http://www.ebook.edu.vn 176 Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù I. Mục đích và yêu cầu Trong nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng), dịch nuôi cấy chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng. Nuôi cấy tế bào dịch lỏng thường được khởi đầu bằng cách đặt các khối mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Vì thế quá trình nuôi cấy này là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới tế bào dịch huyền phù. Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus do quá trình nuôi cấy này được thao tác tương tự như nuôi cấy vi sinh vật trong nồi lên men. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch huyền phù chủ yếu được sử dụng để sản xuất các hợp chất thứ cấp (các hợp chất tự nhiên) với hiệu suất cao. Các sản phẩm thứ cấp như: các chất dùng làm dược liệu, các chất tạo mùi, các chất dùng làm gia vị, các sắc tố và các hóa chất dùng trong nông nghiệp, ngày nay đã được sản xuất thành công trong nhiều nuôi cấy in vitro tế bào thực vật. Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật dựa trên cơ sở lập luận là sản phẩm có cùng giá trị được sản xuất tự nhiên trong các cơ quan, quả, hoặc các mô khác nhau của cây có thể được kích thích để tích lũy trong các tế bào chưa phân hoá rõ. Những đột phá trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào (ví dụ nuôi cấy rễ tơ) cho thấy trong tương lai gần phần lớn những hóa chất công nghiệp nào có nguồn gốc thực vật cho dù đó là dược liệu, thuốc nhuộm hay chất màu thực vật đều có thể sản xuất trong các nồi phản ứng sinh học (bioreator) hay còn gọi là hệ lên men (fermenter). http://www.ebook.edu.vn 177 Hình 5.1. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào thực vật trong bioreactor II. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác (250 mL) - Giấy nhôm - Giấy lọc vô trùng - Lọ khử trùng mẫu vật nuôi cấy - Forceps, kéo, dao mổ http://www.ebook.edu.vn 178 - Đĩa petri vô trùng - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette 2. Thiết bị - Nồi khử trùng - Tủ lạnh - Laminar - Tủ sấy - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước - Máy lắc - Máy hút chân không - Phễu sứ Buchner 3. Hóa chất - Dung dịch stock: môi trường MS (MS 1 , MS 2 , MS 3 , MS 4 và MS 5 ) - Dung dịch HgCl 2 0,1% - Cồn 90% - Agar - Saccharose - Nước dừa - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: KIN, BAP, NAA và 2,4-D. - Nước cất vô trùng III Phương pháp tiến hành 1. Nguyên liệu thực vật - Hạt lúa (Oryza satica): nuôi cấy tạo callus. - Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria) in vitro: nuôi cấy tạo callus. 2. Môi trường nuôi cấy tạo callus http://www.ebook.edu.vn 179 a. Lúa - MS đầy đủ - Saccharose 3 % - Agar 0,8 % - 2,4-D 5 mg/L - KIN 0,1 mg/L - pH môi trường ~ 5,8 b. Nghệ đen - MS đầy đủ - Saccharose 2 % - Agar 0,8 % - BAP 3 mg/L - 2,4-D 3 mg/L - pH môi trường ~ 5,8 3. Môi trường nuôi cấy tế bào dịch lỏng Thành phần môi trường tương tự môi trường tạo callus nhưng không bổ sung agar. 4. Tiến hành a. LÚA: chuẩn bị môi trường theo các bước tương tự các bài trước. - Tạo callus à Hạt lúa bóc vỏ, rửa sạch bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Cho hạt lúa vào bình khử trùng, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút. Sau đó khử trùng bằng HgCl 2 0,1 % trong 6 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần trước khi cấy. à Cấy hạt lúa đã khử trùng vào môi trường đã chuẩn bị và nuôi ở nhiệt độ 25 ± 2 o C, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux . à Sau 4-5 tuần các callus màu trắng sữa xuất hiện trên các hạt lúa. - Nhân callus Dùng dao mổ tách lấy các khối callus nhỏ có đường kính 1-2 mm cấy chuyển lên môi trường nhân callus (thành phần môi trường tương tự http://www.ebook.edu.vn 180 như môi trường tạo callus). Sau 3-4 tuần, các callus sẽ phát triển nhanh chóng thành các khối callus lớn (đường kính khoảng 3-5 mm). - Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù à Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch huyền phù. Các bước tiến hành và khử trùng tương tự môi trường có agar. Mỗi bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường. à Chọn các khối callus có màu trắng ngà, rắn từ môi trường nhân để chuyển vào môi trường lỏng. Một gam callus cho vào 1 bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi trường (các thao tác tiến hành trong điều kiện vô trùng). Đặt các bình môi trường chứa callus trên máy lắc ở trong phòng nuôi cấy (nhiệt độ 25 ± 2 o C) với tốc độ khoảng 100-150 vòng/phút Cứ 2 ngày lấy ra một bình nuôi cấy, lọc sinh khối tế bào bằng máy hút chân không, cân lượng mẫu tươi thu được. Sau đó, đem sấy mẫu ở 65 o C trong 2 giờ để cân trọng lượng khô. So sánh với kết quả ban đầu để theo dõi tốc độ sinh trưởng của callus Xây dựng đường cong sinh trưởng (từng 2 ngày) cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô của tế bào. b. NGHỆ ĐEN Sử dụng các cây nghệ đen in vitro, cắt các đoạn gốc lá cấy vào môi trường tạo callus. Sau 4-5 tuần các callus màu vàng bắt đầu xuất hiện. Tách các callus này cấy lên môi trường nhân callus (thành phần môi trường nhân callus tương tự môi trường tạo callus). Các bước tiến hành nuôi cấy tế bào dịch huyền phù tương tự như đối với lúa. . http://www.ebook.edu.vn 176 Bài 5 Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù I. Mục đích và yêu cầu Trong nuôi cấy tế bào dịch huyền phù (dịch lỏng), dịch nuôi cấy chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng. triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới tế bào dịch huyền phù. Nuôi cấy tế bào dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus. - MS đầy đủ - Saccharose 3 % - Agar 0,8 % - 2,4-D 5 mg/L - KIN 0,1 mg/L - pH môi trường ~ 5, 8 b. Nghệ đen - MS đầy đủ - Saccharose 2 % - Agar 0,8 % - BAP 3 mg/L - 2,4-D