Bài giảng thực hành nuôi cấy mô thực vật pptx

BÀI IPHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC 1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh

MỤC LỤC

Bài 1 Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật

Bài 2 Phương pháp khử trùng mô thực vật

Bài 3 Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam

Bài 4 Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ

Bài 5 Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật

Bài 6 Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo

Bài 7 Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Bài 8 Phương pháp vi ghép ở thực vật

Bài 9 Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

BÀI I

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1 - NGUYÊN TẮC

1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường

Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là

có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rấtnhỏ Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc),người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiềuloại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước

vô khoáng khi sử dụng Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock) Dung dịch mẹđược bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu Thông thường pha cácdung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinhtrưởng, và các stock cần thiết khác

1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật

Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môitrường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop Môi trường nàythích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyểncây từ ống nghiệm ra vườn ươm Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụngtrong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg.Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinhdưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dàingày

- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog) Đây làmôi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy Môitrường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chấtdinh dưỡng

2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ

2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị

tính

Số lượng Ghi chú

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường

MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch

mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chấtđiều hoà sinh trưởng

4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog)

4.1 Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)

Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng Dùng ống đong, đongkhoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml Cho lần lượt các muối đa lượng vào

theo trình tự nhất định sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x20) (mg/lít)

Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm

100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thểtích tăng dần) Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chấtnày phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng

Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000

ml Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần Dung dịchnày được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một

1000 ml môi trường nuôi cấy

4.2 Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)

Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rấtnhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác Vì vậy ở đây,

ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) cónồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”

Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stockkhoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên Thành phần các khoáng như sau:

Tên hoá chất trường nuôi cấy Nồng độ môi

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x1000) (mg/lít)

Nồng độ dung dịch

“bà ngoại “(x100) (mg/lít)

CuSO4.5H2O 0,025 25 2500

4.3 Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)

Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đốivới sắt rất nhỏ và lượng liên tục Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thườngdùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm

Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóngthích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật Phương pháp pha như sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) Nồng độ dung dịch stock (x200) (mg/lít)

Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml Cho vào mỗi becher 400 ml nước cấthai lần Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80oC Cân chính xác 5,56 gFeSO4.7H2O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hoàn toàn Cân chínhxác 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hoàn toàn

Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừakhuấy đều Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml Như vậy, ta có 1000 ml dung dịchstock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt Dung dịch này được bảoquả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 5ml cho một 1000 ml môitrường nuôi cấy

4.4 Pha stock hormon

Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau IAA, NAA,

BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêmnước đến thể tích cần) GA3, 2,4-D pha trong cồn 50o cho đủ thể tích

Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:

+ Cách 1: pha theo hệ mol

Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol(milimol) từ IAA tinh khiết

176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước →1000 ml dung dịch có nồng độ 1mol/lít Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA Như vậy, muốn có

100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA (MNAA: 186,2; M2,4-D:221,04; MBA: 225,2)

+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng.

Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong cácchai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC

4.5 Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)

Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml Bổsung các vitamin vào theo trình tự sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) Nồng độ dung dịch stock (x500) (mg/lít)

4.6 Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)

Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:

- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher

- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn

- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều

- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều

- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều

- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500

- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy

- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ

5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III

2 Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA Giải thích

3 Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít.Biết MBA =225,2

4 Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 µmol/lít để pha môitrường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 µmol/lít

vô cùng quan trọng.

Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi,noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộphận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm Để chuyển mô thực vật từ môi trường tựnhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng đểloại bỏ hết các mầm vi sinh vật Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật cònsống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt

Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học

có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vàothời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên

bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy Để tăng tính linhđộng và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy vớicồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn

Như vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, môthực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tốliên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là:

- Ca(OCl)2 (Caxi hypoclorid)

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

a Thực hiện trong phòng thí nghiệm

- Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm Rửa các đoạn này dưới vòinước máy cho sạch bụi đất

- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mangmột chồi ngủ Cắt bỏ lá, rễ

- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen

- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng

b Thực hiện trong tủ cấy

- Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút

- Chiết bỏ cồn Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút(hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút)

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước

4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá

- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy

- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng

- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng

- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70o trong 1 phút

- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước

4.3 - Cách cấy mẫu

a Mẫu cây Trầu bà

- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy

- Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá

2 Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid

3 Ghi nhận kết quả nuôi cấy

Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ Các chồi ngủ này cóđặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng tháitiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn Cácchồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn) Nếu táchriêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởinhững yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi náchnày có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi).Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mớithì hệ số nhân giống rất đáng kể.

Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thìviệc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện Vì vậy, với những loại thực vật này,phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi nách Chồi nách đemnuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơnrất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn

so với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thựcvật Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mangchồi nách Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùngtrong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống

Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật quanuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống

- NAA

- BA

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc Cắt lấy mộtđoạn cách gốc 10÷15 cm

- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy

- Cắt thành những đoạn nhỏ Cắt ở giữa hai chồi ngủ Mỗi đoạn có một chồi ngủ

- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 10÷15 phút

- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy

- Lắc với cồn 70o trong 1 phút

- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1

- Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần

b Nuôi cấy

- Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA vàNAA với tỷ lệ NAA/BA <1

- Cắm thân cúc vào môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt môi trường

4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam

a Khử trùng hạt

- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy

- Lắc hạt với nước xà phòng 10÷15 phút

- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy

- Lắc với cồn 70o trong 30 giây

- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần

b Tách vỏ hạt

- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy Dùng kẹp giữ hạt

- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt Hai đường này đối diện nhau.Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, không chạm vào phần thịt hạt

- Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngoài

- Hạt cam là hạt đa phôi, khi tách các phôi có thể tách rời nhau Ta vẫn có thể dùngnhững mảnh phôi để nuôi cấy, mỗi mảnh phôi sẽ phát triển thành một cây cam

c Nuôi cấy

- Đặt ngang hạt cam trên môi trường MS

- Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt môi trường sao cho ½ hạt nhập vào môi trường

- Đặt bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25oC

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1 Phương pháp lựa chọn công thức khử trùng

2 Tại sao phải tách vỏ ngoài (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi nuôi cấy?

3 Nếu để bình nuôi cấy hạt cam trong điều kiện không có ánh sáng, phôi có nảymầm phát triển được không? Giải thích?

Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giốngdứa thường tiến hành bằng nuôi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi) Ưu điểmcủa phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn.

Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa,sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro Các chồi có hình dạng giốngnhư vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng Mỗi chồi được táchriêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú

- Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ

- Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và BA

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa

- Tách bỏ toàn bộ các lá ở phần ngọn dứa Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ

- Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ

- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ

- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10phút

- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy

- Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 700 trong 2 phút

- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút

- Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần

Hình 1 Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa 4.2 - Phương pháp nuôi cấy

- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy

- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp

- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy

- Đặt các bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC

4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi

Sau thời gian nuôi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang môi trườngnuôi cấy để tạo cụm chồi Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh trưởngNAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi Sốlượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi(thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy) Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trườngtái sinh cây hoàn chỉnh Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng

4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C

Hình 2 Cách cắt rời chồi ngủ dứa

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH

1 Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa

2 Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ

3 Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ?

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giaiđoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng(vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành.Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt Khối mô sẹo có khảnăng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thíchsinh trưởng tạo mô sẹo.

Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năngnhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật có thể dùngnuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục,

lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm

tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng

A B Hình 3 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất làtrong sự tạo rễ Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo môsẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo

mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D)thích hợp

Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu

mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớncây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin.

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ)

2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS Sử dụng các cây

con làm vật liệu thí nghiệm

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung 2,4 - D

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính lượng Số Ghi chú