Y sinh học phân tử thực hành bài 2 ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán một số bệnh di truyền DHQ

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Y sinh hoc phan tw

TS Duong Hong Quan

Trung tam Xét nghiém, Truong Dai hoc Y té cong cong

Trang 2

ài 2: Ứng dụng kỹ thuật PCR trong

“thân đốn một sơ bệnh di truyên

Trang 3

TRUGNG DAI HOC Y TE CONG CONG

Chuan dau ra bai hoc

Sau khi hoc xong, sinh vién co kha nang:

1 Tóm tắt nguyên lý và ứng dụng của một số kỹ thuật SHPT ứng

dung trong chan đoán một số bệnh di truyền

2 Thực hiện được kỹ thuật tách DNA, biến thể của PCR, điện di

3 Phân tích đúng kết quả

Trang 4

Bệnh di truyền

+ Chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể

+ Chân đoán bất thường øen

Trang 5

Chân đoán bất thường nhiễm sắc thể

Trang 7

Trang 8

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG òng ngừa dị tật bâm sinh và di truyền sàng lọc di truyền phôi trước làm tổ ` sàng lọc ` `

trước hôn nhân "~ _ sàng lọc sơ sinh

Trang 9

John Langdon Down

Trang 11

Sàng lọc, chân đoán trước sinh

Trang 12

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG

Combined test

Thai 11 tuan-—13tuan6ngay (CDDM: 45 — 84mm)

DOUBLE TEST NT COMBINED

PAPP-A +free bhCG Nuchal Translucency TEST

90%

Trang 13

lriple test

Thai 14 tuần — 20 tuần 6 ngày (ĐKLĐ: 26 — 49mm)

Trang 14

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Combined test

Họ tên: NGUYEN THI LE Ngày sinh: 26/05/1988

Địa chỉ: TIÊN GIANG Tuôi lúc sinh: 31.46

BS chỉ định: Só HS nơi gửi:

Hút thuốc lá: không Tiêu đường: Khôn Chủng tóc: Châu Á Số thai: 1

Tuôi thai: 11 tuần 4 ngày [can nặng 40 kg | Ngày lắy mẫu: 24!04i2019 CRL: 52mm (24/04/2019)

KÉT QUÁ

Xét nghiệm Nồng độ MoM hiệu chính

free BhCG 120 ng/mL 1.55

NT (Nuchal Translucency) 1.5 mm 1.10 - -

PAPP-A 1005 mU/L 0.26 | PAPP-A giảm rât thâp

PHƯƠNG PHÁP Miễn dịch huỳnh quang kéo dài AuftoDEL FIA và LifeCycle (Perkin Elmer)

ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ TRISOMY

Hội chừng Down (Irisomy 21)

Kết quả: NGUY CƠ CAO

Nguy cơ theo tuổi thai phụ 1/802 Cưoff 1/250†— — — — ăn

Nguy cơ theo xét nghiệm 1/226

Nguy cơ Hội chứng Down 1/226 có nghĩa là trong 226 thai phụ = tuổi T24

có thể có 1 thai phụ sinh con có hội chứng Down 1802 1/226

ĐÊ NGHỊ CHỌC ÓI HOẠC XÉT NGHIEM NIPT KIEM TRA

Trang 15

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Combined test

Ho tén: VO TH! THUY Ngày sinh: 08/03/1991

Dia chi QUÂN 1 Tuổi lúc sinh: 28.64

BS chỉ định: Sá HS nơi gửi:

Hút thuốc lá: không Tiếu đường: Không Chùng tộc: Châu À Số thai: 1

| Tuổi thai: 13 tuần 4 ngày | Cân nặng 45 kg Ngảy láy mẫu: 24/04/2019 CRL: 80mm (24/04/2019)

KÉT QUÁ

Xét nghiệm Nẵng độ MoM hiệu chính

free BhCG 120 ng/mL | 2.55 | Fb HCG tang cao

NT (Nucha! Translucency) 1.5 mm 0.86 PAPP-A 1005 mU/L 0.14

PHUONG PHAP Mién dich huynh quang kéo dai AutoDELFIA va LifeCycle (PerkinElmer)

ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ TRISOMY

Hội chứng Down (Trisomy 21)

Kết quả: NGUY CƠ CAO Nguy cơ theo tuếi thai phụ 1/1107

Nguy cơ theo xét nghiệm 1/87 Cưof 1250 — — — — — =

Nguy cơ Hội chứng Down 1/87 có nghĩa la trong 87 thai phụ Th eotudi 121

có thé cé 1 thai phụ sinh con có hội chứng Down 1/1107 1/87

ĐÈ NGHỊ CHOC ÓI HOẠC XÉT NGHIỆM NIPT KIEM TRA

Trang 16

Bo me binh thường, con Trisomy: LA a _ Hisjunction W wD Meiosis ‘@ II Fertilization Normal YP -(| ' ` 4 ' Wot Meiosis Q \ Fertilization

95% HC Down do đột biên NST ngẫu nhiên

90% trong quá trình tạo trứng, 10% tạo tinh trùng

GAN KET — PHAT TRIEN — HOI NHAP

Trang 17

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG A Bo mẹ bình thường, con Trisomy? | + Trisomy

Robertsionan Translocation —- Chuyển đoạn hòa nhập tâm

Trang 20

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Choc hut dich 61 Ultrasound probe ‘Syringe Bladder `s Nagina >> ° ` ! = Ñ S 1 Placenta | 7 Womb * Amniotic fluid ¬ SẺ _ `Cenix ` (entrance to womb) ©RCOG ‘Rectum

Thai 16 — 20 tuần, Dễ thực hiện

Nguy cơ say thai do thủ thuật: thâp < 0,5% Nhược điêm: thai lón

Trang 21

Mâu dịch ôi

Trang 22

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG Kỹ thuật xét nghiệm chân đoán trước sinh Số lượng NST Xóa vi đoạn Số lượng NST Lo VÀ 9 Xóa vi đoạn Thực hiện 1 LÀN FISH Prenatal | | BoBs Số lượng NST -

Hoặc 1 Xóa vi đoạn Chân

Thực hiện riêng biệt đoán

trước sinh

Karyotype Ỉ Array CGH

Cấu trúc đại thê +

sô lượng NST Khảo sát toàn bộ NST

ở mức độ gen

Trang 23

Karyotype

1 NUOI CAY TE BAO

Cáy ối 14 ngày

Theo dõi tế bào phát triển Thay môi trường nuôi cấy

Thất bại: nắm, không mọc

Trang 25

Karyotype

Sees 2 THU HOACH, LAM TIEU BAN

———— Ihu hoạch, Giữ tế bào ở ky giữa

' thích hợp (NST co lại vừa phải)

Trang 26

Karyotype

; A | lự

3 Lập bộ nhiễm sắc thê

Chụp hình cụm kỳ giữa trên kinh hiền vi (~ 50 mitose)

Phân tích trên máy tính, xếp bộ > In và trả kết quả

Trang 31

Trisomy 18, hoi chung Edwards

Trang 35

Short stature Characteristic facial features Low hairline Fold of skin | _ Constriction Shield-shaped = _-_-— | of aorta thorax e Poor breast

Trang 37

Trang 41

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Karyotype (Uu diém + Tiêu chuẩn vàng + Phát hiện sớm bất thường sô lượng, khảm, câu trúc NST lon (>4Mb)

+ Loại bỏ tê bào ngoại nhiêm

Trang 42

+ Tôn công sức

+ Không phát hiện được bất thường < 4Mb

+ Không kết luận được vì hình ảnh không rõ

+ Nguy cơ cay té bao that bai

Trang 44

Kỹ thuật FISH

+ Khảo sát nhanh số lượng NST hoặc 1 đoạn NST

+ Năng suât kém, không loại trừ được ngoại nhiễm máu mẹ

Trang 45

Trang 46

Kỹ thuật FISH

Trang 47

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Kỹ thuật QE-PCR Khuéch dai cac locus STR (dac hiéu cho NST) —— — 2 alen (1:1) = | | disomy ea_ Se — -4- G ——= 3 alen (1:1:1) eo => trisomy Gee „ 3 alen (2:1) OS eee ee CL = trisomy

Khuéch dai cac locus Tín hiệu NST trên biểu đồ điện di

Trang 48

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Kỹ thuật QE-PCR 1 2 3 4 5 vn LH oy te eT crn | = TT

+ Dich 6i 2mL, tach DNA bang cét loc (Qiagen)

+ Multiplex PCR: 2 PCR mix = 28 marker > PCR thu 3 néu khéng du

thong tin dé két luan (Devyser Complete va Resolution)

+ Phan tach doan DNA bang dién di mao quan: ABI 3500

+ Phân tích kết qua bang GeneMarker (SoftGenetics) + Đối chiếu kết quả voi karyotype

Trang 50

Trang 55

+ fy >

> âđ A

K-PCR u diem

+ Phát hiện được ngoại nhiễm máu mẹ

+ Nhanh, chính xác, năng suất cao

- Độ đặc hiệu: 100%, không dương tính giả - liên đoán dương: 100?

- Liên đoán âm: 99,8%

- Ty lệ phát hiện lệch bội (13, 18, 21, X, Y): 99,5%

Trang 56

QF-PCR (Nhược điểm

Trang 57

Xét nghiệm Prenatal BoBs

Phat hién 5 lech boi va

9 microdeletion co tan suat cao nhất (1/1.350 — 1/1.800)

* Trisomy 21 * DiGeorge (del 22q11.2; del 10p14) * Trisomy 18 * Williams-Beuren (del 7q11.2)

* Trisomy 13 ° Prader-Willi (del 15q11-q12)

Trang 58

Bactenum BAC PCR of BAC clone AmplifiedDNA xMAP sequence bead WD ˆ + * WP Coupling

= BAC (probe NST nhan tao) đặc hiệu được gan lên Bead (hat nano) = NST 13, 18, 21,X, Y : mỗi loại có loại Bead đặc hiệu

=_ 9 hội chứng xóa vi đoạn : mỗi loại có 4 - 8 loại Bead đặc hiệu

“ Tổng cộng 85 loại Bead được mã hóa bằng phố màu khác nhau,

mỗi loại Bead có > 1 triệu cái

Trang 59

DNA Nghiém pham va Mau tham chiéu nam, Mau tham chiéu nir

được đánh dấu huỳnh quang và lai gắn với các probe trên các Bead x ec x: “eee = —— one ' “ ` s99 me lente eG, ea & sa ety Gn en Gy Oe ey Oe ở (ky 4x Ge Ge Ge & & Ất Ee Ge Me > & Ge te

Sản phẩm lai được đưa vào

Luminex 200 đê đọc tín hiệu

(96 mau trong 1 lan XN)

Phân tích tín hiệu bang BoBsoft

Trang 60

Prenatal BoBs: XY binh thuong

Trang 61

Prenatal BoBs: Trisomy 21, XX

Trang 68

Array-CGH: Del 7p22.1-15.2, XY TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

Genome View (Amp/Del) /°256755910866 2 4' analyzed with ‘Single Cell Smal! Aberration

Analysis Method’

vse Dteede test

Amp/Gain/Loss/Del Intervals Table (256755910866_2_4)

Chr Start-Stop(bp) Cytoband Sizetkb) #Probes ¬ yo peo Pei

chr] 5) 70846-26221/83 p22.1 - p15.2 20,450 938 362 -0.843 NA RNF216, ¿NF819P, 00M, C21, RSPH10B2 Amp=Amplitication Del=Ueletion

Total Amp/Gain/Loss/Del Intervals: 1

Hoi ching Cri-du-Chat

Trang 69

Trang 70

ay renatal BoBs va Array-CGH (Nhược điềm

4 Chong chỉ định khi có tam bội + Không phát hiện được khảm

+ Không phát hiện được trao đối đoạn cân băng

+ Không phát hiện được ngoại nhiễm máu mẹ

Trang 71

TRƯỜNG DAI HOC Y TE CONG CONG Số lượng NST ¬ Xóa vi đoạn Số lượng NST lo VÀ 9 Xóa vi đoạn Thực hiện 1 LÀN ce “Bobs BoBs Số lượng NST :

Hoặc 1 Xóa vi đoạn Chân

Thực hiện riêng biệt doan

trước sinh

Cau tric dai the +

sô lượng NST

không có kỹ thuật nào toàn điện

Trang 72

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG ANIPS: Non Invasive Prenatal Screening |

( \ Wheeber’s blood with \ \, Macher s Divod with | i \ Wiceber’s Diood with Cah Wocber’s blood wiih

—~ KG le email & tostat OMA Pr » \rotemal B tostat ONA cờ _* (roterna! & tostat ONL 7 `ŠẲẮ BS \rotema! & tasted TU regen oma Cr VS ⁄“ \ fortsiona CC ` wt \ WostalDNBA NS “ \ fOxtslONA Ý ¬\S v⁄ \

| MÀ, wen —~.v⁄ ˆ ' ; ` \ ie — v7 - 9 i : ` | —-v ˆ eee || — eee

, 2 ^ | ` (NTR ” Lh we (ee

ai PL - "` ee NI

‘ mỹ | , ‘ woh, | ` et | ' cae «ih |

}\ Ậ ` |) |) |) X /

Raby ond gloves Í baby Veerade Bary Focal Raby ond ploveste ;

howe toctal OWA ; howe foetal OWA howe Sootal OMA hewe tootal CNA |

Xót nghiệm sang lọc trước sinh không xám lãm

Trang 73

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG Thủ thuật chân đoán trước sinh qe Choc hut mau dây rốn 3 q Sinh thiết qai nhau 4, ® Chọc ối Thủ thuật xâm lẫn gây sây thai

Phương pháp tâm soát mới

° Tỉ lệ phát hiện cao hơn

- _ Tỉ lệ dương tính sai thấp hơn

* Chi dinh choc 6i, STGN it hon

Sang loc trước sinh không xâm lấn (NIPS)

Trang 74

Trang 75

NIPS: Non Invasive Prenatal Screening

DNA tu do cua thai

+ Nguồn gốc từ nhau thai

+ Xuất hiện từ 7 tuần, tăng dan | ( + Tỉ lệ 3% - 19% cí-DNA c + Kích thước : ~170bp j x, \\ Mothers bod with Í DNA Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma 30.0 a‘ = 25.0 aternal DNA 2 20.0 o 2 15.0

s 10.0 Baby and placenta 2 5.0 - have foetal ONA

0.0

Trang 76

ÑIPS: Non Invasive Prenatal Screening

Trang 77

=NIPS: Non Invasive Prenatal Screening

°_ Bất thường số lượng nhiễm sắc thê

- Lệch bội 21, 18, 13, X, Y

- _ Có thê khảo sát 24 loại nhiễm sắc thé (1-22, X, Y)

‹ Xóa vi đoạn nhiễm sắc thê

- 22q11 deletion (DiGeorge)

- 15q11 deletion (Angelman/ Prader-Willi) - 5p- (Cri-du-chat)

- Cac loai khac

Trang 78

NIPS: Non Invasive Prenatal Screening

Nghiên cứu trên 146.958 thai kỳ Dương tính giả tiên đoán | tiên đoán dương a T21 720 61 99,17% 99,95% 92,19% 99,99% T18 167 51 98 24% 99, 95% 16,61% 100% T13 22 45 100% 99,96% 32,84% 100% Tông số 909 157 99,02% 99,86% 85,27% 99,99%

TLTK: Zhang H, et al (2015) Non-invasive prenatal testing for trisomies 21, 18 and 13:

clinical experience from 146,958 pregnancies Ultrasound Obstetrics and Gynecology; 45(5):530-8

Trang 79

ANIPS: Non Invasive Prenatal Screening

CHONG CHỈ ĐỊNH

= Thai phụ (hoặc chông) khảm nhiễm sắc thể = Song thai tiêu biến (Vanishing-twin)

= 3 thai

“ Bệnh ác tính

= Dang điều trị truyền máu

CÂN TRỌNG

= Điêu trị ghép: tủy, gan, thận, tế bào gốc = Điêu trị chống đông Heparin

= Béo phi

Trang 80

TRUGNG DAI HOC Y TE CONG CONG NIPS (Han ché)

+ Không phát hién duoc kham, gây ầm tính gia

+ Không phải xét nghiệm chân đoán (PPV: 92,19%) + Chỉ phí cao

+ Lựa chọn giới tính

Trang 82

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CƠNG CỘNG

Chân đốn bât thường gen

Trang 83

Trang 84

Định dạng
Số trang	84
Dung lượng	3,19 MB