NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  -  - ĐẶNG NGỌC HÙNG ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS LÊ ĐÌNH KHẢ THS ĐỒN THỊ MAI THÁI NGUN – 2009 THÁI NGUYÊN – NĂM 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC 1.6 Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) Bạch đàn liễu (E exserta) 16 1.6.1 Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) 16 Trang Lời cảm ơn 1.6.3 Bạch đàn lai 17 1.6.4 Nhân giống Bạch đàn nuôi cấy mô 20 Lời nói đầu 1.7 Một số kết bật nuôi cấy mô thân gỗ Bạch đàn 21 Danh mục bảng 1.7.1 Trên giới 21 Danh mục biểu đồ 1.7.2 Nhân giống gỗ phương pháp nuôi cấy mô Việt Nam 25 Danh mục hình ảnh CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP Danh mục ký hiệu, từ viết tắt MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái niệm nhân giống lai lâm nghiệp 1.2 Khái niệm nuôi cấy mô nhân giống Lâm nghiệp 1.3 Cơ sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3.1 Tính tồn tế bào thực vật 1.3.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào 1.4 Các nhân tố ảnh hƣởng tới q trình nhân giống ni cấy mô tế bào 1.4.1 Môi trường nuôi cấy 1.4.2 Các chất điều hoà sinh trưởng 1.4.3 Môi trường vật lý 10 1.4.4 Vật liệu nuôi cấy 11 1.4.5 Điều kiện vô trùng 11 1.4.6 Buồng nuôi cấy 12 1.5 Các giai đoạn q trình nhân giống 12 1.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 12 1.5.2 Giai đoạn cấy khởi động 13 1.5.3 Giai đoạn nhân nhanh 13 1.5.4 Tạo hoàn chỉnh (ra rễ) 14 1.5.5 Đưa môi trường tự nhiên 14 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.6.2 Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) 17 http://www.lrc-tnu.edu.vn NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 28 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.2.1 Một số đặc điểm dịng UE35 dịng UE56 28 2.2.2 Cây mẹ lấy vật liệu 28 2.2.3 Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) 29 2.3 Nội dung nghiên cứu 29 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.4.1 Chọn loại môi trường phù hợp 31 2.4.2 Ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban đầu 31 2.4.3 Ảnh hưởng vitamin B2 đến hệ số nhân chồi tỷ lệ chồi hữu hiệu 32 2.4.4 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) chất lượng chồi (TLCHH) 32 2.4.4.1 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến HSNC TLCHH 32 2.4.4.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP+IAA đến HSNC TLCHH 33 2.4.4.3 Ảnh hưởng nồng độ BAP + NAA đến HSNC TLCHH 34 2.4.4.4 Ảnh hưởng nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC TLCHH 34 2.4.4.5 Ảnh hưởng nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC TLCHH 35 2.4.4.6 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/cây chiều dài trung bình rễ 35 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.4.7 Ảnh hưởng nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/cây Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 72 chiều dài trung bình rễ 36 4.1 Kết luận 72 2.4.4.8 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao 4.2 Tồn 72 vườn ươm 36 4.3 Kiến nghị 73 2.4.4.9 Điều kiện thí nghiệm 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 2.4.5 Bố trí thí nghiệm 38 Tài liệu tiếng việt 75 2.4.6 Thu thập xử lý số liệu 38 Tài liệu tiếng Anh 77 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 Phụ Lục 3.1 Khử trùng mẫu cấy 41 3.2 Ảnh hƣởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban đầu 43 3.3 Nghiên cứu loại mơi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi 44 3.4 Ảnh hƣởng việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS * đến HSNC TLCHH 46 3.5 Ảnh hƣởng chất điều hồ sinh trƣởng mơi trƣờng MS * đến HSNC TLCHH 50 3.5.1 Ảnh hưởng BAP đến HSNC TLCHH 50 3.5.2 Ảnh hưởng phối hợp BAP + IAA đến HSNC TLCHH 52 3.5.3 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA môi trường MS * đến HSNC TLCHH 55 3.5.4 Ảnh hưởng phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC TLCHH 58 3.5.5 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC TLCHH 60 3.5.6 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ IBA môi trường 1/2 MS* tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình/cây chiều dài rễ 63 3.5.7 Ảnh hưởng tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình/cây chiều dài rễ 66 3.5.8 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao vườn ươm 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG LỜI NÓI ĐẦU Nâng cao chất lượng đào tạo nghiên cứu khoa học mục tiêu quan trọng việc đào tạo cao học Trường đại học Nơng Lâm Thái Ngun Để hồn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học 2006-2009, đồng ý Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, thực đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống Tên bảng TT Trang 3.1a Bảng tổng hợp kết khử trùng mẫu dòng UE35 (180 mẫu) … 41 3.1b Bảng tổng hợp kết khử trùng mẫu dòng UE56 (180 mẫu) … 42 3.2 Bảng ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi…………… 43 dòng Bạch đàn lai UE35 UE56 Eucaliptus urophylla E exsertar phương pháp nuôi cấy mô tế bào” Sau thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường đến HSNC nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt khoa sau đại học, thầy cô giáo 3.4 Ảnh hưởng việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC TLCHH trực tiếp giảng dạy, lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến HSNC TLCHH Bạch đàn lai thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, môn công nghệ tế bào thuộc Viện khoa học sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên Cho phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến thầy giáo, đặc biệt GS.TS Lê Đình Khả, Th.s Đồn Thị Mai tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất bạn bè đồng nghiệp người thân giúp đỡ tơi có luận văn Nghiên cứu nhân giống ni cấy mơ tế bào vấn đề khó nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống lâm nghiệp Việc nghiên cứu TLCHH dòng UE35 UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường) 44 …….… UE35 UE56 (180 mẫu cấy/cơng thức) …………………………… 47 dịng UE35 UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….…… 51 3.6 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC TLCHH dịng UE35 UE56 (180 mẫu/ cơng thức) ……………………… 53 3.7 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC TLCHH dịng Bạch đàn lai UE35 UE56 (180 mẫu cấy/cơng thức)…………………………………………………………………… 56 3.8 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC TLCHH dịng UE35 UE56 (180 chồi cấy/cơng thức) ……… 59 nhân giống số dịng Bạch đàn lai nói đề tài nhằm góp phần xây dựng sở hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất với số lượng lớn, đồng đều, có chất lượng cao tránh khỏi khiếm khuyết, mong bảo bổ sung ý kiến nhà khoa học, 3.9 Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến bạn đồng nghiệp để cơng trình nghiên cứu hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2009 Tác giả 3.11 Ảnh hưởng IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình HSNC TLCHH (180 chồi cấy/cơng thức) ………………………… 61 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi rễ, số rễ trung bình chiều dài rễ (180 chồi cây/ công thức) ………………………………… 64 chiều dài rễ dòng UE35 UE56 ………………………………… 66 3.12 Ảnh hưởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống vườn ươm sau tháng (90 mạ /công thức)……………………… 69 Đặng Ngọc Hùng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TT Tên biểu đồ Trang Tên bảng Trang 3.1 Ảnh khử trùng mẫu cấy mẫu nuôi cấy sau 20 ngày …………… 43 3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng vitamin B2 đến TLCHH dòng UE35 UE 48 3.2 Ảnh dịng UE35 cấy loại mơi trường ……………………… 46 3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng BAP đến HSNC dòng UE35 UE 51 3.3 Ảnh mẫu cấy sang mơi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10 3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng vitamin B2 đến HSNC dòng UE35 UE 48 ngày nuôi cấy ……………………………………………………… 47 3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng BAP đến TLCHH dòng UE35 UE 52 3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC 3.4a Ảnh chồi ni cấy mơi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48 dòng UE35 UE 54 3.4b Ảnh chồi nuôi cấy môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49 3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH 3.5 3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC 3.6 dòng UE35 UE 56 3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH dòng UE35 UE 60 3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến Ảnh chồi ni cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + mg/l N AA + 0,5 mg/l Kinetin …………………………………………… 62 3.8 dòng UE35 UE 59 3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH Ảnh chồi ni cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA ………………………………………………………… 58 3.7 dòng UE35 UE 58 3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC Ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC TLCHH …………………………………………………………… 55 dòng UE35 UE 54 Ảnh chồi ni cấy có bổ sung ABT1 vào mơi trường rễ sau 15 ngày nuôi cấy ……………………………………………………… 68 3.9 Ảnh vườn ươm dòng …………………………… 71 3.10 Ảnh sơ đồ cho quy trình ni cấy mơ dịng UE35 v UE56 …… 74 HSNC dòng UE35 UE 62 3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến TLCHH dòng UE35 UE 62 3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ IBA tỷ lệ rễ dòng UE35 UE 65 3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ IBA tới số rễ trung bình dịng UE35 UE 65 3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ rễ dòng UE35 UE 67 3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình dịng UE35 UE 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật không ABT1 : Chất kích thích rễ Trung Quốc BAP : 6- Benzyl amino purine ngừng phát triển thu thành tựu đáng kể Kỹ thuật đời nhanh B2 : Riboflavil chóng có vị trí quan trọng lĩnh vực công nghệ sinh học sản xuất giống Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn trồng Ưu điểm bật phương pháp nhân nhanh, giữ đặc Ca (0Cl)2 : Hypoclorit canxi điểm di truyền ổn định, sản xuất với số lượng cá thể lớn thời gian ngắn GA3 : Gibberellin acid Cây ni cấy mơ thường trẻ hố cao độ có rễ giống mọc từ hạt HgCl2 : Clorua thuỷ ngân Trong lúc hom lại thường khơng có rễ cọc, rễ khơng thể làm đâm sâu xuống HSNC : Hệ số nhân chồi đất mọc từ hạt thường có tượng bảo lưu cục (topophisis) Vì IAA : Indol acetic acid ni cấy mơ tế bào cịn biện pháp trẻ hoá giống sản xuất lâm nghiệp IBA : 3-Indol butyric acid Mặc dù ni cấy mơ địi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song nhiều Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05 NAA : Nathyl acetic acid sử dụng phổ biến sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đồn Na0Cl : Hypoclorit natri Thị Mai, 2002, tr 166-182) TTG1 : Thuốc kích thích rễ có gốc IBA Trung tâm giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam TLCHH nơi áp dụng, đặc biệt phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom Bạch đàn mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả sinh trưởng nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi Bạch đàn trồng rộng : Tỷ lệ chồi hữu hiệu rãi nhiều nước giới Nhiều giống Bạch đàn cải thiện với kỹ thuật trồng rừng thâm canh cho suất cao Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng cấu trồng rừng Tuy nhiên suất chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng nước ta thấp khác Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam nghiên cứu lai tạo chọn số tổ hợp lai có nhiều triển vọng khả sinh trưởng Các tổ hợp lai loài khác loài loài Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E exserta) Eucaluptus urophyla dùng làm mẹ, E exserta dùng làm bố Những dòng lai chọn dịng vơ tính thuộc tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) U29E4 (dòng 56) Hai dòng lai có mẹ Bạch đàn uro (U29), bố Bạch Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đàn liễu (E2), song lại thuộc hai khác E2 E4 có đặc điểm sinh CHƢƠNG trưởng khác Các dịng vơ tính thuộc tổ hợp lai Bộ NN&PTNT TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU công nhận giống tiến kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa vùng đất đồi nghèo dinh dưỡng cho suất gấp 2-4 lần so với loài bố mẹ (Lê Đình Khả, 1.1 Khái niệm nhân giống lai lâm nghiệp Nguyễn Việt Cường, 2001) Việc nhân giống phương pháp nuôi cấy mô Giống lai giống tạo lai tự nhiên lai nhân tạo cá thể giống lai chọn tạo có ý nghĩa lớn để sớm đưa vào sản xuất diện có kiểu gen (genotype) khác Giống lai thường có suất cao có tính rộng mà giữ đặc tính ưu việt chúng chống chịu với điều kiện bất lợi tốt bố mẹ Vì thế, tạo sử dụng giống lai Để hạn chế lây lan dịch bệnh xảy biện mối quan tâm hàng đầu nhà chọn giống nông lâm nghiệp pháp kỹ thuật trồng hỗn lồi dịng vơ tính khác Ở Nước ta có giới (Lê Đình Khả, 2006) khoảng 12 dòng Bạch đàn Bộ NN&PTNT công nhận cho phép trồng 1.2 Khái niệm nuôi cấy mô nhân giống Lâm nghiệp rừng sản xuất, có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 dịng Nhân giống ni cấy mô (propagation by tissue culture) Vi nhân giống nhân giống nuôi cấy mô qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống (micropropagation) tên gọi chung cho phương pháp nuôi cấy in vitro cho phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng phận nhỏ tách khỏi (George, 1930) dùng phổ biến để nhân Hiện nay, nhu cầu giống Bạch đàn có suất cao qua khảo giống thực vật, có lâm nghiệp Các phận dùng để nuôi cấy có nghiệm, hai dịng nhằm phục vụ trồng rừng lớn Thời gian thể chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi phận khác vỏ qua Trung tâm nghiên cứu giống rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp thử cây, non, thân mầm (hypocotyl) vv (Isikawa cs, 1996, Preece, 1997, Tripepi, nghiệm áp dụng quy trình nhân giống ni cấy mơ hai dịng UE35 UE56 1997, Merkle, 1997, Nguyễn Đức Thành, 2000) Song ni cấy mơ cho chồi bên có kết bước đầu Việc nghiên cứu nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô để chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) phương pháp dùng hồn thiện công nghệ phục vụ sản xuất giống cần thiết Từ đặc nhân giống rừng mà không đề cập nội dung khác điểm, nhu cầu thực tiễn nhu cầu khoa học nêu trên, tiến hành đề tài: Nuôi cấy mô thường trẻ hố cao độ có rễ giống mọc từ hạt, “Nghiên cứu nhân giống dòng bạch đàn lai UE35 UE56 Eucaliptus chí khơng có khác biệt đáng kể so với mọc từ hạt Trong lúc hom urophyla E exserta phƣơng pháp nuôi cấy mô” Đây phần lại thường khơng có rễ cọc, rễ đâm sâu xuống đất mọc từ hạt kết đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch thường có tượng bảo lưu cục (topophisis) đề cập Ví dụ: đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) Lát hoa công nghệ tế mô keo lai giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng loài bố mẹ Keo tai bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống rừng tượng Keo tràm) có đủ loại kép lần, kép hai lần giả, lại thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực có rễ theo kiểu rễ cọc mọc từ hạt điển hình, hom giống lại có giả trưởng thành khơng có rễ cọc (nghĩa tính trẻ hố bị hạn chế, cịn tính bảo lưu cục biểu rõ rệt) Vì ni cấy mơ cịn biện pháp trẻ hố giống sản xuất lâm nghiệp Mặc dầu ni cấy mơ địi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song nhiều nơi áp dụng, đặc biệt phối Phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào phôi sinh thành tế bào hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom sử dụng phổ biến mơ chun hố, đảm nhận chức khác thể Q trình phân sản xuất lâm nghiệp hố diễn sau: Tuy vậy, tính trẻ hố nuôi cấy mô mọc từ hạt, Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức Brand Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hố mơ, Khi tế bào phân hố thành mơ chức năng, chúng khơng hồn tồn khả hom lấy từ cành trưởng thành ghép Bulô (Betula sp.) thấy phân chia Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng sau tháng ni cấy mơ có băng protein giống mọc từ hạt, sau lại trở dạng giống tế bào phơi sinh tiếp tục thực trình phân 4-8 tháng lại giống với trưởng thành, ghép hom lấy từ cành hố, q trình gọi phản phân hoá tế bào trưởng thành sau 4-8 tháng có số có hoa, lúc mọc từ hạt nhanh phải sau năm có hoa (Grosdova, 1985) Điều chứng tỏ Phân hố ni cấy mơ có mức độ trẻ hố cao ghép hom lấy từ cành trưởng thành (chứ lấy từ chồi trẻ hố) song khơng thể trẻ mọc từ hạt Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyển hoá 1.3 Cơ sở khoa học phƣơng pháp ni cấy mơ tế bào 1.3.1 Tính tồn tế bào thực vật Phản phân hoá Nguyên lý nhân giống nuôi cấy mô tế bào tính tồn tế bào thực vật Mỗi tế bào thể thực vật mang tồn lượng thơng Về chất phân hố phản phân hố q trình hoạt hoá phân tin di truyền cần thiết đầy đủ thực vật cịn gọi gen (genom) Đặc hố gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen tính thực vật thể kiểu hình cụ thể thời kỳ trình hoạt hố tính trạng mới, số gen khác lại bị ức chế hoạt động phát triển phụ thuộc vào giải mã thông tin di truyền tương ứng hệ gen Quá trình xảy theo chương trình mã hóa cấu trúc phân tế bào Do đó, gặp điều kiện thích hợp, mối tương tác qua lại với điều tử DNA tế bào Khi tế bào nằm thể thực vật, chúng bị ức chế kiện môi trường, quan, mô tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh mang đặc tính di truyền giống mẹ 1.3.2 Sự phân hoá phản phân hố tế bào Q trình phát sinh hình thái ni cấy mơ kết phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác nhau, thực chức cụ thể khác Các mơ có cấu trúc chun mơn hố định nhờ vào phân hoá tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi gen hoạt hố, q trình phân chia xảy theo chương trình định sẵn DNA tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994) Quá trình phát sinh hình thái ni cấy mơ, tế bào thực vật thực chất kết trình phân hố phản phân hố tế bào Kỹ thuật ni cấy mô, tế bào xét kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) cách định hướng dựa vào phân hoá phản phân hoá tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái mơ ni cấy, người ta + Nguồn bon: nuôi cấy mô, tế bào chưa có khả quang hợp thường bổ sung vào mơi trường ni cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực để tổng hợp nên chất hữu người ta phải đưa vào môi trường lượng vật Auxin Cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất mơi trường hợp chất bon định để cung cấp nượng cho tế bào mô (Debengh, khác tạo phát sinh hình thái khác theo quy luật biểu thị 1991) Nguồn cácbon loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp sơ đồ bên Theo sơ đồ, môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, mơ tế bào thực vật tổng hợp hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp phát sinh đóng vai trị chất thẩm thấu mơi trường Người ta thường sử dụng hình thái mơ nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ cao mơ ni loại đường saccarose glucose (Trần Văn Minh, 1994) cấy theo hướng tạo rễ tỷ lệ cân đối phát sinh theo hướng tạo mô sẹo + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài trạng thái phát triển (callus) mô Thông thường, nguồn nitơ đưa vào môi trường hai dạng HN 4+ 1.4 Các nhân tố ảnh hƣởng tới trình nhân giống ni cấy mơ tế bào NO3- (nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- tế bào thực vật tỏ có hiệu Nhân giống nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn nhau, so với NH4+ Nhưng NO3- gây tượng “kiềm hóa” mơi trường trình chia thành nhân tố sau: giải pháp sử dụng phối hợp nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý sử dụng rộng 1.4.1 Môi trường nuôi cấy rãi Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy điều kiện bên + Các nguyên tố đa lượng: nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, xem vấn để định thành bại q trình ni cấy Mơi trường ni cấy Ca… cần thiết thay đổi tuỳ đối tượng ni cấy Nhìn chung, nguyên tố xem phần đệm để cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng sử dụng nồng độ 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Các ngun tố có chức trưởng phân hố mơ suốt q trình ni cấy in vitro Cho đến nay, có cung cấp nguyên liệu để mô tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu nhiều môi trường dinh dưỡng tìm (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ trúc giúp cho trình trao đổi chất tế bào thực vật với môi trường thuộc vào đối tượng mục đích ni cấy Vấn đề lựa chọn mơi trường thích hợp thuận lợi cho sinh trưởng phát triển tối ưu giai đoạn nơi cấy mơ Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ chất khác nhau, quan trọng Mơi trường ni cấy hầu hết loài thực vật bao gồm muối lựa chọn sử dụng Nói chung, mơi trường giàu Nitơ Kali thích hợp cho việc hình khống đa lượng, vi lượng, nguồn bon, acid amine chất điều hồ sinh thành chồi, cịn mơi trường giàu Kali thúc đẩy trình trao đổi chất mạnh trưởng (cũng bổ sung thêm số chất phụ gia khác than hoạt tính, nước Thành phần khống mơi trường cấy xác định cân dừa …) tuỳ lồi, giống, nguồn gốc mẫu, chí quan nồng độ ion khác dung dịch (nồng độ ion thể mg/l) thể mà dinh dưỡng cần cho sinh trưởng tối ưu chúng khác Vì vậy, vấn Việc lựa chọn thành phần hàm lượng khoáng cho đối tượng nuôi cấy đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho khó địi hỏi người làm cơng tác ni cấy mơ phải có hiểu biết sinh giai đoạn hệ mô nuôi cấy mô quan trọng, số lượng loại hoá chất lý thực vật dinh dưỡng khoáng phải cần độ xác cao phù hợp cho giai đoạn, đối tượng cụ thể Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau: + Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… nguyên tố quan trọng thiếu cho phát triển mơ tế bào chúng đóng vai trò quan trọng hoạt động enzym Chúng dùng nồng độ thấp + Auxin: Nhóm gồm có chất là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA nhiều so với nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng phát triển bình (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… nuôi cấy mô thực vật Auxin thường (Nguyễn Văn Uyển, 1993) thường sử dụng để kích thích phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành mô sẹo, + Các vitamin: Mặc dù nuôi cấy mơ tự tổng hợp Vitamin, kìm hãm phát triển chồi tạo rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993) không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do đó, để sinh trưởng tối ưu + Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích phân số Vitamin nhóm B bổ sung vào môi trường với lượng định tuỳ theo chia tế bào định phân hố chồi bất định từ mơ sẹo quan Các hợp hệ mô giai đoạn nuôi cấy Các Vitamin B1 (Thiamin) B6 (Pyridocin) chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Vitamin thường dùng môi trường nuôi cấy với nồng độ Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong chất thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994) Kenitin BAP sử dụng phổ biến chúng có hoạt tính cao giá thành + Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định nước dừa, dịch chiết rẻ Tuỳ vào hệ mơ mục đích ni cấy mà Cytokinin sử dụng nấm men, cà rốt, chối, khoai tây bổ sung vào môi trường có tác dụng kích nồng độ khác Ở nồng độ thấp (10 -7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích thích sinh trưởng mơ sẹo quan Nước dừa sử dụng vào nuôi cấy phân bào, nồng độ 10 -6- 10-5M chúng kích thích phân hố chồi Trong ni cấy mơ từ năm 1941 sử dụng rộng rãi mơi trường nhân nhanh in mơ để kích thích nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10- vitro Trong nước dừa thường chứa acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN - 10-4 (Lê Văn Chi, 1992) DNA Đặc biệt nước dừa cịn có chứa hợp chất quan trọng cho ni + Gibberellin: Nhóm có khoảng 20 loại hormone khác quan cấy mô như: Myoinoxitol, hợp chất có hoạt tính Auxin, Gluxit trọng GA3 (Gibberellin acid 3) GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993) loại hạt khác nhau, kéo dài lóng đốt thân cành Bên cạnh GA3 cịn có tác + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) loại Polysacharid dụng phá ngủ phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) tạo chồi phụ tảo có khả ngậm nước cao 6-12g/l Độ thống khí mơi trường thạch có (Street, 1973) Ngồi ra, có cịn có tác dụng ảnh hưởng đến hoa số ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động thực vật có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy 1.4.2 Các chất điều hồ sinh trưởng Các Phytohormon chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng phát triển thực vật Chúng đóng vai trị quan trọng q trình sinh trưởng phát triển + Abscisic acid (ABA): chất ức chế sinh trưởng tự nhiên dùng ni cấy tế bào in vitro ABA có ảnh hưởng âm tính đến mơ ni cấy, ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao dùng BAP riêng rẽ (lê Văn Chi, 1992) thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngồi cịn có ảnh hưởng đến q + Ethylen: có biểu tác động hai chiều, kìm hãm hình thành chồi trình lão hố mơ nhiều q trình khác Các phytohormon chia thành giai đoạn sớm lại kích thích phát triển chồi giai đoạn muộn Trong nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid Chúng yếu tố quan số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ số trường trọng môi trường định đến thành công kết ni cấy hợp lại kìm hãm q trình (Nguyễn Văn Uyên, 1993) 80 81 Phụ lục 02 Thành phần môi trƣờng MS Phụ lục 03 Thành phần mụi trng MS*(MS ci tin) Đa l-ợng Đa l-ợng CaCl2 332.02 mg/l 2.99 mM CaCl2 332.02 mg/l 2.99 mM KH2PO4 170.00 1.25 mM KH2PO4 170.00 1.25 mM KNO3 1900.00 18.79 mM KNO3 1900.00 18.79 mM MgSO4 180.54 1.50 mM MgSO4 180.54 1.50 mM NH4NO3 1650.00 20.61 MM NH4NO3 1650.00 20.61 MM Vi l-ỵng CoCl2.6H2O 0.025 mg/l 0.11 M 0.025 mg/l 0.11 M CuSO4 0.025 0.10 M 0.025 0.10 M FeNaEDTA 36.700 0.10 mM 36.700 0.10 mM H3BO3 6.200 0.10 mM H3BO3 6.200 0.10 mM KI 0.830 5.00 M KI 0.830 5.00 M MnSO4 H2O 16.900 0.10 mM 16.900 0.10 mM Na2MoO4.2 H2O 0.250 1.03 M Na2MoO4.2 H2O 0.250 1.03 M ZnSO4.7 H2O 8.600 29.91 M ZnSO4.7 H2O 8.600 29.91 M Vi l-ỵng CoCl2.6H2O CuSO4 FeNaEDTA MnSO4 H2O Biotin 0.05 mg/l 0.21 M 26.64 M Folic acid 0.50 1.13 M Glycine 2.00 26.64 M 100.00 0.56 mM Vitamin Glycine 2.00 mg/l Vitamin 100.00 0.564 mM Nicotinic acid 0.50 4.06 M Myo-Inositol Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 2.43 M Nicotinic acid 5.00 40.62 M Thiamine HCl (vitamin B1) 0.10 0.30 M Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 2.43 M Thiamine HCl (vitamin B1) 0.50 1.48 M Myo-Inositol (Môi trường bổ sung thêm vitamin thay đổi nồng độ số nguyên tố khống) 82 83 Phụ lục 04 Thành phần mơi trƣờng WPM Phụ lục 05 Thành phần mơi trƣờng WV3 §a l-ợng Đa l-ợng CaCl2 72.50 mg/l 0.65 mM CaCl2 452.88 mg/l 4.08 mM Ca(NO3)2 386.80 2.35 mM KCl 656.79 8.81 mM KH2PO4 170.00 1.25 mM KH2PO4 270.00 1.98 mM K2SO4 990.00 5.68 mM KNO3 910.06 9.00 mM MgSO4 180.54 1.5 mM MgSO4 903.79 7.51 mM NH4NO3 400.00 5.00 MM Vi l-ỵng Vi l-ỵng CoCl2.6H2O 0.025 mg/l 0.11 M CuSO4.5 H2O 0.250 1.00 M 1.00 M FeNaEDTA 36.70 0.10 mM H3BO3 6.20 0.10 mM KI 22.30 0.13 mM MnSO4 H2O Na2MoO4.2 H2O 0.25 1.03 M ZnSO4.7 H2O 8.60 29.91 M CuSO4 FeNaEDTA H3BO3 MnSO4 H2O 0.25 mg/l Vitamin Glycine 0.10 mM 0.50 mM 0.830 5.00 M 15.160 0.09 mM Na2MoO4.2 H2O 0.250 1.03 M ZnSO4.7 H2O 8.600 0.03 mM Vitamin 2.00 mg/l 26.64 M 100.00 0.56 mM Nicotinic acid 0.50 4.06 M Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.50 2.34 M Thiamine HCl (vitamin B1) 1.00 2.96 M Myo-Inositol 36.71 31.000 Myo-Inositol Thiamine HCl (vitamin B1) 1000.00 mg/l 0.40 5.56 mM 1.19 M 84 85 Phụ lục 06 Phân tích kết khử trùng mẫu cấy ANOVA ► Dòng UE35 Ty le song (%) Test of Homogeneity of Variances Between Groups Within Groups Total Ty le song (%) Levene Statistic 1.549 df1 df2 12 Sig .247 Sum of Squares 786.395 75.919 862.314 df 12 17 Mean Square 157.279 6.327 F 24.860 Sig .000 Ty le song (%) ANOVA Ty le song (%) Between Groups Within Groups Total Duncan a Sum of Squares 869.854 51.826 921.680 df 12 17 Mean Square 173.971 4.319 F 40.282 Sig .000 Ty le song (%) Duncan a Phut 20 30 10 12 40 11 Sig N 3 3 3 24.4467 27.7767 Subset for alpha = 05 27.7767 28.3333 30.0033 073 215 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 ► Dòng UE56 Test of Homogeneity of Variances Ty le song (%) Levene Statistic 598 df1 df2 12 Sig .702 N 3 3 3 27.2200 27.2233 28.3333 616 Subset for alpha = 05 28.3333 32.2200 083 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 30.0033 32.2233 235 Phut 20 12 30 10 40 11 Sig 46.1133 1.000 32.2200 34.4467 300 46.1100 1.000 86 87 Phụ lục 07 Phân tích ảnh hƣởng mơi trƣờng ni cấy ANOVA ► Dòng UE35 He so nhan choi (lan) Test of Homogeneity of Variances Between Groups Within Groups Total He so nhan choi (lan) Levene Statistic 2.222 df1 df2 Sig .139 10 Sum of Squares 127 006 133 df 10 14 Mean Square 032 001 F 53.343 Sig .000 He so nhan choi (lan) ANOVA Duncan a He so nhan choi (lan) Sum of Squares 087 004 090 Between Groups Within Groups Total df 10 14 Mean Square 022 000 F 57.000 Sig .000 Moi truong MS MS* WV3 Litvay WPM Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 9167 9433 1.0333 1.0667 1.1733 210 125 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 He so nhan choi (lan) Duncan a Moi truong MS MS* WV3 Litvay WPM Sig N 9600 3 3 Subset for alpha = 05 1.0233 1.0833 1.1100 1.000 1.000 125 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 ► DòngUE56 Test of Homogeneity of Variances He so nhan choi (lan) Levene Statistic 1.176 df1 df2 10 Sig .378 1.1833 1.000 88 89 ► Dịng UE56 Phụ lục ¶nh hƣởng nồng độ B2 đến HSNC TLCHH ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 2.020 827 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 683 1.914 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 df2 4 10 10 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Sig .620 185 df1 df2 4 10 10 Sig .167 537 ANOVA ANOVA He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 136 010 146 69.844 12.333 82.177 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 034 001 F 35.231 Sig .000 17.461 1.233 14.158 000 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 125 003 127 71.943 12.193 84.136 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 031 000 F 111.333 Sig .000 17.986 1.219 14.750 000 He so nhan choi (lan) He so nhan choi (lan) Duncan a Nong vitaminB2 (mg/l) 1.0 3.0 4.0 2.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 1.1900 1.4167 1.4167 1.4267 1.4467 1.000 296 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a Nong vitaminB2 (mg/l) 3.0 4.0 1.0 2.0 Sig Subset for alpha = 05 1.1500 1.3567 1.3700 1.3700 1.3833 1.3833 1.3933 1.000 092 134 N 3 3 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong vitaminB2 (mg/l) 1.0 4.0 2.0 3.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 12.6000 14.9000 16.7667 16.7667 18.0667 18.4000 1.000 067 116 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a Nong vitaminB2 (mg/l) 1.0 3.0 4.0 2.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 12.0667 16.1000 17.2000 17.9000 17.9333 1.000 087 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 90 91 ► Dịng UE56 Phụ lục ¶nh hƣởng nồng độ BAP đến HSNC TLCHH Test of Homogeneity of Variances ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 1.244 753 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 df2 4 10 10 Sig .353 579 Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 854 008 862 234.546 9.829 244.375 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total He so nhan choi (lan) df 10 14 10 14 df1 df2 4 Sig .099 338 10 10 ANOVA ANOVA He so nhan choi (lan) Levene Statistic 2.618 1.290 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Mean Square 214 001 F 271.428 Sig .000 58.636 983 59.655 000 Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 716 010 725 148.565 22.346 170.911 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 179 001 F 187.647 Sig .000 37.141 2.235 16.621 000 He so nhan choi (lan) He so nhan choi (lan) Duncan a Nong BAP (mg/l) 1.0 4.0 3.0 2.0 Sig N 3 3 1.4333 Subset for alpha = 05 1.8167 1.9133 1.9600 1.000 1.000 069 2.1567 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a Nong BAP (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 1.3667 3 3 Subset for alpha = 05 1.6333 1.7767 1.8433 1.000 1.000 1.000 2.0167 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong BAP (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 3 3 12.4967 Subset for alpha = 05 18.7067 19.0000 22.0167 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .725 1.000 24.2067 1.000 Duncan a Nong BAP (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 3 3 12.9233 Subset for alpha = 05 15.9400 17.4567 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .242 17.4567 19.2600 170 22.3033 1.000 92 93 Phụ lục 10 ¶nh hƣởng phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC ► Dòng UE56 TLCHH Test of Homogeneity of Variances ► Dòng U35 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 1.139 1.140 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 Levene Statistic 127 1.052 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df2 4 df1 df2 4 10 10 Sig .969 428 Sig .393 392 10 10 ANOVA ANOVA He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 380 018 397 97.397 6.547 103.944 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 095 002 F 53.945 Sig .000 24.349 655 37.193 000 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Sum of Squares 294 002 296 115.604 31.733 147.337 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 073 000 F 297.662 Sig .000 28.901 3.173 9.107 002 He so nhan choi (lan) He so nhan choi (lan) Duncan a Nong IAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N Subset for alpha = 05 1.8833 3 3 1.9700 2.0667 2.1600 1.000 1.000 1.000 2.3433 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a Nong IAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 1.8000 Subset for alpha = 05 1.8633 1.9167 2.0667 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong IAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 17.4000 Subset for alpha = 05 20.3333 22.0667 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 1.000 1.000 24.1333 24.1667 961 Duncan a Nong IAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 15.1333 18.2333 18.2333 20.8667 20.8667 22.0667 22.6333 059 100 273 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 2.1833 1.000 94 95 Phụ lục 11 ¶nh hƣởng phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC ► Dòng UE56 TLCHH Test of Homogeneity of Variances ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 2.000 879 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df2 4 Sig .171 510 10 10 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total He so nhan choi (lan) df 10 14 10 14 Mean Square 164 001 F 190.609 Sig .000 133.023 1.445 92.078 000 Duncan a N 3 3 2.0167 Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Subset for alpha = 05 2.1767 2.2000 2.4333 1.000 df2 4 10 10 Sig .213 227 Sum of Squares 435 006 440 509.303 6.567 515.869 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 109 001 F 196.458 Sig .000 127.326 657 193.897 000 He so nhan choi (lan) He so nhan choi (lan) Nong NAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig df1 ANOVA ANOVA Sum of Squares 656 009 664 532.091 14.447 546.537 Levene Statistic 1.760 1.694 353 1.000 2.6100 1.000 Nong NAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 1.9667 Subset for alpha = 05 2.0500 2.1233 2.3100 1.000 1.000 1.000 1.000 2.4300 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong NAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 12.1000 Subset for alpha = 05 18.6333 24.5000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 1.000 1.000 26.7000 28.3000 134 Duncan a Nong NAA (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 11.3000 Subset for alpha = 05 17.2667 22.7667 25.4667 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 1.000 1.000 1.000 27.2333 1.000 96 97 Phụ lục 12 ¶nh hƣởng phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến ► Dòng UE56 HSNC TLCHH ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 1.921 537 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df2 4 10 10 Sig .183 712 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Duncan a N df 10 14 10 14 1.9400 3 3 Mean Square 062 001 F 47.688 Sig .000 52.788 3.750 14.077 000 (I) Nong kinetin (mg/l) 1.0 Subset for alpha = 05 2.0 2.0567 2.1133 3.0 2.2200 1.000 082 1.000 2.3100 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 4.0 Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong kinetin (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 3 3 df2 4 Sig .352 002 10 10 Multiple Comparisons He so nhan choi (lan) Nong kinetin (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig df1 Dependent Variable: Ty le choi huu hieu (%) Tamhane ANOVA Sum of Squares 247 013 260 211.153 37.500 248.653 Levene Statistic 1.247 9.323 Subset for alpha = 05 15.4667 20.3000 23.1667 23.1667 24.7333 26.0000 1.000 100 118 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 (J) Nong kinetin (mg/l) 1.0 2.0 3.0 4.0 2.0 3.0 4.0 1.0 3.0 4.0 1.0 2.0 4.0 1.0 2.0 3.0 Mean Difference (I-J) Std Error -.8000 18257 -2.0333 26034 7.0333 1.13920 11.0000* 32146 8000 18257 -1.2333 28480 7.8333 1.14504 11.8000* 34157 2.0333 26034 1.2333 28480 9.0667 1.15998 13.0333* 38873 -7.0333 1.13920 -7.8333 1.14504 -9.0667 1.15998 3.9667 1.17521 -11.0000* 32146 -11.8000* 34157 -13.0333* 38873 -3.9667 1.17521 Sig .152 063 218 003 152 163 173 001 063 163 118 000 218 173 118 485 003 001 000 485 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -1.9606 3606 -4.2658 1991 -8.3543 22.4210 7.8179 14.1821 -.3606 1.9606 -3.0756 6089 -7.0395 22.7062 9.2136 14.3864 -.1991 4.2658 -.6089 3.0756 -4.6609 22.7943 10.7704 15.2963 -22.4210 8.3543 -22.7062 7.0395 -22.7943 4.6609 -8.8054 16.7388 -14.1821 -7.8179 -14.3864 -9.2136 -15.2963 -10.7704 -16.7388 8.8054 * The mean difference is significant at the 05 level ANOVA He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 172 013 186 387.103 8.833 395.936 df 10 14 10 14 Mean Square 043 001 F 33.003 Sig .000 96.776 883 109.557 000 Duncan a Nong kinetin (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig 98 99 He so nhan choi (lan) Phụ lục 13 ¶nh hƣởng phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin N 3 3 1.9000 Subset for alpha = 05 2.0333 2.0967 1.000 057 đến HSNC TLCHH ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances 2.0967 2.1267 333 2.2233 1.000 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) Levene Statistic 949 560 df1 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Nong kinetin (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 3 3 11.7000 Subset for alpha = 05 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) 15.6667 22.7000 23.5000 1.000 10 10 Sig .475 697 ANOVA Ty le choi huu hieu (%) Duncan a df2 4 1.000 322 23.5000 24.7333 139 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 468 024 492 581.909 12.700 594.609 df 10 14 10 14 Mean Square 117 002 F 48.918 Sig .000 145.477 1.270 114.549 000 He so nhan choi (lan) Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Duncan a Nong kinetin (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 2.4833 Subset for alpha = 05 2.6533 2.6667 2.8333 1.000 745 1.000 3.0033 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong kinetin (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 15.6667 Subset for alpha = 05 18.2000 27.9333 29.8000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 1.000 070 29.8000 30.5333 444 100 101 ► Dịng UE56 Phụ lục 14 ¶nh hƣởng IBA đến hiệu rễ ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic 4.684 1.245 He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) df1 df2 4 10 10 Sig .022 353 Levene Statistic 2.509 2.955 Ty le re (%) So re TB (re/cay) df1 df2 4 Sig .109 075 10 10 ANOVA He so nhan choi (lan) Ty le choi huu hieu (%) ANOVA Sum of Squares 588 127 715 601.937 5.860 607.797 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 147 013 F 11.553 150.484 586 256.799 Sig .001 Ty le re (%) 000 So re TB (re/cay) Sum of Squares 6211.424 34.233 6245.657 2.671 244 2.915 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 1552.856 3.423 F 453.609 Sig .000 668 024 27.354 000 He so nhan choi (lan) Duncan a Nong kinetin (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 2.1233 2.4133 2.4233 2.5900 2.5900 2.7100 1.000 097 222 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le re (%) Duncan a Nong IBA (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig N 3 3 14.433 Subset for alpha = 05 45.000 53.300 59.433 1.000 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Ty le choi huu hieu (%) Duncan a Nong kinetin (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 12.5667 17.9333 27.3000 27.4667 28.3000 1.000 1.000 157 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 So re TB (re/cay) Duncan a Nong IBA (mg/l) 4.0 1.0 3.0 2.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 1.400 1.560 2.040 2.073 2.593 238 799 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 76.100 1.000 102 103 So re TB (re/cay) Chieu dai re (cm) Duncan a,b Nong IBA (mg/l) 4.0 3.0 2.0 1.0 Sig N 5244 41 90 90 90 90 Subset for alpha = 05 Duncan a 6733 7778 1.000 077 7778 8700 1.1578 1.000 119 Nong IBA (mg/l) 4.0 1.0 3.0 2.0 Sig b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Chieu dai re (cm) ► Dòng UE56 Duncan a,b Test of Homogeneity of Variances Ty le re (%) So re TB (re/cay) df1 df2 4 Sig .325 291 10 10 Ty le re (%) So re TB (re/cay) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Duncan a N 3 3 N 37 90 90 90 90 4811 Subset for alpha = 05 df 10 14 10 14 Mean Square 1580.924 28.612 F 55.254 Sig .000 605 017 34.976 000 13.900 Subset for alpha = 05 42.233 51.667 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .056 51.667 61.133 055 75.000 1.000 6578 7111 8600 1.000 294 1.000 b The group sizes are unequal The harmonic mean of the group sizes is used Type I error levels are not guaranteed Ty le re (%) Nong IBA (mg/l) 4.0 3.0 1.0 2.0 Sig Nong IBA (mg/l) 4.0 3.0 2.0 1.0 Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 69.958 ANOVA Sum of Squares 6323.697 286.120 6609.817 2.419 173 2.591 3 3 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 72.638 Levene Statistic 1.329 1.438 Subset for alpha = 05 1.280 1.807 1.833 2.027 2.527 1.000 078 1.000 N 1.0878 1.000 104 105 Phụ lục 15 ¶nh hƣởng phối hợp nồng độ IBA + ABT1 đến So re TB (re/cay) ► Dòng UE35 Duncan a Test of Homogeneity of Variances Ty le re (%) So re TB (re/cay) Levene Statistic 988 4.059 df1 df2 4 Sig .457 033 10 10 Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig 3 3 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Multiple Comparisons Dependent Variable: So re TB (re/cay) Tamhane (I) Nong ABT (mg/l) 1.0 1.5 2.0 Subset for alpha = 05 2.020 2.497 2.543 2.603 2.850 1.000 212 1.000 N Ty le re (%) (J) Nong ABT (mg/l) 1.0 1.5 2.0 1.0 1.5 2.0 1.5 2.0 1.0 2.0 1.0 1.5 Mean Difference (I-J) -.200 -.043 430 593 200 157 630 793 043 -.157 473 637* -.430 -.630 -.473 163 -.593 -.793 -.637* -.163 Std Error 1579 1107 1222 1073 1579 1229 1334 1199 1107 1229 0715 0411 1222 1334 0715 0662 1073 1199 0411 0662 Sig .960 1.000 294 230 960 977 161 171 1.000 977 060 003 294 161 060 681 230 171 003 681 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound -1.088 688 -1.132 1.045 -.394 1.254 -.683 1.870 -.688 1.088 -1.125 1.439 -.341 1.601 -.677 2.263 -1.045 1.132 -1.439 1.125 -.029 976 369 904 -1.254 394 -1.601 341 -.976 029 -.468 794 -1.870 683 -2.263 677 -.904 -.369 -.794 468 * The mean difference is significant at the 05 level Duncan a Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 42.200 3 3 Subset for alpha = 05 59.433 66.667 75.567 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Chieu dai re (cm) Duncan a Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 90 90 90 90 90 6711 7789 Subset for alpha = 05 1.0878 059 1.000 1.000 Ty le re (%) So re TB (re/cay) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total ► Dòng UE56 10 14 10 14 Mean Square 721.504 7.405 F 97.439 Sig .000 274 009 31.359 000 Test of Homogeneity of Variances Ty le re (%) So re TB (re/cay) Levene Statistic 1.036 3.539 9100 ANOVA df 82.233 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 90.000 Sum of Squares 2886.017 74.047 2960.064 1.096 087 1.184 df1 df2 4 10 10 Sig .435 048 1.2889 1.000 106 107 Phụ lục 16 ¶nh hƣởng thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống chiều cao ANOVA Ty le re (%) So re TB (re/cay) Sum of Squares 2633.151 119.267 2752.417 1.371 183 1.555 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total df 10 14 10 14 Mean Square 658.288 11.927 F 55.195 Sig .000 343 018 18.722 000 ► Dòng UE35 Test of Homogeneity of Variances Ty le song (%) Chieu cao trung binh (cm) Levene Statistic 1.595 794 df1 df2 4 10 10 Sig .250 556 Ty le re (%) Duncan a Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 45.000 3 3 Subset for alpha = 05 ANOVA 55.000 65.567 Ty le song (%) 75.000 1.000 1.000 1.000 1.000 81.700 1.000 Chieu cao trung binh (cm) Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 4664.667 238.667 4903.333 137 180 317 df 10 14 10 14 Mean Square 1166.167 23.867 F 48.862 Sig .000 034 018 1.907 186 So re TB (re/cay) Duncan a Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 1.807 1.970 2.400 2.443 2.600 170 114 Ty le song (%) Duncan a Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Thoi gian huan luyen (ngay) 16 12 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 45.667 75.667 86.667 92.000 93.333 1.000 1.000 141 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 Chieu dai re (cm) Duncan a Nong ABT (mg/l) 2.0 1.5 1.0 Sig N 90 90 90 90 90 Subset for alpha = 05 6656 6933 8800 1.0611 1.1644 635 1.000 078 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 90.000 ► Dòng UE56 Test of Homogeneity of Variances Ty le song (%) Chieu cao trung binh (cm) Levene Statistic 2.000 2.000 df1 df2 4 10 10 Sig .171 171 108 ANOVA Ty le song (%) Chieu cao trung binh (cm) Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 4971.600 121.333 5092.933 104 193 297 df 10 14 10 14 Mean Square 1242.900 12.133 F 102.437 Sig .000 026 019 1.345 320 Ty le cay song (%) Duncan a Thoi gian huan luyen (ngay) Khong huan luyen 16 ngay 12 Sig N 3 3 Subset for alpha = 05 44.333 72.333 88.000 92.000 92.000 1.000 1.000 209 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000