MỘT số kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử ỨNG DỤNG TRONG y học (DI TRUYỀN học NGƯỜI SLIDE)

MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC Mục tiêu - Trình bày kỹ thuật tách chiết điện di ADN - Trình bày KT PCR - Trình bày nguyên lý, nội dung p/p xác định trình tự Nu phân tử ADN (sequencing) - Nêu đặc điểm, vai trị enzym giới hạn - Trình bày nội dung ca KT lai acide nucleic - Nêu c h/tợng đa hình chiều dài đoạn ADN enzym giíi h¹n tách chiết ADN, Điện di ADN 1.1 Kỹ thuật tách chiết ADN Giải phóng ADN khỏi màng TB Hủy bỏ phần Protein Kết tủa ADN Hũa tan ADN 1.2 Điện di ADN - Điện di ADN thạch, từ cực (-) sang cực (+) - Phân tử ADN nhỏ di động nhanh Hình ảnh điện di ADN sau chiết tách Hình ảnh điện di ADN sau PCR PhƯương pháp nhân đoạn ADN in vitro (PCR) (PCR = Polymerase Chain Reaction) Nguyên liệu: - Phân tử ADN ban đầu, loại Nu, PCR buffer - mồi (primers) gồm mồi ngựược, mồi xuôi, - Enzym Taq polymerase (VK Thermus aquaticus) Các giai đoạn: Giai đoạn biến tính: biến ADN thành sợi đơn, ủ ADN to = 92 -95o C Giai đoạn lai ghép: ADN mồi lai ghép với ADN ban đầu to = 50- 52o C Giai đoạn tổng hợp: Taq polymerase điều khiển ghép Nu vào ADN to = 70 -72o C Sau chu kỳ, ADN làm khuôn tổng hợp chu kỳ tiếp Sau 30 chu kỳ tạo thành 230 phân tử ADN ĐỒ THỊ BIỂU DIỄN CHUƠNG TRÌNH LUÂN NHIỆT CỦA PHẢN ỨNG PCR CÁC LOẠI MÁY PCR CHỦ YẾU - PCR lồng (Nested PCR): - QF – PCR: Nhân đoạn ADN định lưượng huỳnh quang (Quantitative - fluorescense - polymerase chain reaction): Xác định trình tự Nucleotit phân tử ADN (Sequencing) 3.1 Phưương pháp enzym học (phưương pháp Sanger) Nguyên lý: Dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm dideoxynucleotid (ddNTP) deoxynucleotid thông thường Phương pháp Maxam - Gilbert Bước 4: Tập hợp kết thu tất ống nghiệm, thu đoạn polynucleotid dài ngắn nucleotid, từ xác định trình tự DNA mạch khn Enzym giới hạn chức enzym giới hạn - Enzym giới hạn (Restriction Enzym) + Tách chiết enzym từ VK (tên enzym tên VK) + Cắt ADN xoắn kép vị trí xác định + Cắt sợi đơn ADN xoắn kép tạo nên đầu kết dính với Nu bổ sung cho + Vị trí cắt thường - Nu, tạo đầu kết dính sợi đơn + ADN bị cắt điện di dùng tạo ADN lai Tên gọi: Nguyên tắc: - Chữ thứ viết hoa chữ đầu tên giống vi khuẩn từ enzyme giới hạn ly trích - Chữ thứ hai thứ ba khơng viết hoa, ứng với tên lồi vi khuẩn nói - Chữ thứ tư viết hoa để chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có) - Chữ số La mã thứ tự enzyme giới hạn phát ( trường hợp nhiều enzyme giới hạn tìm thấy lồi vi khuẩn) Ví dụ: enzyme EcoRI E = giống Escherichia co = loài coli R = chủng RYI3 I = enzyme tìm thấy E.coli - Chức enzym giới hạn + Trong VK: enzym giới hạn phân giải ADN VR (VK có enzym methyl hố làm enzym giới hạn hoạt tính, khơng đ đến ADN VK) Tên enzym Chiết tách từ vi khuẩn Đoạn bị cắt Đầu kết dính -G-A-A-T-T-C-C-T-T- A-A-G-G -C-T-T-A-A A-A-T-T-CG- Bam HI Bacillus amyloliquefaciens -G-G-A-T-C-C-C-C-T- A-G-G-G -C- C-T-A- G G-A-T-C-CG- Sma I -C-C-C-G-G-G-G-G-G-C-C-C-C-C-C -G-G-G G-G-GC-C-C- Eco RI Escherichia coli Serratia marcesciens Lai acid nucleic 5.1 ADN dò (DNA probes) - Khi lai cần ADN dò + Là đoạn ADN sợi đơn có trình tự Nu biết + Gọi ADN dị dị sợi đơn tưương ứng ADN n/c - Phưương pháp tạo ADN dò: + Phiên mã ngưược từ Pr  mARN  cADN + Tổng hợp từ Nu theo trình tự biết + Tách chiết từ ADN gen 5.2 Các phưương pháp lai acid nucleic 5.2.1 Phưương pháp Southern blotting Chiết tách ADN từ mẫu vật: b/c, TB ối, TB tua rau Cắt ADN enzym giới hạn khác Điện di ADN gel agarose Biến tính ADN thành sợi đơn NAOH tocao Thấm ADN sang giấy Nitrocellulose Cho giấy Nitrocellulose vào bình lai có ADN dị Quan sát: tự chụp hình phóng xạ KHV huỳnh quang (tựy thuc nh du ca ADN d) Enzym cắ t Đ iÖn di agarose gel Các bước kỹ thuật Southern blotting Cắ t cầu nối H Thấm ADN vào giấy nitrocellulose GiÊy nitrocellulose Lai globulin DNA probes Tù chơp h× nh phãng x¹ 5.2.2 Kỹ thuật lai chỗ FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) - Là p/p vừa di truyền TB, vừa phân tử - Mẫu dò ADN sợi đơn có đánh dấu Mẫu dị đưược lai bổ sung với ADN nhân TB cần n/c (NST gian kỳ kỳ biến tính tạo sợi đơn) - Phân tử ADN phát tùy p/p đánh dấu Kỹ thuật FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization) Tiêu NST Biến tính ADN dò ADN dò đánh dấu huỳnh quang ADN xoắn kép Tiêu NST thực KT FISH Biến tính ADN khn Lai ADN dị với ADN khn Phân tử lai công nghệ sinh học Kháng Kanamycin Cảm ứng tetracyclin Kháng Kanamycin Kháng tetracyclin 5.2.3 Phân tử lai cơng nghệ sinh học Mục đích: đưa đoạn ADN (gen) cần thiết vào, loại bỏ đoạn ADN bất lợi để tạo nên phân tử lai tổng hợp sản phẩm chất lượng cao - ADN cho có chất lưượng tốt, ADN nhận có k/n nhân lên nhanh - Chọn ADN cho ADN nhận gọi thể chuyển(vector) thưường plasmid VK, phage, cosmid - Dùng enzym giới hạn nhưư cắt ADN cho ADN nhận - Nối ADN cho vào ADN nhận tạo ADN lai (dùng ligase) - Các phân tử ADN nhân lên VK Tính đa hình chiều dài đoạn giới hạn = RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Là p/pháp gián tiếp dựa vào tính đa hình tự nhiên ADN gọi p/p RFLP - RFLP h/tưượng đa hình chiều dài đoạn ADN đ enzym giới hạn đ/hiệu, n/diện = điện di nhờ ADN dò - Khoảng 10% ADN t/gia t/hợp Pr, số cịn lại đa hình Nếu gen bệnh l/kết với vị trí RFLP nằm NST, tạo tái tổ hợp DT - RFLP dùng Marker đ trước sinh, p/biệt đồng dị hợp tử - - RFLP DT theo quy luật Mendel - - RFLP p/p dùng để lập đồ gen Dấu ấn ADN (DNA Fingerprinting) -Dựa vào nguyên lý tính đa hình ADN (Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) cịn gọi microstallite có từ 11-60 đơi base, lặp nhiều lần gen, đ/trưng cá thể  phân biệt cá thể nhờ vạch ADN dấu vân tay - Các bước tương tự Southern Blotting với ADN dò đặc hiệu p/hiện phân tử lai - ứng dụng: đ phụ hệ, tìm thủ phạm pháp y ... ADN khn Lai ADN dị với ADN khn Phân tử lai công nghệ sinh học Kháng Kanamycin Cảm ứng tetracyclin Kháng Kanamycin Kháng tetracyclin 5.2.3 Phân tử lai cơng nghệ sinh học Mục đích: đưa đoạn ADN (gen)... RYI3 I = enzyme tìm th? ?y E.coli - Chức enzym giới hạn + Trong VK: enzym giới hạn phân giải ADN VR (VK có enzym methyl hố làm enzym giới hạn hoạt tính, khơng đ đến ADN VK) Tên enzym Chiết tách... pháp enzym học (phưương pháp Sanger) Nguyên lý: Dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động enzyme DNA Polymerase Với việc sử dụng thêm dideoxynucleotid (ddNTP) deoxynucleotid