http://www.ebook.edu.vn 168 Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng I. Mục đích và yêu cầu Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường, được thực hiện bằng k ỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý, nếu dùng đỉnh sinh trưởng nhỏ quá thì nuôi cấy khó thành công, nếu dùng đỉnh sinh trưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ thành công nhưng cũng dễ bị nhiễm trùng. Kích thước của đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiên một đỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp hơn cả. Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành cây có thể trực tiếp hoặc thông qua giai đoạn protocorm (dẽ hành). II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác (100 mL, 250 mL) - Giấy nhôm - Giấy thấm vô trùng - Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vật nuôi cấy - Forceps, kéo, dao mổ - Đĩa petri vô trùng - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette các loại http://www.ebook.edu.vn 169 2. Thiết bị - Nồi khử trùng - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần 3. Hóa chất - Dung dịch stock môi trường MS (MS 1 , MS 2 , MS 3 , MS 4 và MS 5 ) - Dung dịch HgCl 2 0,1% - Cồn 90% - Agar - Saccharose - Nước cất vô trùng - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: BAP và NAA. - Nước dừa III. Phương pháp tiến hành 1. Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp a. Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng của cây hông (Paulownia fortunei) - Đỉnh sinh trưởng cây keo lai (Acasia hybrid) b. Môi trường nuôi cấy - MS đầy đủ - Saccharose 3% - Agar 0,8% - BAP 2 mg/L - NAA 1 mg/L http://www.ebook.edu.vn 170 - pH môi trường ∼ 5,8 c. Tiến hành à Pha môi trường dinh dưỡng (1 L). Chia môi trường vào trong 20 hoặc 40 bình tam giác loại 250 hoặc 100 mL, tương ứng. Nút miệng bình bằng giấy nhôm, sau đó đem khử trùng ở 121 o C (1 atm)/15-30 phút (môi trường chuẩn bị trước từ 2 ngày trở lên). à Rửa sạch đỉnh sinh trưởng bằng xà phòng dưới dòng nước chảy, cắt bỏ những lá chung quanh chỉ để lại một vài lá, cho vào lọ thủy tinh vô trùng để chuẩn bị khử trùng mẫu vật. à Trước khi cấy, laminar phải được bật đèn khử trùng 30 phút. Các dụng cụ cần thiết cho quá trình cấy (forceps, kéo, dao, bình khử trùng, cồn, giấy thấm ) được đặt trong laminar trước khi bật đèn. à Khử trùng sơ bộ bằng cồn 90% từ 30 giây đến 1 phút, sau đó bằng HgCl 2 0,1 % trong 5 phút, cuối cùng rửa sạch HgCl 2 bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần (các thao tác này thực hiện trong laminar). à Lấy mẫu vật ra thấm khô trên giấy thấm vô trùng bóc bỏ những lá chung quanh, chỉ giữ lại đỉnh sinh trưởng (những phần mô thấm dung dịch khử trùng cũng cần phải cắt bỏ). Sau đó, cấy mẫu vào các bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng đã được chuẩn bị sẵn. Các bình môi trường đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với nhiệt độ 25 ± 2 o C, thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày với cường độ 2000-3000 lux. Sau 3-4 tuần, đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành cây nhờ quá trình kéo dài chồi (shoot elongation). 2. Nuôi cấy phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm a. Nguyên liệu thực vật - Đỉnh sinh trưởng hoặc chồi nách của hoa lan Dendrobium - Đỉnh sinh hoặc dứa (Ananas comusus) b. Môi trường nuôi cấy - Lan: MS đầy đủ Saccharose 2% Agar 0,8% Nước dừa 15% http://www.ebook.edu.vn 171 NAA 0,1 mg/L BAP 1,0 mg/L pH môi trường ∼ 5,8 - Dứa: MS đầy đủ Saccharose 2% Agar 0,8% NAA 0,5 mg/L BAP 0,2 mg/L pH môi trường ∼ 5,8 c. Tiến hành Các bước tiến hành tương tự như trường hợp nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp. Nhưng lưu ý thêm: - Đỉnh sinh trưởng của các loài lan hoặc dứa thường rất bẩn nên phải rửa thật kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. - Lan và dứa là những cây có khả năng sinh trưởng khá mạnh nên thời gian khử trùng đỉnh sinh trưởng của chúng có thể lâu hơn các đối tượ ng khác (khoảng 7-10 phút) để đảm bảo tỷ lệ nhiễm bẩn thấp. Các bình môi trường đã cấy mẫu được đặt trong phòng nuôi với thời gian chiếu sáng 8-10 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng 25 ± 2 o C. . Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng I. Mục đích và yêu cầu Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi. Thiết bị - Nồi khử trùng - Tủ sấy - Laminar - Tủ lạnh - Microwave - Cân phân tích 10 -4 g - Cân kỹ thuật 10 -2 g - Máy cất nước 2 lần 3. Hóa chất - Dung dịch stock môi trường. MS 2 , MS 3 , MS 4 và MS 5 ) - Dung dịch HgCl 2 0,1% - Cồn 90% - Agar - Saccharose - Nước cất vô trùng - Dung dịch stock các chất kích thích sinh trưởng: BAP và NAA. - Nước dừa