Bài 1 định danh vi sinh vật sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

Bài 1: Định danh vi sinh vật sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử Trung tâm Xét nghiệm, Đại học Y tế công công Chuẩn đầu Mô tả cấu tạo vật chất di truyền vi sinh vật Diễn giải phương pháp định danh vi sinh vật Giải thích nguyên lý kỹ thuật tách DNA/RNA, PCR, RT-PCR, Realtime PCR, giải trình tự gen yếu tố ảnh hưởng, gây nhiễu đến phản ứng PCR kết xét nghiệm TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Vật chất di truyền vi sinh vật • • • Bản chất chung: axit nucleic Vi khuẩn: phân tử ADN dạng vịng kín Vi-rut: phân tử ADN ARN; đơn kép TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Vật chất di truyền vi khuẩn TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Vật chất di truyền vi khuẩn TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Vật chất di truyền vi rút TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Vật chất di truyền vi rút TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Định danh VSV phương pháp truyền thống Thu thập bệnh phẩm    Xử lý bệnh phẩm    Xác định vi sinh vật    Xác định tính chất khác (mức độ nhạy cảm kháng sinh, gen độc lực…)   Trả kết TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Nuôi cấy phân lập - Tách biệt vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm - Sử dụng loại mơi trường ni cấy: có chất ức chế khơng có chất ức chế - Tùy bệnh phẩm kết nhuộm soi mà chọn môi trường nuôi cấy phù hợp - Đánh giá tính chất khuẩn lạc: kích thước, màu sắc, hình thái để định hướng cho định danh - Nhuộm soi lại khuẩn lạc nghi ngờ - Tăng sinh (nếu cần) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP 10 PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV Trạng thái: - Môi trường rắn (2% agar) Thành phần, chức năng: - Môi trường lỏng (0% agar) Môi trường nửa rắn (0.5% agar) Môi trường Môi trường vận chuyển (Venkat-Ramakrishnan (VR) cho V cholerae) - Môi trường chọn lọc (TCBS cho V cholerae) , Môi trường phân biệt định danh, Môi trường tăng sinh, Môi trường dinh dưỡng tối thiểu,… TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP MALDI-ToF MS Trong phịng xét nghiệm vi sinh lâm sàng Khoảng phút cho kết 74 th Tổng chi phí định danh: Khoảng 1/20 chi phí định danh truyền thống Qua hàng loạt vi sinh vật, tỷ lệ 92-99% Quy trình đơn giản, khơng tón thời gian MALDI-TOF-MS Quy trình định danh M-chất Unknown isolate A-dựa vào Laser D-hấp thụ/ I-ion hóa Dữ liệu protein Time-thời gian bay OfProteins Flight M-khối S-phổ 75 ((2k 2k to to 20k 20k Daltons) Daltons) MALDI-ToF-MS Tách ion từ nguồn Matrix Assisted Laser Desorption/ Sự kết tinh ⮚ Ria khuẩn lạc đĩa kim loại ⮚ Nhỏ 1µl Matrix (CHCA) ⮚ Để khô tạo tinh thể ⮚ Cấu trúc tế bào vi sinh vật bị phá vỡ protein kết hợp với matrix Ionisation TimeOfFlight Mass Spectrometry 76 76 Nguyên lý MALDI-TOF MS Matrix Phát Assisted Dầu dò Laser Desorption/ Sự phân ly Chân không Ionisation Các ion không bị lệch cổng bắt ion, phát đỉnh Time- Cổng ion of- Ion flow Flight Deflectors Ống kính làm nét Mass Spectrometry Sự tăng tốc Sự ion hóa Trường điện từ Laser Đĩa khuẩn lạc 77 77 Dựa vào tương đồng khối phổ Khối phổ Định danh Tên vi sinh vật Cơ sở liệu 78 ⮚ Tương đồng phổ loài (chi, loài, loài) ⮚ Sự khác khối phổ loài Tác động định danh nhanh quản lý bệnh nhân nhiễm trùng hrs Dx Dx A A BC BC Pos Pos A A bb 24 48 72 Rapid Identification by MALDI-ToF MS ⮚ ⮚ 79 ID ID b b Significant reduction in mortality (12.7% compared to 20.3% (p=0.021)) ⮚ Highly noticeable with GN Bacteremia cases (8.3% vs 25.3% (p=0.003)) Time to intervene antibiotic therapy ▪ ▪ Significantly improved on effective therapy (20.4 Hrs vs 30.1 Hrs (p=0.021) Significantly improved on optimal therapy (47.3 Hrs 90.3 Hrs (p