http://www.ebook.edu.vn 181 Bài 6 Nuôi cấy protoplast I. Mục đích và yêu cầu Kỹ thuật protoplast phát triển mạnh từ sau công trình của Takebe (1971) khi tái sinh cây hoàn chỉnh từ protoplast của lá cây thuốc lá. Có ba phương thức phân lập protoplast, đó là: - Cơ học (không dùng các enzyme) - Sử dụng ezyme tuần tự (xử lý qua hai bước) - Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời) Tùy theo đối tượng và từng loại mô mà thay đổi nồng độ của các enzyme cho thích hợp. Vì proplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt phấn), mô sẹo, tế bào đơn Protoplast thực vật có ba ứng dụng chính sau: - Chọn dòng tế bào biến dị soma. - Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật. - Biến nạp di truyền: đưa các cơ quan tử, virus và DNA ngoại lai vào tế bào thực vật. II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác (100 mL), đĩa petri nhựa đã vô trùng (disposable) - Giấy thấm vô trùng - Forceps, kéo, dao mổ - Đĩa petri thủy tinh vô trùng - Giấy parafilm, giấy nhôm - Tube ly tâm loại 15 mL - Lưới lọc có đường kính lỗ lọc 65µm - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette 2. Thiết bị - Nồi khử trùng http://www.ebook.edu.vn 182 - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm (tốc độ 6000-10000 rpm), rotor cho tube 15 mL - Máy lắc - Buồng đếm - Kính hiển vi đảo ngược 3. Hóa chất - Dung dịch enzyme tách protoplast - Môi trường phân lập (PI), môi trường nuôi cấy protoplast (PC) - Cồn 90% - Nước cất vô trùng III. Phương pháp tiến hành 1. Nguyên liệu thực vật Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách protoplast. Sử dụng các lá được tách trong ngày. 2. Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulase R10 0,5 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 % + Mannitol 13,0 % + pH môi trường ~ 5,8 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm. 3. Tiến hành http://www.ebook.edu.vn 183 a. Ngày thứ nhất à Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá. à Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 mL bổ sung 10 mL dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút). b. Ngày thứ hai à Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65µm) đặt trong cốc loại 50 mL. à Bổ sung thêm 3 mL dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên. à Bổ sung thêm 2 mL dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc (dùng forceps để giữ lưới lọc trong lúc rửa). Chuyển hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 mL) vào tube ly tâm loại 15 mL và ly tâm 50×g trong 10 phút. à Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10mL dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1mL dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch (thể nổi). à Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 mL dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên (cục tròn). à Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 mL dung dịch rửa. (lần rửa này có thể bỏ qua nếu các “hạt” protoplast quá bé hay quá ít chỉ vừa đủ dùng). Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 mL môi trường nuôi cấy protoplast (PC). à Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast (số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/mL môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. à Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28 o C. http://www.ebook.edu.vn 184 c. Ngày thứ ba Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m 2 hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn hùynh quanh ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày. d. Ngày thứ năm Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m 2 ) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra. e. Ngày thứ bảy Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không. Chú thích: Nếu có thể tìm thấy tập đoàn tế bào, protoplast có thể được pha loãng với môi trường nuôi cấy sạch có lượng nhỏ mannitol để quan sát sự phát triển của callus có nguồn gốc protoplast. Sau khoảng 8-10 tuần, callus này có thể được chuyển lên môi trường tạo chồi. . 182 - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm (tốc độ 60 0 0-1 0000 rpm), rotor cho tube 15 mL - Máy. Protoplast thực vật có ba ứng dụng chính sau: - Chọn dòng tế bào biến dị soma. - Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật. - Biến nạp di truyền: đưa các cơ quan tử, virus và DNA ngoại. ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ mL môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng. à Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong