gọi là sự lặp lại các chuỗi đơn giản (SSR, Jacob và cs, 1991) và đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP, Zabeau và Vos, 1993)

7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR

Nguyên lý: dùng một đoạn gen hay mẫu rất nhỏ ADN rồi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân lên gấp bội dùng trong nghiên cứu

Các nguyên liệu cần thiết:

* ADN đích hay ADN khuôn

* ADN polymerase bền nhiệt (Taq, Vent, Pfu…)

* Một hay nhiều đoạn mồi (primer) nghèo nucleotid

* Bốn loại Didesoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

* Đệm phản ứng chứa MgCl2

Các bước tiến hành: Mỗi một chu kỳ tiến hành theo 3 bước sau:

* Biến tính: dùng nhiệt độ 90 - 95oC trong 30 giây đến vài phút để tách ADN khuôn thành 2 sợi đơn

* Lai hay bắt cặp mồi: nhiệt độ hạ xuống 50 - 70oC trong 30 giây đến vài phút để cho các mồi nghèo nucleotid bắt cặp với các sợi đơn tại các trình tự bổ sung

* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 30 giây đến vài phút để cho ADN polymerase bền nhiệt tổng hợp sợi mới theo nguyên tắc bổ sung

Chu kỳ thường được lặp lại 25 - 30 lần và lúc đó số lượng sẽ tăng lên 106 lần số lượng ban đầu

Từ phương pháp này người ta đã bổ sung, cải tiến tạo ra nhiều phương pháp khác nhau gọi

là các dấu hiệu chỉ thị (marker)

7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP

Đây là kỹ thuật sử dụng các enzym cắt hạn chế, cắt ADN thành các đoạn nhỏ có độ dài khác nhau Khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh với một đoạn dò RFLP thì có thể có sự khác nhau về độ dài các đoạn cắt Sự khác nhau này gọi là sự đa hình Các đoạn này có thể di truyền và được sử dụng như các dấu phân tử Dựa trên số đoạn ADN tương đồng của các băng điện di để xác định sự giống nhau hay mối quan hệ họ hàng gần gũi

Phương pháp tiến hành:

* Tách ADN

* Cắt ADN thành những đoạn nhỏ nhờ các enzym giới hạn

* Phân tích các đoạn ADN bằng điện di trên gel

* Chuyển các đoạn ADN sang một màng lọc

* Hiển thị các đoạn ADN bằng công cụ thăm dò hay đánh dấu phóng xạ

* Phân tích các kết quả

Thuận lợi của phương pháp này: kết quả có khả năng thực hiện giữ ở các phòng thí nghiệm; các chỉ thị RFLP thường chỉ ra sự kế thừa tương đồng của các dị hợp tử có thể nhận

ra từ đồng hợp tử; có khả năng phân biệt ở mức độ loài, quần thể hay cá thể và phương pháp đơn giản

Tuy nhiên áp dụng phương pháp này có một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, chi phí cao; hầu hết công việc phân tích cần đến đánh dấu phóng xạ nên bị phụ thuộc nơi tiến hành công việc

7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD

Phương pháp này dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một hay hai đoạn mồi tự ý ngắn 6-10 bazơ để nhân một đoạn ADN gi•n xoắn nào đó và có thể phân tách và hiển thị bằng điện di trên gel

Quá trình được thực hiện trên máy PCR, PTC-100 (MJ Research Inc Mỹ) Các phản ứng được thực hiện trong thể tích 25 *l chứa 10 - 25 ng ADN genom, 2,5 *l đệm PCR có nồng độ gấp 10 lần (đệm PCR x 10), 0,2 mM mồi, 200 mM dNTP, 1,5mM MgCl2 và 0,5 đơn vị Taq ADN polymerase

Phản ứng được thực hiện theo 3 bước:

* Biến tính ADN ở 94oC trong 1 - 3 phút

* Lai: hạ nhiệt xuống 35oC trong 1 phút

* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 2 - 5 phút

Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng điện di trên gen agaroza 1% Kết quả cho các băn khác nhau Từ đó tiến hành đánh giá mối quan hệ của hai taxôn nào đó

Kỹ thuật này có ưu điểm là phát hiện nhanh chóng các dấu hiệu; kỹ thuật đơn giản, không liên quan đến phương pháp lai và chụp ảnh phóng xạ; chỉ cần một lượng cực nhỏ ADN và chi phí thấp

7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP

Kỹ thuật AFLP là kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và nhân đoạn PCR được tiến hành theo các bước sau:

* Cắt ADN genom bằng enzim cắt giới hạn EcoR1 và Msel: Để làm việc này, lấy 0,3

mg ADN ủ 2 giờ ở 37oC với 3 đơn vị EcoR1 and 3 đơn vị Msel, 6 ml dung dịch điện có nồng

độ gấp 5 lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc)

* Gắn các đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau khi cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng để gắn (1ml đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) và 1 ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM ATP, 1ml T4 ADN ligase và 4 ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN đã được cắt Phản ứng gắn được thực hiện ở 20oC trong 3 giờ Sau khi gắn các tiếp hợp, ADN được làm lo•ng

10 lần và giữ ở -20oC

* Nhân đoạn bước đầu: Trước khi nhân chọn lọc các đoạn ADN đã gắn các tiếp hợp được nhân bước đầu với các mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) và Msel (5’GATGAGTCCTGAGTAA3’) Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN đã gắn tiếp hợp và pha lo•ng 10 lần và 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100 ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2

ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml 5 đơn vị/ml Taq ADN polymerase, và 18,3 ml nước cất vô trùng) Phản ứng nhân được thực hiện bằng 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 30 giây ở 94oC, 1 phút ở 56oC, 1 phút ở 72oC

* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc các đoạn ADN đã được gắn tiếp hợp và nhân bước đầu được tiến hành với việc sử dụng các mồi có 2 hoặc 3 nucleotide chọn lọc

Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung là 5GACTGCGTACCAATT3’ còn các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung là 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’ Các mồi chọn lọc khác nhau ở chỗ ngoài chuỗi nucleotide chung chúng có từ 1 đến 3 nucleotide chọn lọc Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC

Nhân chọn lọc được thực hiện trong 12ml dung dịch gồm 6 ml hỗn hợp phản ứng (1,25 ml

10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml 5 mM dNTP, 0,5 ml mỗi loại mồi chọn lọc, 0,1

ml 5 đơn vị Taq ADN polymerase và 3 ml nước cất vô trùng) Phản ứng nhân chọn lọc được thực hiện bằng 36 chu kỳ như sau: 1 chu kỳ gồm gi•n xoắn ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 65oC trong 1 phút và kéo dài mồi ở 72oC trong 2 phút; tiếp theo là 12 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi giảm 0,7oC sau mỗi chu kỳ; cuối cùng là 23 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi là 56oC

Các sản phẩm nhân chọn lọc được phân lập bằng điện di trên gel polyacrylamide biến tính 5% Điện di được tiến hành với dòng điện công suất ổn định 75W trong 2 giờ Sau điện di gel được nhuộm bằng nitrate bạc

Ưu điểm của kỹ thuật này là: Độ nhạy cao; tái thực hiện; ứng dụng rộng r•i; phân biệt được

dị hợp tử Tuy nhiên có một số hạn chế: chi phí cao; yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt và phải sử dụng chất phóng xạ

7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số

lượng các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR

Kỹ thuật SSR được thực hiện bằng phản ứng PCR của ADN genom với các mồi SSR Các chuỗi lặp lại này thường có một đến sáu nucleotid SSR được khám phá và sử dụng đầu tiên ở người, hiện nay được dùng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực vật SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật, cũng như mối quan hệ giữa các quần thể và cá thể trong loài Các alen SSR thường hơn kém nhau một số nucleotit xác định nên có thể điện di đồng thời sản phẩm nhân bản bốn locut trong cùng một đường chạy, nhờ đó tiết kiệm thời gian và chi phí

Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, có tính lặp lại cao… Đây là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu mối quan hệ huyết thống

Chương 8

Nguồn gốc và phân loại Cây Có hoa (Anthophyta) hay cây Hạt kín (Angiospermae)

− Những tính chất cây có hoa:

− Có mạch gỗ điển hình

− Yếu tố rây và các tế bào kèm trong phloem

− Túi phôi tám nhân

− Thụ tinh kép

− Noãn đóng kín

− Nội nhũ 3n

Mạch gỗ không phải chỉ có ở tất cả Angiospermae mà có một vài cây có hoa không có mạch gỗ Túi phôi tám nhân Thế hệ thể giao tử thường đơn giản hóa hơn và tiêu giảm hơn so với cây Hạt trần Thể giao tử đực cái ở có hoa thường bé và rất hiệu quả với sự phân chia tế bào tương đối ít Cây có hoa có thụ tinh kép tức là một tinh tử kết hợp với nhân của trứng cho ra hợp tử 2n và hợp tử hình thành phôi; một tinh tử khác kết hợp với hai nhân trung tâm (nhân thứ cấp) trong túi phôi và cho ra nội

nhũ 3n, tức là mô dinh dưỡng của hạt Sự thụ tinh kép như thế là đặc trưng riêng của cây có hoa mà

không có nhóm nào có Trong cây có hoa các lá bào tử lớn chuyên hóa mạnh (lá noãn) nó bao lấy noãn sau đó noãn phát triển thành hạt Đây là nét độc đáo: hạt được bao kín và vì thế có tên là cây Hạt kín Hạt phấn dính và nảy mầm trên bề mặt đầu nhụy tạo thành ống phấn và ống phấn đã mang nhân tinh trùng tới nhân trứng nằm trong túi phôi của noãn Trái lại, ở Hạt trần hạt phấn nảy mầm ngay lỗ noãn

và trực tiếp kết hợp với noãn mà không phải nảy mầm trên đầu nhụy Đó là sự khác biệt và đặc điểm

quan trọng của nhóm cây có hoa Nhiều tính chất sinh sản độc đáo của cây có hoa bao gồm chu trình

sống rút ngắn và hữu hiệu có thể đã đóng góp cho những thắng lợi trong giới thực vật

Cây có hoa có một số tính chất chung:

Vị trí tương đối của nhị và lá noãn không thay đổi;

Vị trí lá noãn luôn luôn ở cao nhất trên trục hoa;

Cách sắp xếp của hoa gồm lá đài, cánh tràng, bộ nhị và bộ nhụy không thay đổi trong toàn bộ cây

có hoa;

Cấu trúc của một nhị là ổn định với 4 ô trong hai cặp;

Hạt phấn một rãnh trong một số Hai lá mầm và toàn bộ Một lá mầm là giống nhau;

Mạch gỗ và ống rây giúp cho cây có hoa vận chuyển có hiệu quả cao để thích nghi với các vùng khô hạn;

Hệ gân tự do giúp cho mở rộng bề mặt quang hợp của lá Đó là những lý do giúp cho cây có hoa thống trị trên Trái Đất

Cây có hoa là một nhóm tự nhiên có những tính chất chung làm cho nó có tính độc đáo so với các thực vật có mạch khác (Cronquist, 1968, 1981 ; Stebbins, 1974; Takhtajan, 1969 - 1987) Những tính chất chung đó làm cho cây có hoa được coi như là có nguồn gốc đơn nguyên có nghĩa là cây có