Y sinh học phân tử thực hành bài 3 kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong chẩn đoán một số bệnh không truyền nhiễm DHQ

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Y sinh hoc phan tw

TS Duong Hong Quan

Trang 2

Bài 3: Kỹ thuật sinh học phần tử ứng

dụng trong chân đoán một số bệnh không truyền nhiễm

Trang 3

Chuan dau ra bai hoc

Sau khi hoc xong, sinh vién co kha nang:

1.T6m tắt nguyên lý và ứng dụng của một sô kỹ thuật SHPT ứng

dụng trong chân đốn bệnh khơng truyền nhiễm

2 Trình bày được các bước của kỹ thuật

3 Phân tích đúng kết quả

Trang 4

Bệnh không truyên nhiễm

4 Quy trinh tach chiét DNA/RNA

+ Kỹ thuật xác định tang biéu hién HER2

+ Kỹ thuật xác định đột biên EGFR

Trang 5

Quy trình tách chiết DNA/RNA

Trang 6

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG \ —> Ge —:‹ `_ — = —> ` rahe _ Ss y I Biopsy FFPE DNA Extraction Storage Processing ‘sontitcnilion |

DNA Quantity & Quality

Trang 10

Phương pháp cột lọc

Mini spin column—NucleoSpin totalRNA FFPE

Mini spin column elution volume 3 Ỗ 3 ỗ 30-50 HỈ Paraffin

Paraffin Dissolver Lysis and x

ramoval removal decrossinking „4 RNA/ = nau ~~ RNA _ "

3 ) \ DNA “— digestion —— washing Ce elution binding XS column elution volume 5-30 pl {> a ồ

XS column—NucleoSpin totalRNA FFPE XS

Trang 11

Phương pháp sử dụng hạt từ

++ Material <® DNA @ Magnetic beads

Add Magnetic Magnetic Bound DNA is Wash w/ Aiute DNA in Purified DNA Particles to Particles Bind Separated from Ethanol to Aqueous Buffer Transferred to Lysed Cells to DNA Sample with Remove Clean Tube

Magnet non-DNA Material

Trang 12

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Quy trình định lượng DNA/RNA + * Phương pháp quang phô +

s* Phương pháp huỳnh quang

Trang 14

DNA template

Trang 16

Bộ sinh phẩm tách DNA/RNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Trang 18

Kỹ thuật xác định tăng biểu hiện HE.R2

Trang 19

“2Đâu ân sinh học và chân đoán tiên lượng bệnh

“Screen for disease

Biomarker

Trang 20

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG =Đâu ân sinh học và chân đoán tiên lượng bệnh + +» Dấu ân tiên lượng bệnh (Prognostic marker) +

+» Dâu ân chân đoán/dự báo bénh (Predictive marker)

Trang 21

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Dâu ân tiên lượng bệnh + +» Tiên lượng tiên trình phát triển bệnh +

+ Tiên lượng hiệu quả điêu trị bệnh

Trang 22

Dâầu ân chân đoán/dự báo lượng bệnh

+

+» Chân đoán/dự báo tiễn trình phát triển bệnh

+ *» Chấn đốn/dự báo pháp đơ điêu trị bệnh

Trang 23

——Dang dau an sinh hoc va chan đoán tiên lượng bệnh

s* Biéu hién gen

s* Nhân gen

@ “? @

¢ Giai trinh tu gen

Trang 27

hương pháp xác định dau 4n sinh hoc

s* Biéu hién protein

Colored Product : ee: “===; Substrate | Peroxidase or © Go | Alkaline Phosphatase ; ® ` : Substrate Je

Substrate, @ @, — | Secondary Antibody \ OG 2% Substrate

| i Substrate yr Secondary Antibody ae i é HE | € Conjugate Antigen

| Primary Antibody

Primary Antibody

19 @ Axe (comm Antibody

(go _ Fixed Cell Tissue DIRECT ELISA INDIRECT ELISA SANDWICH ELISA COMPETITIVE ELISA

Proteins

IHC ELISA

Trang 30

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG va diéu tri ung thư

Trang 31

Esophagus 0-50 \ %

Trang 32

Trang 33

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG HER2 và điêu tri ung thư HER2 is overexpressed in ~ = 25% of breast cancers Normal (1x) ~ 25,000-50,000 HER2 receptors Overexpressed HER2 (10-100x) up to ~ 2,000,000 HER2 receptors

Pegram MD, et al Cancer Treat Res 2000;103:57-75

Ross JS, et al Am J Clin Pathol 1999;112(supp! 1):S53-S771 Slamon DJ, et al Science 1987;235:177-182

Excessive cellular division

Trang 34

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG HER2 và điêu tri ung thư + + Thời gian sông ngăn hơn +

+ Tái phát sớm hơn sau điêu trị băng hóa trị liệu

* Quyết định pháp đô điều trị với thuốc điêu trị

trang dich HER2

Trang 35

HER2 gene amplification 5, SA m— “HER2prfotdn < 0Y€TCXIDTCSSIDH,.2 eee Pe Lee ek - : Ss ' Fi ped f x la Shortened median survival*

HER2 positive 3 years

Trang 36

Cumulative probability _ © © = ` ƠI 0.50 0.25

Trang 39

Trang 41

HER2 HER2 ER2 HER2

SCORE 0 SCORE 1+ SCORE 2+ SCORE 3+

2:

;= An O T— " aN

Not Amp = Equivocal Amp

a SS” =>

| Spectrum of HER2-low carcinomas

No benefit from anti-HER2 agents, lack = Possible benefit from new generation of ADCs oettaching to the HER2 receptors Benefit from anti-HER2 agents blocking addition

of HER2 expression and HER2 pathway present on the cell membrane and then delivering the chemotherapeutic to HER2 pathway hyperactivation stemming

Trang 42

FISH positive

Trang 44

HER2 va điêu trị bệnh nhân ung thư

HE DINA (Target for SH) | ; HER2 Protein (Target for IHC)

Trang 45

Thuốc diéu tri trang dich HER2

Khang thé don dong Thuốc điêu trị trúng dich

° lrastuzumab ° LapatinIb

° Pertuzumab ° Neratinib

° “A do- Trastuzumab'” © Tucatinib

Trang 46

Trang 47

Trastuzumab

HER2 epitopes recognized by hypervariable murine sequences

Trang 48

Lapatinib

Phospholipid cell membrane

Trang 49

Kỹ thuật xác định đột biến EGFR

Trang 50

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG EGFR (Thu thé yéu t6 tang trưởng biểu bì) HER family IR, IGF-1R, cMet pY980 IGF-1R =) pIGF-1R = J pcMET IRS-1

V600E BRAF pIRS-1

Trang 51

7p11.2

Trang 52

TRUGNG DAI HOC Y TE CONG CONG

` Quy trình xét nghiệm PCR

Trước XN ¬ 2 - - Bệnh phẩm xét nghiệm

Nhận bệnh phầm, hồn ; P ¬ 5

thành thủ tục — Kết quả giải phầu bệnh

— Hóa đơn thanh toán

Ngày 1 Tach DNA - Ủ mẫu loại paraffin (16 giờ, qua đêm)

— PCR/ - Tách DNA (1,5-2 giờ, tùy số lượng mẫu ( 9 5 Ọ y ° ° )

real-time PCR — Thiét lap phan wng (0,5 gid)

Ngày 2 - Chạy máy (1,5 giờ cho mỗi loại xét nghiệm)

Phân tích, og , — Phan tich bang phan mém (thoi gian phu thuộc mỗi loại XN,

in ket qua `

số lượng mầu)

— In, ký kết quả, xin duyệt lãnh đạo

Trang 53

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG — Quy trình xét nghiệm PCR + Mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm sinh thiết hoặc phẫu thuật (từ u nguyên phát, hạch di căn, cơ quan di căn xa ) Bệnh phẩm huyết tương

> Bệnh nhân già yếu, không đủ sức khỏe để sinh thiết

> Bệnh nhân có u ở vị trí không thể sinh thiết

> Bệnh nhân không còn u sau một thời gian điều trị

> Bệnh nhân không đông ý sinh thiết

Trang 54

TRƯỜNG ĐAI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

= Quy trinh xét nghiém PCR

Trang 55

s* Mâu bệnh phâm

Tế bào ung thư

không đột biên

Tế bào ung thư

Trang 56

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG

= Quy trình xét nghiệm PCR

+ Mẫu bệnh phẩm: Số lượng tế bào khối u

Tế bào Tế bào Tế bào ung thư Tế bào ung thư

không đột biên mang đột biên

bình thường ung thư

| > <

Trang 57

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG = Cân thiệt phôi hợp trong quy trình xét nghiệm Trả KỌ cho BS Giải Phẫu Bệnh Phân tích kết quả trả lời Bệnh nhân _è

Bệnh nhân BS Nội hô hấp / Ung

Trang 58

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG SE Quy trình xét nghiệm PCR * Phương pháp xét nghiệm trên mẫu mô StripAssay > ÿ—-ÿ —- lỆ-= Ƒ Loại Phá Cố định

paraffin mang DNA DNA Biotin

Tach DNA San pham PCR > sen | San pham mau | ¬ = Lai với << =————— dau do DNA CG®>==———, 22 N

PCR dac hiéu alen

Trang 59

Quy trình xét nghiệm PCR

,#@

>

Isolate cfDNA using commercial kits (Qiagen, Promega, Norgen)

Streck tubes are recommended for blood collection 3 qPCR Analysis ———“-» ————* Centrifuge Collect Plasma Can be stored at -20°C n8 đ ‹ \ j Set up qPCR Run gPCR And Analyze Data Standardized

Reporting cobas ® DNA Sample Preparation Kit

Trang 60

` Độ nhạy, đặc hiệu tronø xét nghiệm đột biên øen EKGFR huyết tương

+ Vận chuyển mẫu làm xét nghiệm EGFR huyết tương

NSCLC patients (n=49)

|

Automated DNA extraction (1.5 mL) Automated DNA extraction (1.5 mL) EGFR mutational status (qPCR) EGFR mutational status (qPCR)

Cobas ® EGFR Mutation Test v2 Cobas ® EGFR Mutation Test v2

| |

Invalid EGFR Wild type EGFR mutated EGFR Wild type EGFR mutated Invalid 2 patients 37 patients 10 patients 34 patients 12 patients 3 patients

l | L 1 J

Concordance / Sensitivity / Specificity / PPV / NPV

Trang 61

Trang 62

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	3,43 MB