Đang tải... (xem toàn văn)
Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.Những khả năng[r]
(1)LỜI MỞ ĐẦU
Từ lâu, người biêt nhân giống trồng nhiều biện pháp Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp nhánh để trồng ,gọi giâm cành ,chiết cành…Hay chắp nối thân với thân cách ghép cành Những ưu điểm vượt trội ứng dụng rộng rãi Cùng lúc nhân giống lên hang lọt mà không nhiều thời gian để gieo hạt ,chờ cho lớn Bên cạnh người ta lại có cơng nghệ đại hơn, gọi công nghệ nuôi cấy mô tế bào Cùng với phát triển khoa hoc kỹ thuật, công nghệ ứng dụng rộng rãi trồng…Cùng lúc tạo hang vạn trồng mới, nhanh chống mà không thiết phải từ hạt mà lấy mơ bào , trừ mơ tế bào hố gỗ Tuy nhiên cơng nghệ địi hỏi tốn kém, kiên nhẫn khéo léo
CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I.CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trình điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vơ trùng)một cách có định hướng vào phân hoá phản phân hoá tế bào sở tính tồn tế bào thực vật
1.1 Tính tồn tế bào:
Tế bào thể sinh vật đa bào có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi.Đó tính tồn tế bào
(Theo Gottlied Haberlandt “Thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào tách rời” ) 1.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào:
Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều quan có chức khác hình thành từ nhiều loại tế bào Tất cr tế bào bắt nguồn từ tế bào ban đầu (tế bào hợp tử).Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức riêng biệt(chun hố).Sau ,các tế bào phơi sinh tiếp tục biến đổi thành tế bào chun hố đặc hiệu cho mơ ,cơ quan khác nhau.Đó phân hố
Tuy nhiên ,khi tế bào phân hố thành tế bào có chức chun biệt, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi mình.Trong điều kiện thích hợp chúng trở dạng tế bào phơi sinh phân chia mạnh mẽ Qúa trình gọi q trình phản phân hố tế bào
1.3 Mơi trường dinh dưỡng :
Là nhân tố quan trọng định thành cơng q trình ni cấy Hầu hết môi trường dinh dưỡng nhân tạo sử dụng để nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm thành phần sau:
(2)Bảng Thành Phần Một Số Môi Trường Thông Dụng
Thành phần Môi trường
(Mg/l) Murashige
Skoog (MS)
Gamborg (B5) Woody plant medium (WPM)
Nitsch Nitsch Khoáng đa
lượng
NH4NO3 1650 - 400
-NH4SO4 - 134 -
-CaCl2.2H2O 332,2 150 96 166
Ca(NO3)2.4H2O - - 556
-MgSO4.7H2O 370 250 370 185
KNO3 1900 2500 - 950
K2SO4 - - 990
-KH2PO4 170 - 170 68
NaH2PO4 - 130,5 -
-Khoáng vi lượng
H3PO3 6,2 3,0 6,2 10
CoCl2.6H2O 0,025 0,025 -
-CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,25 0,025
Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 37,3
FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8
MnSO4.H2O 16,9 10,0 22,3 18,9
KI 0,83 0,75 -
-Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 0,25
ZnSO4.7H2O 8,6 2,0 8,6 10
Chất hữư
Myo-inositol 100 100 100 100
Glycine 2,0 - 2,0 2,0
Acid nicotinic 0,5 1,0 0,5
B1 0,5 0,1 0,5 0,5
B6 0,1 10,0 1,0 0,5
Các chất điều hồ sinh trưởng Ví dụ auxin,cytokinin… 1.4 pH môi trường 1.5 Vô trùng mẫu cấy II NHÂN GIỐNG INVITRO
2.1 Ý nghĩa nhân giống in vitro
+Sử dụng mơ ni cấy có kích thước nhỏ
(3)+nhân nhanh với hiệu qủa kinh tế cao …
2.2 Các phương thức nhân giống in vitro
- Tái sinh từ cấu trúc sinh dưỡng - Nhân giống thong qua mô sẹo (callus)
Nuôi cấy mô không tái sinh mà phát triển thành khối mô sẹo - Nhân giống thơng qua phát sinh phơi vơ tính-Cơng nghệ hạt nhân tạo - Nhân giống nồi phản ứng sinh học
SƠ ĐỒ CÁC PHƯƠNG THIỨC TẠO CÂY HOÀN CHỈNH TRONG NHÂN GIỐNG IN VITRO:
III.CÁC GIAI ĐOẠN TRONG Q TRÌNH NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH IN VITRO
3.1 Giai đoạn 1- Cấy khởi đầu: - lựa chọn mẫu
Hầu hết quan hay phận như:chồi ,phiến lá… Mẫu phải mầm bệnh,cây mẹ khoẻ mạnh,không bị bệnh
Tuỳ vào trạng thái sinh lý tuổi mẫu -Ni cấy khởi động
Đưa mẫu từ ngồi mơi trường vào phải đảm bảo yêu cầu sau: + Tỷ lệ nhiễm thấp
+ Tỷ lệ sống cao
+ Tốc độ sinh trưởng nhanh 3.2 Giai đoạn 2- Nhân nhanh:
chồi
Nuôi cấy quan
Nuôi cấy callus
chồi
callus Cây trưởng
thành
tế bào đơn
tế bào đơn phôi
callus Nuôi cấy phôi
cây chồi ,cụm
(4)Ở giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo quan phụ cấu trúc khác mà từ hồn chỉnh phát sinh.Những khả tạo là:
+ Phát triển chồi nách + Tạo phôi vô tính
+ Tạo đỉnh sinh trưởng
- Bổ sung tổ họp hormone sinh trưởng mới:tăng cytokinin giảm auxin Tỷ lệ auxin/cytokinin<1 tăng cường trình tạo chồi
Tỷ lệ auxin/cytokinin =1cân hai trình tạo rễ chồi Tỷ lệ auxin/cytokinin > tăng cường trình tạo rễ
- Bảo đảm chế độ nhiệt 20-270c
Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp lý ,bởi số lần cấy chuyền lớn dẫn tới tượng bị thối hố sinh trưởng ,có thể đặc tính ban đầu bố mẹ
3.3 Giai đoạn 3- Tạo rễ:
Giai đoạn bao gồm trình kéo dài chồi để tạo kích thước thích hợp tạo rễ,tức q trình tạo hồn chỉnh.Mơi trường lúc khơng cần bổ sung cytokinin mà bổ sung auxin.Nồng độ auxin tối ưu xác định dựa tỷ lệ tạo rễ ,số lượng rễ chiều dài rễ
3.4 Giai đoạn 4- Đưa đất:
Đây giai đoạn quan trọng bao gồm công việc huấn luyện in vitro thích nghi với điều kiện khí hậu thay đổi :nhiệt độ ,ánh sang, độ ẩm…và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hồn tồn Qúa trình thích nghi phải hiểu trình thay đổi đặc diểm sinh lý, giải phẫu, than Thời gian tối thiểu cho thích nghi 2-3 tuần Trong thời gian phải bảo vệ trước yếu tố bất lợi như:
+Mất nước nhanh làm cho bị héo khô
+Nhiễm vi khuẩn nấm làm cho bị héo khô +Cháy nắng
IV.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CƠNG TRONG NI CẤY - Đảm bảo điều kiện vơ trùng
- Chọn môi trường chuẩn bị môi trường cách - Chọn mô cấy, xử lý mơ cấy thích hợp trước sau cấy 4.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng:
Ý nghĩa:
Mơi trường ni cấy có chứa đường, muối, khống…rất thích hợp cho loại nấm vi khuẩn phát triển.Với tốc độ phát triển nhanh nhiều lần so với tế bào thực vật nên môi trường bị nhiễm sau vài ngày đến tuần ,tồn bề mặt nuôi cấy phủ đầy vi khuẩn nấm, mô nuôi cấy không phát triển chết dần Vô trùng nguồn tạp chất:
- dụng cụ thuỷ tinh :rửa sấy 1600c/1 (trừ loại dung để đo thể tích) - Nút đậy: bong không thấm nước Nút phải tương đối chặt để bụi không qua
được nước khơng bay đựơc q trình ni cấy
- Mơ ni cấy :dung chất hố học có hoạt tính diệt nấm khuẩn, - Vơ trùng nơi thao tác tủ cấy
(5)4.3 Chọn mô cấy xử lý mô cấy: Tuỳ loại mà chọn mơ thích hợp
Thong thường mơ thể thực vật dung làm mơ cấy,trừ mơ hố gỗ
Tuy vậy, để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vơ tính định trước tiên người ta ý đến chồi nách mô phân sinh
KỸ THUẬT THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY HOA CÚC VÀ HOA LAN
I.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
1 Pha dung dịch mẹ:
Ký hiệu Thành phần nồng độ (mg/l) Dung dịch stock(mg/l)
số ml dung dịch cần thiết để pha 500 ml môi trường nuôi cấy
KNO3 1900 38.000
KH2PO4 170 3.400 25ml
MS1( 20X) NH4NO3 1650 3.300
MgSO4.7H2O 370 7.400
MS2( 20X) CaCl2.2H2O 440 8.800 25ml
H3PO3 6.2 1240
MnSO4.4H2O 22.3 4460
MS3(200X) CoCl2.6H2O 0.025
CuSO4 0.025 2.5ml
ZnSO4 8.6 1720
Na2MoO4.2H2O 0.025
KI 0.83 166
MS4(40X) FeSO4.7H2O 27.8 1112 12.5ml
Na2-EDTA 37.3 1492
(100X) Myo-inositol 100 10.000 5ml
B1 0.1 10.000
MS5 B6 0.5 20 2.5ml
Acide nicotinic 0.5 100
Glycine 400
Sau cân hoá chất xong cho vào lọ thuỷ tinh cho 500 ml nước cất vào ,đặt lên máy khuấy tan đổ vào bình có ghi tên loại dung dịch
(6)MS1 50ml
MS2 50ml
MS3 5ml
MS4 25ml
Myo-inositol 10ml
MS5 5ml
Đường saccarozo 30g/lít
nước dừa 100ml
BAP 2ml
NAA 0,5ml
Agar 6,5-7g/lít
Sau cho nước cất vào đầy lít dung dịch, đo độ pH cho thích hợp cho vào nồi khuấy máy khuấy, đem đun sôi, rót vào chai thuỷ tinh, dung nút bong đậy lại mặt có giấy bảo vệ khử trùng , sau đem hấp
II.CHUẨN BỊ MẪU CẤY 1.Mẫu hoa cúc :
Cúc nuôi cấy từ tràng hoa
- lựa chọn cúc to khẻo ,không bị bệnh
- Tách tràng hoa ,có thể để lại lớp ngồi
- rửa nước xà phịng lỗng, sau rửa lại nước - lần cuối lấy nước cất tráng lại
- khử trùng cồn 700 30 giây.
- khử trùng nước Javen NaOCl với tỷ lệ NaOCl : H2O 15 phút - rửa lại nước vô trùng
2 Mẫu phong lan:
Các đỉnh sinh trưởng phong lan
- lựa chọn loại khả sinh trưởng, không già - Dung tay để cọ rửa kỹ chọn
- cắt ngắn đoạn để lại khoảng giao hai đốt, nơi mà chồi non phát triển
- thao tác sau giống Nhưng tỷ lệ NaOCl : H2O là: 1: III.QUY TRÌNH CẤY MẪU:
1 Các thao tác phịng thí nghiệm trước cấy mẫu:
- Khử trùng tủ cấy tia cực tím 20-30 phút Lau chùi cồn 700 Bật đèn máy khử trùng lên
- Khử trùng dụng cụ cấy cách đốt cồn 900 - Khử trùng tay cồn 700 vào buồng cấy.
- Khử trùng dụng cụ chứa mơi trưịng nuôi cấy cách xịt cồn vào ,lau đưa vào cấy mẫu hơ lửa đèn cồn
2 Cấy mẫu : Chú ý :
Khi cấy không chạm tay vào mặt bàn cấy Tay phải nghiêng
(7)a) Mẫu cúc:
Gắp mẫu que gắp ,đặt lên giấy (đã khử trùng)
Dùng dao cắt bỏ hai đầu lấy phần cuống tràng hoa (phần có màu xanh) Dùng que gắp cấy vào môi trường Mỗi lọ môi trường cấy khoảng mẫu.(giàn trải mẫu môi trường)
b) Mẫu phong lan:
Gắp mẫu đặt lên giấy cấy
Dùng dao cắt bỏ hai bên mơ sinh trưởng ,kích trước khoảng<=1cm.Dung dao bốc lớp vỏ bao đỉnh
Cấy vào môi trường ,sao cho mẫu nghiêng ,gốc chỉa xuống môi trường đỉnh sinh trưởng phía khơng gian trống
IV CẤY CHUYỂN
Thao tác khử trùng cấy giống trên.Nhưng cấy chuyển,nguyên liệu : mẫu phát triển thành dạng non.Vì cần đòi hỏi thao tác nhẹ nhàng khéo léo
- Dùng que lấy mẫu khỏi lọ môi trường cũ Đặt lên giấy cấy - Dùng dao cắt, chia ra, giữ nguyên
-Đưa vào môi trường nuôi cấy
Chú ý mật độ không dày ,khoảng 4-5 lọ mơi trường V.CHUYỂN RA NGỒI MƠI TRƯỜNG ĐẤT
Như biết ,cây từ môi trường nuôi cấy ban đầu mà chuyển mơi trường đất khó khăn
Thứ thay đổi môi trường sống , môi trường dinh dưỡng , Thứ hai phải chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng Khi đuợc khoảng – mầm đưa môi trường 1.Chuẩn bị môi trường đất:
Cây cấy ngồi mơi trường hoa chuông - lấy từ lọ đủ tiêu chuẩn cấy
- Rửa nước ,sao cho hết phần thạch ,không cho dính lại dù nhỏ - Phân loại thành dạng ghi rõ lọ cấy
- Nhúng dung dịch chống nấm ,rồi vớt
+ Đất lấy đất cát nhỏ, không lẫn hạt sạn lớn + Được trải sọt lớp khoảng 4-5cm
+ Phun nước vừa ướt đất Cấy cây:
Tất thao tác dùng găng tay
Dùng que chọc lỗ lớp đất vừa chuẩn bị, đặt cât xuống lắp lớp đất lại Đưa vào mơi trường chăm sóc:
(8)KẾT LUẬN