Báo cáo thực hành kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ Nhóm Giảng viên: TS Nguyễn Huy Thuần Họ tên sinh viên: Đỗ Thị Hào MSSV: DTN1153150024 Lớp: 43 CNSH Khoa: CNSH& CNTP Thái Nguyên, 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ E COLI I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA khỏi cấu trúc bao bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Điều quan tâm thu nhận phân tử DNA trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy Cách pha hóa chất - Dung dịch đệm CTAB: + CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide): 2g + Tris-HCl (pH8): 1,5756 g + EDTA (Na2H2EDTA.2H 2O): 0,58448 g + NaCl: 8,14 g + H2O: 100 ml + β-mercaptoethanol: 0,2 ml (chỉ bổ sung trước sử dụng) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng DNA EDTA có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡ liên kết hóa trị II làm giảm tính bền vững lớp màng tế bào vi khuẩn - Dung dịch CIAA: + 24 ml chloroform + ml isoamylalcohol Chloroform khơng tan nước, bổ sung vào dịch nuôi tế bào làm cho dịch phân thành lớp( pha) Hỗn hợp ly tâm mạnh để phân tách lớp Protein bị kết tủa nằm pha Isoamylancohol ancohol với có mặt cation hóa trị I ( NA+, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA - Dung dịch TE 1x: + Tris: 0,1212 g + EDTA: 0,03 g + H2O: 100 ml + pH =8.0 Cồn 70%: + cồn tuyệt đối: 70 ml + H2O: 30 ml Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ số muối lẫn tạp dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA - II CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên tắc Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật vi khuẩn Tuỳ loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ mục đích nghiên cứu điều kiện phịng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật tách chiết với loại hoá chất dung môi khác Các phương pháp tách chiết DNA thường dùng gồm: Phương pháp CTAB Phương pháp PVP Phương pháp phenol/chloroform LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp Silica Phương pháp Guanidine-chloroform Trong phạm vi giảng thực hành giới thiệu cách tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) phương pháp Do tác giả Gawel cộng đưa năm 1991 có cải tiến Nguyên tắc phương pháp dựa sở sử dụng kết hợp học nghiền hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, hóa chất loại bỏ thành phần không mong muốn, từ thu nhận DNA 3.2 Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước) A Bước 1: Bước chuẩn bị mẫu Lấy 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn E coli cho vào ống eppendoft 1.5 ml Ly tâm 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch để thu sinh khối tế bào Lưu ý trình tự mẫu phải xếp phù hợp với số ống eppendorp (phần sau gọi ống mẫu) Đánh số thứ tự eppendorp bút không bị nhịe nước theo thứ tự mẫu (hình 4) B Bước 2: Tách DNA, loại bỏ protein thành phần không mong muốn + Bổ sung vào eppendorf chứa mẫu nghiền 500 µl dung dịch đệm CTAB, đảo trộn mẫu máy vortex cho mẫu tan dung dịch đệm Sau ủ 60oC 1h máy lắc ổn nhiệt (hình 5) Nếu trường hợp khơng có máy lắc ổn nhiệt ủ mẫu 60oC h, 10 lại lấy đảo trộn lần máy vortex + Sau h, lấy eppendorf chứa mẫu ra, ly tâm nhẹ để toàn dung dịch lắng xuống đáy ống Sau bổ sung 500 µl dung dịch CIAA, đảo trộn máy vortex vòng 30 giây + Ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút Chú ý: đặt eppendorf phải đối xứng máy ly tâm (hình 6) Trong trường hợp số lượng ống eppendorf lẻ, cần phải thêm ống khác có trọng lượng tương đương làm đối trọng + Sau ly tâm, nhẹ nhàng lấy mẫu khỏi máy ly tâm đặt vào giá để eppendorf Lúc ống eppendorf có phân pha bao gồm: pha dung dịch, pha phần cặn xác tế bào pha dung dịch chứa DNA hòa tan LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Dùng micropipette 200 µl hút nhẹ nhàng 300 µl dung dịch pha sang ống eppendorf 1,5ml vô trùng Chú ý: không hút phần cặn tế bào pha Tốt khơng nên hút hết tồn phần dung dịch pha C Bước 3: Kết tủa DNA + Bổ sung vào eppendorf 50 µl CH3COONa 3M (pH5.5) 300 µl isopropanol Dùng micropipette 200 µl đảo trộn toàn khối dung dịch ống eppendorf Lưu ý: dùng micropipette hút lên xuống khối dung dịch thật nhẹ nhàng với tốc độ chậm để tránh dung dịch bị bắn + Ly tâm nhẹ để khối dung dịch lắng xuống phía ống eppendorf + Đặt eppendorf chứa mẫu DNA vào tủ lạnh -20oC 2h + Sau h, lấy eppendorf chứa mẫu khỏi tủ lạnh, ly tâm 10.000 vòng/phút 30 phút + Sau ly tâm, dùng micropipette cẩn thận loại bỏ toàn phần dung dịch sau cho không hút phần cặn DNA bám đáy ống eppendorf (màu trắng đục) Sau hút phần dung dịch lần thứ đặt eppendorf vào máy ly tâm ly tâm 10.000 vòng/phút phút để toàn phần dung dịch bám thành ống di chuyển xuống phía đáy ống hút loại bỏ hồn toàn phần dung dịch D Rửa kết tủa DNA + Bổ sung vào eppendorf 1000 µl dung dịch cồn 70% đảo trộn mạnh máy vortex cho phần cặn DNA long khỏi đáy ống + Ly tâm 10.000 vịng/phút phút Dùng micropipette 200 µl hút loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% khỏi ống Ly tâm ống 10.000 vòng/phút phút Loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% khỏi ống lần + Mở nắp eppendorf để khô tự nhiên kết tủa DNA eppendorf khơng cịn mùi cồn khơ hồn tồn (khoảng 10-15 phút) nơi sạch, thống, khơng có người qua lại Tốt để khô tự nhiên kết tủa DNA tủ Hood E Hòa tan DNA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Bổ sung vào eppendorf chứa kết tủa DNA 100 µl dung dịch đệm TE 1x đảo trộn máy vortex Ủ eppendorf 70oC 10 phút máy lắc ổn nhiệt F Kiểm tra sản phẩm tách chiết điện di gel agaro Kết thu nhóm 1: Hình 1: Điện di tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E.coli Nhận xét: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, khơng có DNA bị đứt gãy, nhiên lượng DNA thu nên vạch khơng sáng rõ, cịn mờ, ngồi cịn tạp chất protein, không bị lẫn RNA, mẫu số thành cơng nhất, sau mẫu số 2,7,8 chấp nhận được, mẫu lại tương đối, mẫu số 3,4,5 lẫn tạp nhiều protein - Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, khơng có DNA bị đứt gãy, nhiên lượng DNA thu nên vạch khơng sáng rõ, cịn mờ, ngồi cịn tạp chất protein, khơng bị lẫn RNA - Giếng số 2:Lượng DNA thu ( hình ảnh bị mờ nên khơng nhận xét DNA có bị đứt gãy khơng), ngồi bị lẫn tạp chất protein bị dính miệng giếng RNA cuối đường chạy điện di - Giếng số 3: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, nhiên lượng DNA thu nên vạch khơng sáng rõ, cịn mờ, ngồi lẫn tạp chất protein RNA, DNA bị đứt gãy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA không bị đứt gãy, nhiên lẫn tạp nhiều protein RNA cuối đường chạy điện di - Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA không bị đứt gãy, nhiên lẫn tạp nhiều protein RNA cuối đường chạy điện di - Giếng số 6: Tách chiết DNA tổng số thành công, DNA không bị đứt gãy, không lẫn RNA protein - Giếng số 7: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu ít,( hình ảnh bị mờ nên khơng nhận xét DNA có bị đứt gãy khơng), ngồi bị lẫn tạp chất protein bị dính miệng giếng RNA cuối đường chạy điện di - Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu ít,( hình ảnh bị mờ nên khơng nhận xét DNA có bị đứt gãy khơng), ngồi bị lẫn tạp chất protein bị dính miệng giếng RNA cuối đường chạy điện di - Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu ít,( hình ảnh bị mờ nên khơng nhận xét DNA có bị đứt gãy khơng), ngồi bị lẫn tạp chất protein nhiều bị dính miệng giếng, nhiên giếng khơng bị lẫn RNA IV Giải thích Ngun lí trình tách chiết phá vỡ tế bào vi khuẩn E.coli: - Phá vỡ tế bào , màng tế bào mô - Loại bỏ tạp chất DNA ( Protein, lipid, đường…) - Phá vỡ tế bào cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh để phá vỡ liên kết, lực học đảo trộn máy vortex - CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào Màng tế bào lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hịa tan Trong dung dịch đệm có thành phần: - Tris- HCl: ổn định pH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - EDTA: Có lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+ canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động - Khi bổ sung CTAB ủ 65ºC 1h 10 phút đảo trộn lần - CTAB hoạt động mạnh hiệu nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh có lực học tác động vào ( CTAB hoạt động trường hợp có NaCl) - CIAA bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ protein thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB - Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ trợ khả kết tủa protein, hỗ trợ phân pha Sau bổ sung CIAA ly tâm có tượng phân pha ( pha) + Pha : Là DNA + Pha giữa: Chứa protein + Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào dung dịch chloroform - CH COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả hòa tan DNA, bổ sung isopropanol kết tủa DNA, phân tách thu DNA ( CH3 COONa, CH COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn) - Rửa tủa cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa DNA bị hịa tan nước khơng hịa tan cồn Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan cồn 70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa protein cậy rửa tủa cồn xong hút hết hết cồn làm bay hết cồn Nếu cịn cồn làm biến tính enzyme khơng thực phản ứng sinh học phân tử - Hòa tan DNA TE 1X nước khử ion, nước khử ion TE 1X hịa tan tủa DNA sử dụng nước khử ion rửa tủa TE 1X hiệu bảo quản lâu, TE bảo quản tốt có chứa EDTA lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme giúp bảo quản lâu Hạn chế TE có có mặt EDTA ức chế enzyme phản ứng sinh học phân tử sau Cho nên sử dụng TE nồng độ lỗng, khơng ức chế phản ứng sinh học sau Sử dụng TE 1X LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Phương pháp định lượng acid nucleic sử dụng phổ biến phương pháp quang phổ tính tiện dụng số tin cậy mức cho phép II THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1 Thiết bị, dụng cụ - Máy đo OD bước sóng 260 280 nm - Pipet - Đầu tip loại - Cuvet 2.2 Hóa chất cách pha hóa chất - Nước khử ion III CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên lý Nguyên lý phương pháp dựa hấp thụ tia tử ngoại bước sóng 260 nm base Một dung dịch chứa nhiều acid nucleic, hay nói cách khác nồng độ acid nucleic cao, hấp thụ nhiều ánh sáng Do nồng độ acid nucleic tính theo tương quan giá trị mật độ quang học bước sóng 260 nm (Optical Density260nm - OD260) Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 µg/ml dung dịch chứa DNA mạch kép 40 µg/ml RNA DNA mạch đơn 3.2 Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị cuvet - Lấy cuvet khỏi dung dịch bảo vệ Rửa nước cất lần Bước 2: Chuẩn bị blank - Lấy ml nước khử ion cho vào cuvet Bước 3: Bố trí dãy pha lỗng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Lấy ml nước khử ion cho vào cuvet khác, theo thứ tự 1,2,3 Lấy 20 µl DNA cho vào cuvet thứ nhất, trộn pipet Lấy 20 µl từ cuvet thứ cho sang cuvet thứ 2, trộn Lấy 20 µl từ cuvet thứ hai cho sang cuvet thứ 3, trộn Bước 4: Đo OD máy - Chọn chế độ đo OD 260/280 - Đưa cuvet blank vào, chuẩn hóa - Lần lượt đưa cuvet 1,2,3 vào đo OD, ghi lại kết Bước 5: Tính tốn kết luận - Từ số liệu thu được, tính tốn nồng độ DNA dung dịch gốc cách nhân với 1000 - Dựng đường chuẩn với điểm - Kết luận độ DNA dựa số OD260/280 IV Nhận xét: Đã sử dụng mẫu 16 ( tách DNA tổng số thành công) để tiến hành , nhiên nhân tố chủ quan nên mẫu không cho kết 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Điện di DNA gel agarose kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc axít nucleic đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường chúng di chuyển cực dương điện trường II THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1 Thiết bị, dụng cụ - Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá bể điện di, lược tạo giếng điện di, khay thăng nhờ giọt nước đổ gel - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt để đun agarose - Lị vi sóng - Ống eppendorp loại ml - Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm gel - Máy lắc - Máy soi gen - Máy chụp ảnh (nếu có) 2.2 Hóa chất cách pha hóa chất - Agarose - TAE 1X TAE 1X pha từ TAE 50X stock bao gồm: + 242 gam Tris base (FW = 121) + 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng) + 100 ml EDTA (pH = 8) + Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít Khi pha 1X cần ml dung dịch 50X stock + ml nước cất - Ethydium Bromide Solution nhuộm nồng độ 0,5% (0,5 μl/ml) 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Dye 6X Dye 6X pha lỗng từ Dye 10X Trong 10X sample buffer stock bao gồm: 50% glycerol, 0,25% bromophenol, 0,25% xylene cyanole FF pha x TAE buffer Ví dụ: Để pha 10 ml Dye 10X cần: + 5ml glycerol + 0,25% x 10 gam bromophenol + 0,25% x 10 gam xylene + Còn lại x TAE 10 ml Dye 6X pha từ ml Dye 10 X + ml nước cất III NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 3.1 Nguyên lý Dựa vào đặc tính cấu trúc axít nucleic đại phân tử tích điện âm đồng khắp bề mặt nên chịu tác động điện trường chúng di chuyển cực dương điện trường 3.2 Các bước tiến hành - Bước 1: Pha 0,8 gam agarose 100 ml TAE 1X, đun sôi lị vi sóng Lưu ý đun bình chịu nhiệt có nắp khơng đậy nắp kín, đun cốc thủy tinh nên đổ khoảng phần thể tích cốc nhằm tránh tràn sơi Đun sơi để nguội đến 60oC (khi dùng tai cầm bình đựng agarose được) tiến hành đổ gel - Bước 2: Trước đổ gel cần lau giá đổ giấy thấm mềm dễ hút nước sau cài lược Lược tạo giếng đặt phía cực âm bể điện di Tiến hành cân mặt phẳng giá bể giọt nước giá Đổ gel, gel thực hành có kích thước dài 10 cm, rộng 6,5 cm cao 0,4 cm Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa 0,8 μl mẫu Do gel cần đổ 50 ml Đợi khoảng cho khô tháo lược (hình 10) - Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE linh động thay đổi để phù hợp đặt gel bể - Bước 4: Đặt gel (hình 10) vào bể điện di, lưu ý thêm hay bớt dung dịch TAE 1X, để gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung dịch điện di - Bước 5: Lấy 10 μl mẫu DNA tách chiết trộn với 2μl Dye 6X ống eppendorp (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA trộn với Dye 6X Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ống vào giếng điện di 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com micropipet Ghi chép lại thứ tự ống mẫu tương ứng với thứ tự giếng Mỗi ống mẫu dùng đầu côn hút riêng Khi tra mẫu vào giếng, tay tỳ lên thành giá điện di làm điểm dựa, tay đưa micropipet cho đầu côn vừa sát miệng giếng bơm từ micropipet Cần lưu ý thao tác không cẩn thận làm tràn giếng vỡ miệng giếng - Bước 6: Chạy điện di điện 100V 30 phút (hình 12) Lúc quan sát mắt thường thấy hỗn hợp mẫu giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương Trên hình 12 điên di Power station - 300 hãng Labonet Mỹ sản xuất năm 2002 - Bước 7: Lấy gel từ bể điện di nhuộm ethydium bromid 0,5μl/ml 10 phút, thao tác nhuộm thực máy lắc, tốc độ chậm, khoảng 50-70 vòng/phút Lưu ý mang gel nhuộm cần cẩn thận ethydium bromid độc hại với người mơi trường Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng thìa to, dạng bản, có cán dài (hình 13) để đưa gel vào khay nhuộm, lấy khỏi khay, mang rửa lại nước sạch, đến đưa gel lên máy soi - Bước 8: Soi gel máy tia tử ngoại, axít nucleic gel agarose hình tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium bromid Chất có khả xen gắn vào bazơ axít nucleic làm chúng phát sáng dạng vạch màu đỏ cam, dễ quan sát chụp ảnh IV Nhận xét: - Điện di xác định độ tinh sạch, nguyên vẹn DNA định tính ( có hay khơng, nhiều hay ít, sáng hay mờ) Băng sáng nhiều, băng mờ - Xác định độ tinh sạch: Lẫn tạp protein, RNA, protein điện tích khơng rõ ràng thường bám vào DNA - Độ ngun vẹn hồn tồn khơng có nghĩa tồn đoạn DNA mà dải đứt gãy lớn đảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng) 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài KỸ THUẬT PCR I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích PCR (Polymerase Chain Reaction) lần Karl Mulis mô tả năm 1984 Phản ứng chuỗi polymerase kỹ thuật đơn giản cho phép nhân nhanh trình tự DNA lên nhiều lần vài PCR thực có khn, Taq-polymerase, mồi chun biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm ion Mg2+ PCR công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen, có khả tạo lượng lớn trình tự DNA đặc hiệu từ thể II DỤNG CỤ HÓA CHẤT 2.1 Dụng cụ - Lị vi sóng - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt 500 ml - Ống PCR - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy PCR - Bộ điện di - Máy soi gen 2.1 Hóa chất thành phần phản ứng PCR - Enzyme Taq polymerase - Buffer PCR - MgCl2 PCR - Nước cất khử ion - Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi “sens primer” hay “forward primer” mồi ngược “antinsens primer” hay 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com “reverse primer”, chúng đoạn DNA mạch đơn ngắn (olgonucleotide) có khả bắt cặp bổ sung với đầu 3’ theo chiều phiên mã gen - dNTP gồm loại: dATP, dTTP, dCTP dGTP - Ethydium bromid III CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên lý Phản ứng chuỗi polymerase kỹ thuật đơn giản cho phép nhân nhanh trình tự DNA lên nhiều lần vài PCR thực có khn, Taq-polymerase, mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxyribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm ion Mg2+ 3.2 Các bước thực - Bước 1: Trộn thành phần nêu ống eppendorp loại 1.5 ml đưa vào ống PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm tốc độ nhẹ (spin) 3000 vòng/phút Bước nhằm để thành phần nêu lắng xuống đáy ống PCR Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR sau: TT Thành phần phản ứng Hàm lượng (µl) 10x Buffer 2,5 25 mM MgCl2 1,5 Primer F 1,0 Primer R 1,0 100 µM dNTPs 1,5 5U DNA taq polymerase 0,2 DNA khuôn 2,0 H2O khử ion 15,3 Tổng 25 Bước 2: Chạy PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: - Biến tính ban đầu: 94oC phút - Khuếch đại: 35 chu kỳ gồm bước: 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com + Biến tính: 94oC 30 giây + Gắn mồi: 55oC 30 giây + Kéo dài: 72oC 45 giây - Kéo dài cuối cùng: 72oC phút - Ủ bảo quản: 4oC ∞ Dưới mô tả cách vận hành máy PCR - System - 9700 hãnh Applied Biosystem Mỹ sản xuất năm 2002 - Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen phương pháp điện di agarose 1% 40 phút - Bước 4: Nhuộm gel ethydium bromid 10 phút - Bước 5: Soi chụp ảnh (Sử dụng bước 2) IV Kết thu được: Nhận xét: Mẫu thành công, mẫu không thành công 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Sản phẩm PCR dùng cho thí nghiệm Điều kiện tiên sản phẩm PCR phải sạch, không lẫn sản phẩm phụ khơng cịn sót thành phần khác PCR enzyme, muối, dNTP Bài thực hành thực thao tác tinh sản phẩm PCR phương pháp cho qua cột II CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên tắc Một số thí nghiệm giải trình tự gene cần nguồn DNA có độ tinh khiết cao Tinh qua cột cách làm phổ biến để đáp ứng yêu cầu Bài thực hành dựa nguyên lý sắc ký chọn lọc kích thước Dung dịch chứa DNA hịa tan chảy qua mạng lưới cấu tạo lỗ nhỏ hạt hấp thụ Các phân tử nhỏ muối nucleotide riêng lẻ chui vào hạt hấp thụ, phân tử lớn phân đoạn acid nucleic qua lỗ Đây phương pháp nhanh đơn giản để tinh acid nucleic 3.2 Quy trình tinh sản phẩm PCR Bước 1: Chuẩn bị mẫu cột - Bổ sung lần thể tích Buffer PB vào thể tích sản phẩm PCR Trộn pipet Ví dụ: bổ sung 200µl Buffer PB vào 20 µl sản phẩm PCR - Đặt cột vào ống chứa ml Bước 2: Bám DNA lên cột - Chuyển hỗn hợp DNA bước lên cột micropipette 500 ml - Ly tâm 12.000 vòng/phút phút - Loại bỏ dung dịch ống thu ml Bước 3: Rửa trôi thành phần không mong muốn - Bổ sung 750 µl Buffer PE lên cột Ly tâm 10,000 vòng/phút 30 giây Chuyển cột sang ống eppendoft 1.5 ml Loại bỏ cột thu ml 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bước 4: Đẩy DNA khỏi cột thu nhận - Dùng micropipette 100 µl để nhỏ 20 µl Buffer EB vào màng - Ly tâm 12,000 v/p phút - Loại bỏ cột Bước 5: Kiểm tra sản phẩm tách chiết điện di gel agarose IV Kết quả: Mẫu không lên sản phẩm , lỗi hóa chất thao tác trình thực 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bài CẮT DNA BẰNG ENZYME GIỚI HẠN I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Endonuclease giới hạn hay gọi enzyme giới hạn enzyme có khả nhận biết trình tự DNA đặc hiệu phá vỡ liên kết phosphodiester Bài thực tập cho phép sinh viên sử dụng enzyme giới hạn HindIII để cắt vector pRSET-A từ dạng mạch vịng thành dạng mạch thẳng II DỤNG CỤ HĨA CHẤT 2.1 Dụng cụ - Bể ổn nhiệt - Ống eppendoft 1.5 ml - Micropipet loại - Máy ly tâm - Bộ điện di - Máy soi gen 2.1 Hóa chất thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn - Enzyme giới hạn ECoRI - Buffer - Plasmid pRSET - Nước khử ion - Và bao gồm toàn thành phần điện di III CÁCH TIẾN HÀNH 3.1 Nguyên lý Endonuclease giới hạn hay gọi enzyme giới hạn enzyme có khả nhận biết trình tự DNA đặc hiệu phá vỡ liên kết phosphodiester Enzyme giới hạn ECoRI có vị trí nhận biết vector cắt vector bị chuyển từ dạng mạch vòng sang dạng mạch thẳng phân biệt gel điện di 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2 Các bước thực - Bước 1: Trộn thành phần nêu ống eppendorp loại 1.5 ml, cho vào máy ly tâm tốc độ nhẹ (spin) Bước nhằm để thành phần nêu lắng xuống đáy ống Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt enzyme HindIII: TT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 10x Buffer 1,5 Plasmid pRSET 2,5 ECoRI 0.5 H2O 1,0 Tổng 15 - Bước 2: Ủ phản ứng 37oC 1h để enzyme hoạt động - Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen phương pháp điện di agarose 1% 40 phút IV Kết quả: Nhận xét: Cắt enzyme giới hạn thành công, cắt sau điện di cho ta hình ảnh vạch chứng tỏ enzyme đã cắt plasmid thành công ( Giếng số 2,3 5,6) 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... THÍ NGHIỆM Mục đích Điện di DNA gel agarose kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc axít nucleic đại phân tử tích điện âm đồng khắp... bảo vệ DNA khỏi phân hủy enzyme giúp bảo quản lâu Hạn chế TE có có mặt EDTA ức chế enzyme phản ứng sinh học phân tử sau Cho nên sử dụng TE nồng độ lỗng, khơng ức chế phản ứng sinh học sau Sử dụng... trúc bao bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Điều quan tâm thu nhận phân tử DNA trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy Cách pha hóa chất - Dung dịch đệm CTAB: + CTAB