http://www.ebook.edu.vn 159 Bài 2 Môi trường dinh dưỡng Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh. Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi cấy những mô đặc biệt nào đó. Một số môi trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trong chúng bảo đảm sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường Murashige-Skoog (1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác. Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm thành phần chính: - Đường cung cấp nguồn carbon. - Các muối khoáng đa lượng. - Các muối khoáng vi lượng. - Các vitamin. - Các chất điều khiển sinh trưởng. Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA ) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết cà chua ). I. Thành phần chính của môi trường 1. Đường Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh dưỡng. http://www.ebook.edu.vn 160 Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%. 2. Các muối khoáng đa lượng Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô Stt Nguyên tố đa lượng Dạng sử dụng Nồng độ (mM) 1 N Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O, KNO 3 , NaNO 3 , NH 4 NO 3 , ∑[NO 3 - , NH 4 + ] (NO 3 - , NH 4 + ) (NH 4 ) 2 SO 4 khoảng 20 2 P NaH 2 PO 4 .7H 2 O, KH 2 PO 4 khoảng 1 3 K KNO 3 , KCl.6H 2 O, KH 2 PO 4 khoảng 10 4 Ca Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O, CaCl 2 .2H 2 O hoặc khoảng 2 CaCl 2 .6H 2 O 5 Mg MgSO 4 .7H 2 O 0,5-3 6 S (NH 4 ) 2 SO 4 khoảng 1 3. Các muối khoáng vi lượng Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực ít được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, nó đã được sinh lý học thực vật chứng minh đối với cây hoàn chỉnh do đó có thể sử dụng được hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo. Vì vậy, sự cung cấp này có tính kinh nghiệm trong những trường hợp cụ thể có thể là không cần thiết (Bảng 2.2). 4. Các vitamin http://www.ebook.edu.vn 161 Bảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0 o C (trong ngăn đá tủ lạnh). Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô Stt Nguyên tố vi lượng Dạng sử dụng Nồng độ (mg/L) 1 Mn MnSO 4 .4H 2 O 15-100 2 B H 3 BO 3 6-100 3 Zn ZnSO 4 .7H 2 O 15-30 4 Cu CuSO 4 .5H 2 O 0,01-0,08 5 Mo Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,007-1 6 Co CoCl 2 .6H 2 O 0,1-0,4 7 I KI 2,5-20 8 Fe FeSO 4 .7H 2 O 15-27,9 Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô Stt Tên vitamin Nồng độ (mg/L) 1 myo-inositol 100 2 Nicotinic acid 0,5-1 3 Pyridoxine.HCl (Vit B 6 ) 0,05-0,5 4 Thiamine.HCl (Vit B 1 ) 10-50 5 Panthotenate calcium (Vit B 5 ) 1-5 6 Riboflavin (Vit B 2 ) 1-5 7 Biotin 0,1-1 8 Folic acid 0,1-1 http://www.ebook.edu.vn 162 5. Các chất điều khiển sinh trưởng Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú ý: - Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA 3 : cân một lượng chất sinh trưởng đủ pha trong 50 mL dung dịch mẹ vào một ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi lắc đến khi tan hết, sau đó mới thêm nước cất đến 50 mL. - Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha. - Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết. Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong một năm. BAP, IBA, KIN, và GA 3 bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính. Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng Chữ viết tắt Chất kích thích sinh trưởng Chữ viết tắt Chất kích thích sinh trưởng BA Benzyladenin KIN Kinetin BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid GA 3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin 2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid NOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram Chú ý Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp (10 -8 ). Cần dùng pipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng một. Và chú ý rửa cẩn thận các ly, cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng độ cao. Ngoại trừ IAA và GA 3 , các chất sinh trưởng còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng. IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore (xem bài trước) sau đó chứa trong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh sâu. Môi trường sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn http://www.ebook.edu.vn 163 khoảng 50-60 o C khi đó mới cho IAA đã lọc vào (các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng). 6. Các chất hữu cơ khác 6.1. Nước dừa Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol và một số amino acid khác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môi trường. Lấy nước dừa già, lọc trong, cho vào các túi nilon và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt nhất là nên sử dụng tươi. 6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ. Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường. II. Vấn đề lựa chọn môi trường Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò. Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C. - Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg. - Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog và Linsmaier-Skoog. Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần http://www.ebook.edu.vn 164 tìm tỷ lệ NO 3 - /NH 4 + thích hợp. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. Vì vậy, những người mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình. III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy. 1. Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962). Chia làm 5 phần: Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS Dung dịch stock Nồng độ (mg/L) Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trường MS 1 : KNO 3 1900 19 KH 2 PO 4 170 (× 10) 1,7 20 mL NH 4 NO 3 1650 16,5 MgSO 4 .7H 2 0 370 3,7 MS 2 : CaCl 2 .2H 2 O 440 (×20) 8,8 10 mL MS 3 : H 3 BO 3 6,2 0,124 MnSO 4 .4H 2 O 22,3 0,446 CoCl 2 .6H 2 O 0,025 0,5 mg CuSO 4 .5H 2 O 0,025 (× 20) 0,5 mg 10 mL ZnSO 4 .4H 2 O 8,6 0,172 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,25 5 mg KI 0,83 16,6 mg MS 4 : FeSO 4 .7H 2 O 27,8 (× 20) 0,556 10 mL http://www.ebook.edu.vn 165 Na 2 -EDTA 37,3 0,746 MS 5 : myo-inositol 100 2 Thiamine.HCl 0,1 2 mg Pyridoxine.HCl 0,5 (× 20) 10 mg 10 mL Nicotinic acid 0,5 10 mg Glycine 2 40 mg 2. Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần: Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch Dung dịch stock Nồng độ (mg/L) Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trường Nt 1 : KNO 3 950 9,5 KH 2 PO 4 68 (× 10) 0,68 20 mL NH 4 NO 3 720 7,2 MgSO 4 .7H 2 0 185 1,85 Nt 2 : CaCl 2 .2H 2 O 166 (×20) 1,66 10 mL Nt 3 : H 3 BO 3 10 0,2 MnSO 4 .4H 2 O 25 0,5 CuSO 4 .5H 2 O 0,0025 (× 20) 0,05 mg 10 mL ZnSO 4 .4H 2 O 10 0,2 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,25 0,5 mg Nt 4 : FeSO 4 .7H 2 O 27,8 (× 20) 0,556 10 mL Na 2 -EDTA 37,3 0,746 Nt 5 : myo-inositol 100 2 Thiamine.HCl 0,5 10 mg Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg Nicotinic acid 5 (× 20) 100 mg 10 mL Glycine 0,05 40 mg Biotin 2 1 mg http://www.ebook.edu.vn 166 Acid folic 0,5 10 mg 3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast (theo Trigiano & Gray, 2000) - Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI) Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI Stt Thành phần Nồng độ (mg/L) 1 CaCl 2 .H 2 O 1480 2 KH 2 PO 4 27,2 3 KNO 3 101 4 MgSO 4 .7H 2 O 246 5 CuSO 4 .5H 2 O 0,025 6 KI 0,16 pH môi trường 5,8 - Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –PC) Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC Dung dịch stock Nồng độ (mg/L) Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 mL) Dung tích dùng cho 1 L môi trường PC 1 : Ca(H 2 PO 4 ) 2 .2H 2 O 100 (× 20) 2 10 mL CaCl 2 .2H 2 O 450 9 PC 2 : KNO 3 2500 50 NaH 2 PO 4 .2H 2 O 170 (× 20) 3,4 10 mL (NH 4 ) 2 SO 4 134 1,68 MgSO 4 .7H 2 0 250 5 PC 3 : H 3 BO 3 3 60 mg MnSO 4 .4H 2 O 13,2 132 mg CoCl 2 .6H 2 O 0,025 0,5 mg CuSO 4 .5H 2 O 0,025 (× 20) 0,5 mg 10 mL ZnSO 4 .7H 2 O 2 40 mg http://www.ebook.edu.vn 167 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,25 5 mg KI 0,75 15 mg PC 4 : myo-inositol 100 (× 20) 2 10 mL Nicotinic acid 1 20 mg Lấy mỗi loại stock PC (PC 1 , PC 2 , PC 3 và PC 4 ) 10 mL. Bổ sung thêm: + Sequestrene 330 28 mg/L + Sucrose 10 g/L + Glucose 18 g/L + Mannitol 100 g/L . CuSO 4 .5H 2 O 0,0 1-0 ,08 5 Mo Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,00 7-1 6 Co CoCl 2 .6H 2 O 0, 1-0 ,4 7 I KI 2, 5 -2 0 8 Fe FeSO 4 .7H 2 O 1 5 -2 7,9 Bảng 2. 3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô Stt. http://www.ebook.edu.vn 159 Bài 2 Môi trường dinh dưỡng Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể. MS 3 : H 3 BO 3 6 ,2 0, 124 MnSO 4 .4H 2 O 22 ,3 0,446 CoCl 2 .6H 2 O 0, 025 0,5 mg CuSO 4 .5H 2 O 0, 025 (× 20 ) 0,5 mg 10 mL ZnSO 4 .4H 2 O 8,6 0,1 72 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0 ,25 5 mg KI 0,83