Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật - Bài 7 pot

http://www.ebook.edu.vn 185 Bài 7 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens I. Mục đích và yêu cầu Các thực vật chuyển gen đã được tạo ra bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Có hai phương thức chính: - Chuyển gen trực tiếp: bắn gen, xung điện, vi tiêm, siêu âm, silicon carbide, thông qua ống phấn, điện di - Chuyển gen gián tiếp (nhờ vi sinh vật): Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp được sử dụng thông dụng và ít tốn kém hơn cả là chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm có trong đất, thường được sử dụng để tiến hành biến nạp di truyền trên đối tượng thực vật. Đoạn DNA muốn chuyển vào một cây nào đó có thể được thao tác dễ dàng trên E. coli và sau đó chuyển trở lại vào Agrobacterium. Việc chuyển gen vào thực vật qua Agrobacterium đã thực hiện thành công trên nhiều loại cây: thuốc lá, đậu tương, các cây họ đậu nhiệt đới, bông cải, khoai tây. II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác (250 mL), ống nghiệm có nắp vặn - Giấy thấm vô trùng - Forceps, kéo, dao mổ - Que cấy vi sinh - Đĩa petri (plastic và thủy tinh) vô trùng - Giấy parafilm - Giấy nhôm - Tube eppendorf (1,5-2 mL) - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette 2. Thiết bị - Nồi khử trùng http://www.ebook.edu.vn 186 - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1,5-2 mL 3. Hóa chất - Môi trường cơ bản MS - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB - Các loại kháng sinh: kanamycin, rifampicin và cefotaxim - Agar - MgSO 4 10mM - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: NAA và BAP - Cồn 90% - Nước cất vô trùng III. Phương pháp tiến hành 1. Nguyên liệu - E. coli chủng TOP 10 có mang pRK 2013 (helper plasmid) - E. coli chủng TOP 10 có mang vector pBI 121+ insert DNA (gen ngoại lai mang tính trạng mong muốn) - Agrobacterium tumenfaciens chủng LBA 4404. - Cây thuốc lá in vitro. 2. Chuẩn bị môi trường 2.1. Môi trường LB - Bacto-tryptone 3 g - Yeast-Extract 1,5 g - NaCl 3 g - Nước cất đến đủ 300mL. http://www.ebook.edu.vn 187 2.2. Môi trường LB đặc Môi trường LB bổ sung 1,5 % agar/100 mL. 2.3. Môi trường LB-R Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin. 2.4. Môi trường LB-K Môi trường LB bổ sung 50 µg/mL kanamycin. 2.5. Môi trường LB-RK Môi trường LB bổ sung 100 µg/mL rifampicin và 50 µg/mL kanamycin. 2.6. Môi trường MSO - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - pH môi trường ~ 5,8 2.7. Môi trường nuôi cấy (MS 104) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - BAP 2 mg/mL - NAA 0,2 mg/mL - pH môi trường ~ 5,8 2.8. Môi trường chọn lọc (MS SEL) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - BAP 2 mg/mL http://www.ebook.edu.vn 188 - NAA 0,2 mg/mL - Kanamycin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pH môi trường ~ 5,8 2.9. Môi trường tạo rễ (MSR) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - Kanamyin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pH môi trường ~ 5,8 Môi trường có bổ sung cefotaxim cần được bảo quản trong điều kiện không có ánh sáng. Chất kháng sinh được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường (để nhiệt độ môi trường hạ xuống khoảng 55-60 o C) ở điều kiện vô trùng của laminar. 3. Tiến hành 3.1. Triparental mating (giao phối bộ ba) a. Nuôi cấy vi khuẩn Các môi trường LB lỏng được chuẩn bị trong các ống nghiệm có nắp vặn, khử trùng để tiến hành nuôi cấy các vi khuẩn. Các bước như sau: à Nuôi A. tumenfaciens trong môi trường LB-R trong tổi, ở 28 o C, thời gian 48 giờ (nuôi trước khi tiến hành triparental mating 2 ngày). à Nuôi E. coli có mang plasmid helper (pRK 2013) và E. coli có mang vector pBI 121 + insert DNA trong môi trường LB-K (nuôi trước khi tiến hành lai bộ ba 1 ngày). b. Nuôi cấy chung 3 loại vi khuẩn Các bước tiến hành: à Lấy mỗi ống nghiệm nuôi các loại vi khuẩn 1 mL, ly tâm tốc độ khoảng 10.000 rpm, trong 5 giây. à Loại bỏ thể nổi, thêm 1 mL môi trường LB, lắc nhẹ để trộn (để loại bỏ chất kháng sinh). http://www.ebook.edu.vn 189 à Lập lại 2 bước trên 2 lần. Thêm 300 µl môi trường LB. à 3 loại vi khuẩn trên được cấy lên mặt đĩa chứa môi trường LB đặc (đã được chuẩn bị trước các đĩa petri chứa môi trường LB bổ sung 1,5 % agar) không bổ sung chất kháng sinh, mỗi loại vi khuẩn lấy 100 µl. Dàn đều trên bề mặt môi trường đến khi khô hoàn toàn. Nuôi cấy từ 1-2 ngày tại 26-28 o C, đến khi các “thảm” vi khuẩn được hình thành. c. Chọn lọc vi khuẩn nuôi cấy bằng cách trộn 3 loại vi khuẩn, sử dụng chất kháng sinh Các bước tiến hành: à Lấy 5 mL MgSO 4 10 mM cho lên đĩa petri mới, lấy một ít vi khuẩn trong “thảm” đã nuôi cấy ở trên cho vào để có một dịch lỏng. à Chuẩn bị 4 tube eppendorf vô trùng, cho vào mỗi tube 900 µL MgSO 4 10 mM. à Tiến hành pha loãng vi khuẩn thành các nồng độ pha loãng: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 . à Lấy 100 µl mỗi loại vi khuẩn đã pha loãng dàn đều lên 5 đĩa petri chứa môi trường LB-RK bổ sung 2 % agar. à Nuôi trong 2-3 ngày tại 26-28 o C trong điều kiện tối để phát triển khuẩn lạc. à Nuôi cấy 1 khuẩn lạc trong 5 mL môi trường LB-RK tại 26-28 o C từ 1-2 ngày để thu được sinh khối E. coli, xác định Agrobacterium đã được chuyển gen (nếu chưa sử dụng ngay, thêm vào 15% glycerin và bảo quản ở -70 o C). 3.2. Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium Các bước tiến hành: à Lấy 1 khuẩn lạc ở trên cấy chuyển vào 5 mL môi trường LB-K lỏng, nuôi cấy lắc ở điều kiện tối, nhiệt độ từ 27-28 o C trong 2-3 ngày. à Thu tất cả các tế bào đã nuôi cấy ở trên bằng cách cho môi trường LB-K lỏng chứa khuẩn lạc vào tube eppendorf, ly tâm từ 0,5-1 phút, tốc độ 12.000 rpm. Lặp lại nhiều lần. à Loại bỏ môi trường LB ở phía trên, các tế bào thu được hòa tan trong 1 mL môi trường MSO lỏng. à Chuẩn bị 20 mL môi trường MSO trên đĩa petri. http://www.ebook.edu.vn 190 à Lá thuốc lá in vitro cắt thành các mảnh lá có kích thước ước chừng khoảng 0,5-0,7 cm × 0,5-0,7 cm (loại bỏ các gân lá), chuyển lên đĩa petri chứa môi trường MSO. à Tế bào Agrobacterium hòa trong 1 mL môi trường MSO được cấy chuyển sang môi trường MSO có chứa các mảnh lá, lắc nhẹ bằng tay và ủ trong 10 phút. à Sau khi đồng nuôi cấy, làm khô các mảnh lá bằng cách chuyển chúng lên giấy lọc vô trùng trong 0,5-1 phút. Các mảnh lá đó được nuôi trên môi trường nuôi cấy (MS 104) trong 2 ngày trong tối. à Các mảnh lá sau đó được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc (MS SEL) và nuôi cấy trong 3 tuần để tái sinh chồi ở điều kiện chiếu sáng. à Các chồi tạo thành được cấy chuyển lên môi trường MSR để tạo rễ. Các cây hoàn chỉnh được chuyển sang nuôi cấy trong các bình. Các cây này là các cây đã được tiến hành chuyển gen. Để biết việc chuyển gen có thành công hay không cần phải tiến hành các thí nghiệm kiểm tra (tách chiết DNA của Agrobacterium, chạy PCR với cặp primer đặc hiệu cho insert DNA và điện di sản phẩm PCR trên agarose gel 1 %). TÀI LIỆU ĐỌC THÊM - Murashige T and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-497. - Nistch JP and Nistch C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science 163:85-87. - Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises. - Street HE. 1977. Plant tissue and cell culture. Blackwell Scientific Publication. Osney, Mead, Oxford, UK. - Nguyễn Văn Uyển. 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. T1 và T2. NXB Nông nghiệp. TP Hồ Chí Minh. . rifampicin và 50 µg/mL kanamycin. 2.6. Môi trường MSO - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - pH môi trường ~ 5,8 2 .7. Môi trường nuôi cấy (MS 104) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % -. tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần - Máy ly tâm lạnh (14000 rpm) cho tube 1, 5-2 mL 3. Hóa chất - Môi trường cơ bản MS - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB - Các. - Kanamycin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pH môi trường ~ 5,8 2.9. Môi trường tạo rễ (MSR) - MS đầy đủ - Agar 0,8 % - Saccharose 3 % - Kanamyin 1,5 mL - Cefotaxim 2 mL - pH môi