Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán tại Việt Nam

Từ yêu cầu thực tế• Phải có các xét nghiệm hữu dụng lâm sàng hơn trong chẩn đoán, giúp chỉ định điều trị, theo dõi điều trị nhiều bệnh lý nhiễm trùng • Tiến bộ đặc biệt hiện nay trong đi

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

Từ yêu cầu thực tế

• Phải có các xét nghiệm hữu dụng lâm sàng hơn trong chẩn đoán, giúp chỉ định điều trị, theo dõi điều trị nhiều bệnh lý nhiễm trùng

• Tiến bộ đặc biệt hiện nay trong điều trị ung thư là điều trị đích rất cần phải có xét nghiệm pharmaco- genetic

• Cần phải có các xét nghiệm xác định bệnh lý di truyền đưa vào chẩn đoán tiền sanh, tham vấn tiền hôn nhân để nâng cao chât lượng dân số, tránh gánh nặng xã hội

• Nhu cầu xét nghiệm dấu vân tay di truyền trong pháp y, trong y học thể thao

Thực tế này đòi hỏi chúng ta phải có thêm những tiếp cận mới, trong đó có tiếp cận sinh học phân tử

Sinh học phân tử

áp dụng trong

chẩn đoán phát hiện tác nhân VSV gây nhiễm trùng

NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI C (HCV)

Genotype - 1 Điều trị 48 tuần Genotype non-1 Điều trị 24 tuần

Định lượng HCV genotype

Không giảm hơn 2 log 10 Giảm hơn 2 log 10 hay âm tính

HCV-RNA

Cuối điều trị HCV-RNA

HCV RNA (-) Đáp ứng

(2002 NIH Consensus Conference)

Giải pháp toàn diện cho xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C

RT-qPCR định lượng HCV-RNA Định genotype HCV

RT-qPCR định lượng HCV-RNA

RT-PCR phát hiện HCV-RNA

NA đích dành cho chẩn đoán sinh học phân tử được lựa chọn là 5’-NC nhờ có những trình tự bảo tồn, dễ cho thiết kế các xét nghiệm độ nhạy cao

Phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek trong năm 2008

Giải pháp gói xét nghiệm định lượng và xác định genotype HCV là độc đáo về mặt kỹ thuật , hữu dụng lâm sàng, và giá thành rẽ nên đưa vào áp dụng dễ dàng hơn

Công ty Nam Khoa đang triển khai giải trình tự vùng NS5B

để tránh nhầm lẫn một số genotype 6 thành genotype 1

Very high prevalence of HCV genotype 6 variants in Southern Vietnam : large scale survey based on sequence

determination Van Hung Pham, An Duc Xuyen Vo Dien Vu Banh, Ling Lu and Kenji Abe Emerging Infectious Diseases

(submitted)

IL28B SNP rs12979860: INTERFERON switch

o Đáp ứng với interferon 60-80%

o Khả năng đáp ứng thuốc và tiến triển mạn

tính thấp hơn 1/2 so voi kiểu CT (Ge et al., Thomas et al.)

o Gặp nhiều trên bn nhiễm genotype 6

o Đáp ứng với interferon 30-40%

o Khả năng kháng thuốc và tiến triển mạn tính

thấp cao gấp đôi kiểu CC (Ge et al., Thomas

et al.)

CC-ON

CC-OFF

Phát hiện INTERFERON switch

xác định IL28B SNP bằng kỹ thuật giải trình tự và kỹ

thuật real-time (taqman probe)

hiệu quả điều trị bằng IL28B SNP:

WHO 2001

NHIỄM VIÊM GAN SIÊU VI B (HBV)

qPCR định lượng HBV-DNA

Điều trị qHBVDNA/3th

Ann Intern Med 2002;137:1-9 Updated Definitions of Healthy

Ranges for Serum Alanine Aminotransferase Levels Daniele

Prati, MD; Emanuela Taioli, MD, PhD; et Al.

Giải pháp toàn diện cho xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B

Giải trình tự gene rt (trình tự 700bps)

• Phát hiện đột biến kháng thuốc

Phát hêện đột biến “a”

• Vaccin escape mutant

• Xác định genotype

G1896A (Codon 632) A1762T (Codon 588) G1764A (Codon 588)

 Xét nghiệm tìm AFB không

phổi mà soi không thấy, cấy không ra

phổi rất khó chẩn đoán xác định như lao màng não, lao khớp, lao màng bụng, lao

đồ sớm để biết có đa kháng không

Giải pháp phát hiện M tuberculosis nhạy hơn,

nhanh hơn, có kết quả kháng sinh đồ sớm hơn

 Tác nhân virus cần phải phát hiện để sớm có biệnpháp theo dõi (Dengue, HPV), điều trị (HSV) hay theo dõi hiệu quả điều trị (HBV, HCV, HIV/AIDS)

 Tác nhân vi khuẩn nhưng các phương pháp

truyền thống không nhạy, không kịp thời

(Chlamydia, Lậu kinh niên)

 Các tác nhân gây dịch nhưng cần phát hiện từ cơ

sở để phòng ngừa lây lan và sẽ không an toàn

nếu làm xét nghiệm với các phương pháp vi sinhtruyền thống tại các phòng xét nghiệm lâm sàngchưa có an toàn cấp độ 3 (H5N1, H1N1, SARS, tác nhân khủng bố sinh học)

PCR/qPCR phát hiện/định lượng tác nhân VSV gây nhiễm trùng trên người và động vật

Xét nghiệm

sinh học phân tử

áp dụng trong ung thư

(Non Small Cell Lung Cancer)

Các đột biến EGFR

• Đột biến EGFR là trên 4 exon của gen, đó là exons 18 đến 21

• Đột biến mất đoạn ở Exon 19 và đột biến L858R trên exon 21 chiến 90% các đột biến

Domain Tyrosine Kinase

Del E746-A750 Del E746_S752>V Del E746_T751>A Del E746_T751 Del L747_A750>P Del L747_E749 Del L747_P753>Q Del L747_P753>S Del L747_S752 Del L747_T751>P Del L747_T751 Del S752_I759

& additional deletions

~45%

T790M D770_N771 (ins NPG) D770_N771 (ins SVQ) D770_N771 (insG) S768I

~5%

L858R L861Q

Các kỹ thuật phát hiện đột biến EGFR

Kỹ thuật Độ nhạy Phát hiện được

Pao and Ladanyi Clin Cancer Res 2007;13:4954-55

Một kết quả giải trình tự phát hiện đột biến EGFR

Exon 19 deletion E746-A750 Exon 21 L858R

ARMS (Amplification Refractory Mutation System )

using scorpion primers

Scorpion primers không phát huỳnh quang

Khi đầu 3’ scorpion primers match được với

trình tự đích thì primer sẽ được kéo dài

Khi biến tính (nhiệt độ 95oC), scorpion

primer đã kéo dài tách khỏi sợi khuôn

Khi nhiệt độ hạ xuống thì scorpion primer

đã kéo dài sẽ cho trình tự đầu 5’ bắt cặp một

trình tự kéo dài của nó làm tách reporter khỏi

quencher và phát huỳnh quang

Một kết quả phát hiện đột biến với

ARMS dùng scorpion primers

Xét nghiệm phát hiện

đột biến EGFR mẫu thử

lấy từ mô ung thư

T790M

Các đột biến khác

Hiện nay không có dữ liiệu hổ trợ cho nhạy cảm IRESSA™ (gefitinib)

Hiện nay không có dữ liiệu hổ trợ cho nhạy cảm

PR: partial response SD: stable disease PD: progressive disease

UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG: KRAS VÀ BRAF

 Xác định quan hệ huyết thống, pháp y (STR-PCR)

trong phát hiện alpha thalassemia)

Kỹ thuật chẩn đoán tiền sanh nhanh lệch bội đang trở thành chuẩn vàng

Phạm Hùng Vân

Kỹ thuật QF - PCR

 Quantitative fluorescent polymerase

chain reaction

 Khuếch đại, phát hiện, phân tích trình

tự đoạn lặp lại ngắn (STR) nằm trên

các cặp nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y

 Trong giai đoạn lũy thừa, lượng sản

phẩm khuếch đại được tạo ra tỉ lệ với lượng DNA có trong mẫu ban đầu

(CA) n

Microsatellite

STR = Short Tandem repeat

1n copies

2n copies

3n copies

Các STR được khuếch đại

AMXY

(XY)

D21S1414 X22 (XY) AMXY (XY) D21S1435 D18S391 D13S634

Qui trình lấy mẫu

1 Dịch ối hay sinh thiết gai nhau.

2 Nếu là dịch ối thì lấy 2-15ml dịch,

tránh không có máu mẹ.

→ Nếu có lẫn máu mẹ thì phải cấy để rửa

sạch máu mẹ (KQ sẽ chậm 1 tuần)

→ Nếu không lẫn máu mẹ thì thực hiện xét

nghiệm ngay để ngay mai có kết quả

1 Dịch ối được cho vào tube Falcon 15ml

vô trùng Trong thời gian chờ vận

chuyển thì giữ ở 2-8oC.

Ca 1: 46,XY

Ca 2: 46,XX

Ca 3: trisomy 21

Ca 4: Trisomy 18

Ca 5: XXY

Ca monosomy X

Ca 6: Triploidy XXX

So sánh các kỹ thuật RAD

Thiết bị KHV huỳnh quang PCR + điện di mao

quản

PCR + điện di mao quản

Số lượng

mẫu/ngày

Hạn chế (<450 mẫu/năm)

Không hạn chế (>1000 mẫu/năm)

Không hạn chế (>1000 mẫu/năm) Lượng nước ối 6-8 ml 2 ml (25-250ng) 1,5 ml (1-10ng)

Kết luận: QF-PCR

Kỹ thuật QF-PCR có thể ứng dụng thường quy thay thế kỹ thuật FISH ở những trung tâm có nhiều mẫu và có

hệ thống điện di mao quản QF-PCR đang trở thành chuẩn vàng mới cho chẩn đoán lệch bội.

Các PCR phát hiện nhiễm trùng tiền sanh

Dấu ấn DNA và các xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tầm tông tích, phát hiện thủ phạm

(1) Giảng viên Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP HCM

Chủ nhiệm tổ Bộ Môn Vi Sinh, Khoa ĐDKTYH

Phó phòng thí nghiệm trung tâm ĐHYD

Thành viên chính của ANSORP và ARFID

Cố vấn khoa học Công Ty NAM KHOA

BS TS Phạm Hùng Vân (1)

Một người da đen (gọi là “X”) sinh tại Vương quốc Anh đã bỏ qua sống với cha của mình tại Ghana Sau đó anh ta xin qua trở lại Vương quốc Anh để sống với mẹ (gọi là “M”) và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì người

ta nghi ngờ người xin qua Anh quốc lần này (gọi là “X?”) đã bị thay thế bởi một người cháu hay là một người không thân thuộc

gì với bà mẹ Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xãy ra vào năm 1985, và lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein

markers) đã được thực hiện và đã xác định được bà mẹ là có

liên hệ với “X?” tuy nhiên không thể loại trừ được M là cô hay

dì của “X?” Thắc mắc này tưởng chừng bế tắc cách giải quyết, nhưng may thay Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến, và lần đầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA đã được áp dụng trong

trường hợp này Kết quả xét nghiệm đã xác định được đúng

“X?” chính là “X” vì “X?” có mang các dấu ấn DNA từ M và đồng thời có chung các dấu ấn DNA với các đứa con của “M” thừa hưởng từ người cha

F B D

Thang DNA Thang DNA

Một trường hợp bị chứng minh

loạn luân tại Anh quốc Kết quả

xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ

đứa bé, là “D” và cha của

người mẹ này, là “F” có đến

62% các vạch vị trí của tiểu vệ

tinh đa vị trí trùng nhau; nhưng

kết quả lại đồng thời cho thấy

“F” và “B” lại có đến 78% các

vạch trùng nhau Chính nhờ như

vậy mà đã xác định được chẳng

những “F” là cha của “D” đồng

thời cũng là cha của “B”, có

nghĩa là “F” vừa là ông ngoại,

vừa là cha của “D”

Dấu ấn DNA là gì

1 phân biệt cá nhân này với cá nhân khác

2 tìm được mối quan hệ huyết thống của các cá nhân

DNA trong bộ gen người có chứa 30% các trình

tự lặp lại, không mang gen Dấu ấn DNA nằm

trong các trình tự lặp lại này Dấu ấn DNA

giúp:

Các loại dấu ấn DNA

1 Các tiểu vệ tinh (minisatellite), còn gọi là các VNTRs (variable number of tandem repeat) là các trình tự lặp lại kích thước 1000 base đến 30.000 base trong đó có trình tự lõi Có hai loại

 Tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite) có

nhiều vị trí trên genome, phát hiện bằng RFLP

 Tiểu vệ tinh đơn vị trí (single locus minisatellite)

chỉ có một vị trí trên genome, phát hiện bằng PCR

2 Các vi vệ tính (microsatellite), còn gọi là các STRs

(short tandem repeat) có kích thước nhỏ dưới 1000

base, do các trình tự lõi 2 đến 4 bases lặp lại nhiều

lần (từ 10 đến 60 lần) Phát hiện bằng PCR

Các xét nghiệm dấu ấn DNA

1 Xét nghiệm RFLP (Restriction

Fragments Lenght Polymorphism)

phát hiện multilocus microsatellite

2 Xét nghiệm phát hiện single locus

minisatellite bằng PCR

3 Xét nghiệm STR (tức là xét nghiệm

PCR phát hiện các STR = Short

Tandem Repeats)

4 Xét nghiệm giải trình tự vòng D của

ty thể

Biến tính rồi chuyển sang màng nylon

Dùng dò DNA đánh dấu đồng vị phóng xạ để lai cặp rồi phát hiện bằng phóng xạ tự ghi

Tách biệt các đoạn DNA trên agarose

Bộ gene nguyên vẹn

Trình tự base lặp lại trên bộ gen

Cắt đoạn nhờ men cắt hạn chế

Các đoạn ADN kích thước khác nhau

RFLP

Là xét nghiệm phân

tích sự đa hình các

mãnh DNA chứa các

dấu ấn DNA (là VTR

đa vị trí) bị cắt đoạn từ

bộ gen bằng men cắt

hạn chế

Xét nghiệm RFLP có mộthạn chế là phải có mẫu thửnhiều tế bào để có thể tríchđược bộ gen nguyên vẹn(phải lấy không dưới 10mlmáu để tách đủ bạch cầudùng trong ly trích bộ gen).

Hạn chế của xét nghiệm RFLP

Xét nghiệm PCR dựa trên STR

Dùng kỹ thuật PCR

để khuếch đại các

dấu ấn DNA nằm

trên các STR rồi

phân tích kiểu hình

biểu thị bằng chiều

dài các STR này

Xét nghiệm PCR dựa trên STR

Lad PF2 MO CH Lad PF1 MO CH

Nhờ dựa trên kỹ thuậtPCR, xét nghiệm STR có

ưu điểm là không cần phảicó lượng mẫu thử nhiều,chỉ cần mẫu thử còn một íttế bào, hay thậm chí ít dấuvết DNA là có thể làm xétnghiệm được

Ưu điểm của xét nghiệm STR

Ứng dụng các xét nghiệm dấu ấn DNA

1 Phát hiện quan hệ huyết thống (RFLP,

STR)

2 Truy tầm thủ phạm qua dấu vết DNA để

lại tại hiện trường (STR)

3 Truy tầm tung tích nạn nhân qua dấu vết

DNA để lại trêbn di thể (xác chết phân huỷ tìm thấy được, xác chết tai nạn máy bay-hoả hoạn ) (STR)

LOCUS Máu toàn phần H (nam) Mảnh vải quần bé X.

Phân tích kết quả kiểu hình 12 STR loci

DVT DNA tinh trùng / mảnh vải quần bé X # DVT DNA /máu H : ~ 99.99999157%

Vào tháng 7 năm 1991, tại Vancouver, British Columbia, Canada;

một người đàn bà 29 tuổi được tìm thấy bị giết chết và xác bị đốt

cháy đen gần như thành than vì vậy mà không thể nhận diện được DNA của thi thể không thể thu thập được từ tro của xác chết Tuy

nhiên nhờ một chút ít dữ kiện may mắn có được và nhờ sự làm việc rất tốt của cảnh sát, người ta đã tìm được một người đàn ông bị nghi ngờ là thủ phạm Khám nhà người này, phát hiện thấy có các dấu

máu khô còn dính trên xe hơi và quần áo của hắn ta cùng một can xăng trống rỗng Xét nghiệm dấu ấn DNA từ các vệt máu, người ta đã xác định không phải từ máu của hắn ta Vấn đề là làm sao để có DNA trích được từ di thể của nạn nhân Sau khi xem xét phần hàm dưới của di thể, người ta đã tìm thấy được một vài cái răng khôn

không bị cháy nhờ được hàm răng bảo vệ Chính từ các mẫu răng

khôn này, các nhà khoa học hình sự đã trích được DNA, và nhờ đó đã làm được xét nghiệm phát hiện dấu ấn DNA của nạn nhân Kết quả cho thấy các dấu ấn DNA này hoàn toàn trùng khớp với dấu ấn DNA từ các mẫu máu tìm được trên xe hơi của hung thủ Cuối cùng hung thủ phải nhận tội giết người

TY THỂ

Xét nghiệm giải trình tự vòng D

của DNA ty thể

Ty thể nằm trong tế bào chất, do vậy DNA ty thể

di truyền qua các thế hệ qua mẹ DNA của ty thể có một vị trí là vòng D, có trình tự thay đổi rất ít qua các thế hệ Do vậy dựa vào trình tự DNA của vòng D này, có thể tìm được mối quan hệ huyết thống

Đối chiếu kết quả giải trình tự

Xét nghiệm DNA ty thểdùng nhận diện hài cốt lâunăm vì các DNA ty thể hãycòn hiện diện khá nhiềutrong tuỷ răng của hài cốt

vì một phần là chúng đượcrăng bảo vệ, một phần nữalà do trong một tế bào córất nhiều ty thể, số lượngDNA ty thể trong một tếbào có khá nhiều nên khóthể bị phân huỷ hết

Ưu điểm của xét nghiệm DNA ty thể

Tìm được hài cốt của Nga Hoàng Nicolas đệ nhị

bị giết chết sau cách mạng tháng 10 Nga nhờ pháthiện được trình tự vòng D ty thể trên một hài cốtchôn tại bìa rừng nơi được cho là đã hành quyếtgia đình nhà vua, trình tự này trùng với trình tựvòng D của ty thể một người thân thuộc, và cả hàicốt của hoàng hậu do có thân thuộc với nữ hoàngVictoria bên Anh quốc

Nhận diện hài cốt lính Mỹ chết trận tại Việt NamNhận diện hài cốt liệt sĩ tại Việt Nam

Xét nghiệm xác định hài cốt cần mẫu người thân là ai?

người là cùng dòng mẹ?

cùng dòng cha?

Kết luận

dụng thực tiễn trong chẩn đóan và điều trị

quá khó và trang thiết bị cũng không phải quá đắt tiền

có khả năng xây dựng kỹ thuật và tổ chức phòng thí nghiệm, và (2) các nhà lâm sàng phải có đầy đủ tri thức để ứng dụng