Thực hành nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Header Page of 166 150 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Footer Page of 166 Header Page of 166 151 MỤC LỤC Bài Mở đầu 154 I Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật 154 II Các nhân tố đảm bảo thành công nuôi cấy mô-tế bào thực vật 158 Bài Môi trường dinh dưỡng 175 I Thành phần chính của môi trường 177 II Vấn đề lựa chọn môi trường 188 III Chuẩn bị các dung dịch làm việc 189 Bài Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 202 I Mục đích và yêu cầu 203 II Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 204 III Phương pháp tiến hành 206 Bài Nuôi cấy đơn bội in vitro 213 Footer Page of 166 Header Page of 166 152 I Mục đích và yêu cầu 213 II Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 215 III Phương pháp tiến hành 217 Bài Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù 223 I Mục đích và yêu cầu 223 II Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 226 III Phương pháp tiến hành 228 Bài Nuôi cấy protoplast 233 I Mục đích và yêu cầu 233 II Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 235 III Phương pháp tiến hành 237 Bài Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 243 I Mục đích và yêu cầu 243 Footer Page of 166 Header Page of 166 153 II Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 244 III Phương pháp tiến hành 247 TÀI LIỆU ĐỌC THÊM 256 Footer Page of 166 Header Page of 166 154 Bài Mở đầu I Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật (ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu) Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước lần (8 L/giờ) + Máy cất nước lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) Footer Page of 166 Header Page of 166 155 - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L) Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân kỹ thuật 10-2g + Bếp điện - Microwave + Tủ lạnh 100-200 L - Tủ lạnh sâu (-20  -80oC) Phòng cấy vô trùng + Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench) + Quạt thông gió Footer Page of 166 Header Page of 166 156 + Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m) - Thiết bị lọc không khí Phòng ảnh - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu Phòng kính hiển vi + Kính hiển vi mắt (độ phóng đại 1000 lần) + Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số + Kính lúp mắt (độ phóng đại 75 lần) - Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học - Kính hiển vi huỳnh quang Footer Page of 166 Header Page of 166 157 Phòng nuôi + Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux + Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút) + Tủ ấm - Nồi phản ứng sinh học (bioreactor) Phòng sinh hóa + Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng ) + Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide) + Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA protein (Gene documentation system) + Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm Footer Page of 166 Header Page of 166 158 - Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tế bào và mô nuôi cấy II Các nhân tố đảm bảo thành công nuôi cấy môtế bào thực vật Có nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau cấy Bảo đảm điều kiện vô trùng 1.1 Ý nghĩa của vô trùng nuôi cấy mô và tế bào thực vật Footer Page of 166 Header Page 10 of 166 159 Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn rất nhiều so với các tế bào thực vật, nếu môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn Thí nghiệm phải bỏ vì điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc một vài ngày Nói cách khác, mức độ vô trùng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc, điều kiện này đặc biệt quan trọng nuôi cấy các tế bào đơn thực vật các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công được 1.2 Nguồn nhiễm tạp Footer Page 10 of 166 Header Page 94 of 166 243 Bài Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens I Mục đích và yêu cầu Các thực vật chuyển gen đã được tạo bằng nhiều kỹ thuật khác Có hai phương thức chính: Footer Page 94 of 166 Header Page 95 of 166 244 - Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điện, vi tiêm, siêu âm, silicon carbide, thông qua ống phấn, điện di - Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vật): Agrobacterium tumefaciens Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém cả là chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm có đất, thường được sử dụng để tiến hành biến nạp di truyền đối tượng thực vật Đoạn DNA muốn chuyển vào một nào đó có thể được thao tác dễ dàng E coli và sau đó chuyển trở lại vào Agrobacterium Việc chuyển gen vào thực vật qua Agrobacterium đã thực hiện thành công nhiều loại cây: thuốc lá, đậu tương, các họ đậu nhiệt đới, cải, khoai tây II Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Dụng cụ - Bình tam giác (250 mL), ống nghiệm có nắp vặn Footer Page 95 of 166 Header Page 96 of 166 245 - Giấy thấm vô trùng - Forceps, kéo, dao mổ - Que cấy vi sinh - Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng - Giấy parafilm - Giấy nhôm - Tube eppendorf (1,5-2 mL) - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette Thiết bị - Nồi khử trùng - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh Footer Page 96 of 166 Header Page 97 of 166 246 - Microwave - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Máy cất nước lần - Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 mL Hóa chất - Môi trường bản MS - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB - Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và cefotaxim - Agar - MgSO4 10mM - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: NAA và BAP Footer Page 97 of 166 Header Page 98 of 166 247 - Cồn 90% - Nước cất vô trùng III Phương pháp tiến hành Nguyên liệu - E coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper plasmid) - E coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+ insert DNA (gen ngoại lai mang tính trạng mong muốn) - Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404 - Cây thuốc lá in vitro Chuẩn bị môi trường 2.1 Môi trường LB - Bacto-tryptone Footer Page 98 of 166 3g Header Page 99 of 166 248 - Yeast-Extract 1,5 g - NaCl 3g - Nước cất đến đủ 300mL 2.2 Môi trường LB đặc Môi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL 2.3 Môi trường LB-R Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin 2.4 Môi trường LB-K Môi trường LB bổ sung 50 µg/mL kanamycin 2.5 Môi trường LB-RK Footer Page 99 of 166 Header Page 100 of 166 249 Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin và 50 µg/mL kanamycin 2.6 Môi trường MSO - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose % - pHmôi trường ~ 5,8 2.7 Môi trường nuôi cấy (MS 104) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose % - BAP mg/mL Footer Page 100 of 166 Header Page 101 of 166 250 - NAA 0,2 mg/mL - pHmôi trường ~ 5,8 2.8 Môi trường chọn lọc (MS SEL) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose % - BAP mg/mL - NAA 0,2 mg/mL - Kanamycin 1,5 mL - Cefotaxim mL - pHmôi trường ~ 5,8 2.9 Môi trường tạo rễ (MSR) Footer Page 101 of 166 Header Page 102 of 166 251 - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose % - Kanamyin 1,5 mL - Cefotaxim mL - pHmôi trường ~ 5,8 Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản điều kiện không có ánh sáng Chất kháng sinh được bổ sung sau đã khử trùng môi trường (để nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-60oC) điều kiện vô trùng của laminar Tiến hành 3.1 Triparental mating (giao phối bộ ba) Footer Page 102 of 166 Header Page 103 of 166 252 a Nuôi cấy vi khuẩn Các môi trường LB lỏng được chuẩn bị các ống nghiệm có nắp vặn, khử trùng để tiến hành nuôi cấy các vi khuẩn Các bước sau:  Nuôi A tumenfaciens môi trường LB-R tổi, 28oC, thời gian 48 giờ (nuôi trước tiến hành triparental mating ngày)  Nuôi E coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E coli có mang vector pBI 121 + insert DNA môi trường LB-K (nuôi trước tiến hành lai bộ ba ngày) b Nuôi cấy chung loại vi khuẩn Các bước tiến hành:  Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn mL, ly tâm tốc độ khoảng 10.000 rpm, giây  Loại bỏ thể nổi, thêm mL môi trường LB, lắc nhẹ để trộn (để loại bỏ chất kháng sinh) Footer Page 103 of 166 Header Page 104 of 166 253  Lập lại bước lần Thêm 300 µl môi trường LB  loại vi khuẩn được cấy lên mặt đĩa chứa môi trường LB đặc (đã được chuẩn bị trước các đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất kháng sinh, mỗi loại vi khuẩn lấy 100 µl Dàn đều bề mặt môi trường đến khô hoàn toàn Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28oC, đến các “thảm” vi khuẩn được hình thành c Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trộn loại vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinh Các bước tiến hành:  Lấy mL MgSO4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một ít vi khuẩn “thảm” đã nuôi cấy cho vào để có một dịch lỏng  Chuẩn bị tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube 900 µL MgSO4 10 mM Footer Page 104 of 166 Header Page 105 of 166 254  Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ pha loãng: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4  Lấy 100 µl mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ sung % agar  Nuôi 2-3 ngày tại 26-28oC điều kiện tối để phát triển khuẩn lạc  Nuôi cấy khuẩn lạc mL môi trường LB-RK tại 26-28oC từ 1-2 ngày để thu được sinh khối E coli, xác định Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào 15% glycerin và bảo quản -70oC) 3.2 Chuyển gen vào thuốc lá thông qua Agrobacterium Các bước tiến hành:  Lấy khuẩn lạc cấy chuyển vào mL môi trường LB-K lỏng, nuôi cấy lắc điều kiện tối, nhiệt độ từ 2728oC 2-3 ngày Footer Page 105 of 166 Header Page 106 of 166 255  Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy bằng cách cho môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạc vào tube eppendorf, ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc độ 12.000 rpm Lặp lại nhiều lần  Loại bỏ môi trường LB phía trên, các tế bào thu được hòa tan mL môi trường MSO lỏng  Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO đĩa petri  Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước ước chừng khoảng 0,5-0,7 cm  0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân lá), chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO  Tế bào Agrobacterium hòa mL môi trường MSO được cấy chuyển sang môi trường MSO có chứa các mảnh lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ 10 phút  Sau đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách chuyển chúng lên giấy lọc vô trùng 0,5-1 phút Các mảnh lá đó được nuôi môi trường nuôi cấy (MS 104) ngày tối Footer Page 106 of 166 Header Page 107 of 166 256  Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy tuần để tái sinh chồi điều kiện chiếu sáng  Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường MSR để tạo rễ Các hoàn chỉnh được chuyển sang nuôi cấy các bình Các này là các đã được tiến hành chuyển gen Để biết việc chuyển gen có thành công hay không cần phải tiến hành các thí nghiệm kiểm tra (tách chiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với cặp primer đặc hiệu cho insert DNA và điện di sản phẩm PCR agarose gel %) TÀI LIỆU ĐỌC THÊM - Murashige T and Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15:473-497 Footer Page 107 of 166 Header Page 108 of 166 257 - Nistch JP and Nistch C 1969 Haploid plants from pollen grains Science 163:85-87 - Trigiano RN and Gray DJ 2000 Plant tissue culture concepts and laboratory exercises - Street HE 1977 Plant tissue and cell culture Blackwell Scientific Publication Osney, Mead, Oxford, UK - Nguyễn Văn Uyển 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật T1 và T2 NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Footer Page 108 of 166 ... vật, nếu môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm mô t vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến mô t tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy mô t hoặc... loại môi trường khác cho các thí nghiệm nuôi cấy mô Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu để nuôi cấy mô đặc biệt nào đó Mô t số môi trường... điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần Thông thường, mô t chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), thí