TIỂU LUẬN MÔN DI TRUYỀN HỌC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

Sự phát triển của công nghệ sinh học, trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn trong y học phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị. Trong lĩnh vực chẩn đoán, việc tích lũy ngày càng nhiều và nhanh thông tin về bộ gene người và các tác nhân gây bệnh, kể từ khi Chương trình Bộ Gene Người (Human Genome Project) cơ bản hoàn tất, là đóng góp thiết yếu thứ hai dẫn đến sự hình thành chẩn đoán phân tử. Bên cạnh đó, mối liên kết ngày càng chặt chẽ giữa các trường đại học, viện nghiên cứu với các bệnh viện và cơ sở y tế đã tạo thuận lợi cho việc triển khai các chẩn đoán phân tử vào thực tiễn với rất nhiều phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN KHOA Y DƯỢC TIỂU LUẬN MÔN DI TRUYỀN HỌC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC Sinh viên thực hiện: Trần Thảo Phương Niê Kdăm H’Yên Êban Lớp : Y K14B Khóa học : 2014 -2020 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Sự phát triển công nghệ sinh học, tảng sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn y học phòng ngừa, chẩn đoán điều trị Trong lĩnh vực chẩn đoán, việc tích lũy ngày nhiều nhanh thông tin gene người tác nhân gây bệnh, kể từ Chương trình Bộ Gene Người (Human Genome Project) hoàn tất, đóng góp thiết yếu thứ hai dẫn đến hình thành chẩn đoán phân tử Bên cạnh đó, mối liên kết ngày chặt chẽ trường đại học, viện nghiên cứu với bệnh viện sở y tế tạo thuận lợi cho việc triển khai chẩn đoán phân tử vào thực tiễn với nhiều phương pháp kỹ thuật sinh học phân tử I TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN LI ADN Tách chiết ADN Tách chiết ADN tổng số nhằm mục đích thu nhận ADN khỏi cấu trúc bao bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Điều quan tâm thu nhận phân tử ADN trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy.Ở tế bào Eukaryota, phần ADN chủ yếu nằm nhân tế bào, NST, trước hết cần bộc lộ ADN khỏi màng nhân, khỏi tế bào Quy trình tách chiết ADN gồm ba bước chủ yếu sau (phụ lục 1): - Bước 1: giải phóng ADN khỏi màng tế bào cách nghiền, dùng áp suất, siêu âm dùng phương pháp hóa học dùng phương pháp sinh học (dùng enzym) Sau - hỗn dịch ly tâm để loại bỏ chủ yếu mảnh vụn tế bào Bước 2: tách bỏ phần protein tế bào, NST Proteinase K thường dùng - Ly tâm để loại bỏ phần tủa proteinase K (tủa phenol, chloroform) Bước 3: kết tủa ADN (thường dùng Ethanol) ADN tủa để khô nhiệt độ phòng cho tan đệm TE (Trí, EDTA) giữ nhiệt độ : -4 0C Để bảo quản lâu dài, dung dịch ADN bảo quản -200C đến -800C Tách chiết ARN Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy RNase Hơn nữa, RNase lại có mặt khắp nơi (có nhiều ngón tay người thao tác,…), có hoạt tính cao bền vững với tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt 900C không làm hoạt tính RNase) Vì lý đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh tạp nhiễm RNase từ môi trường: thao tác điều kiện vô trùng, dụng cụ, hóa chất khử trùng nhiệt hay hóa chất, tránh tiếp xúc với dụng cụ tay trần Phương pháp tách chiết ARN toàn phần bao gồm bước - ADN (phụ lục 2): - Bước 1: giải phóng ADN ARN khỏi màng tế bào - Bước 2: tách loại bỏ phần protein - Bước 3: tủa acid nucleic Bước 4: dịch chiết chứa acid nucleic ủ với ADNase để phân hủy ADN, sau hòa tan dịch chiết chứa ARN nước; tủa ethanol, để thu ARN toàn phần mARN tách riêng Dựa vào cấu trúc phân tử mARN có đuôi poly A tách mARN sắc ký lực cột oligo T – cellulose Hiện sử dụng kit (bộ mẫu thử chuyên dụng) sử dụng viên bi từ có mang oligo T bề mặt Thông qua liên kết bổ sung A=T mARN bám lên bề mặt viên bi từ; sau kỹ thuật ly tâm thu lại viên bi tách mARN Kỹ thuật cho phép tách giữ lại mARN với khối lượng nhỏ Chú ý: trình thao tác, tránh lẫn ADN, ARN đối tượng khác vào dụng cụ Tránh enzyme phá hủy ADN ARN cần nghiên cứu, đặc biệt ARN không bền dễ bị phân ly ARNase Sau tách chiết ADN, kiểm tra độ tinh khiết ADN xác định tỷ lệ = 1,7 – coi phương pháp điện li ADN Điện di ADN Acid nucleic đại phân tử tích điện âm, điện trường có điện cường độ thích hợp ADN, ARN di chuyển từ cực âm đến cực dương Để kiểm tra xác định tính chất ADN, cần điện di ADN hạch (gel).Phân tử ADN nhỏ di động nhanh Tùy theo kích thước phân tử ADN mà người ta dùng loại gel khác nhau: Dùng polyacrylamid gel Dùng Agarose gel Dùng Agarose gel có lỗ tohơn (Pulsed field agarose gel) Để quan sát hình ảnh ADN điện di, người ta nhuộm ADN ethidium - Phân tử ADN có 500 đôi Nu Phân tử ADN có 500-10.000 Nu Phân tử ADN có nhiều đôi Nu bromide, ánh sáng tử ngoại, ADN gắn với ethidium bromide phát sáng Khi cho chạy điện di ADN nghiên cứu thường có ADN mẫu (Marker) chạy để so sánh, xác định số lượng Nu đoạn ADN Kỹ thuật điện di ADN gồm bước chủ yếu: - Bước 1: Tạo gel điện di agarose + Cân agarose hòa 100ml TAE 1X, nồng độ agarose gel khác tùy vào mục đích nghiên cứu (nồng độ agarose gel tỉ lệ nghịch với kích thước phân đoạn ADN cần kiểm tra) + Đun chín gel hỗn hợp suốt, nhiệt độ hạ xuống khoảng - 60- 700C đổ vào khuôn Để yên khuôn gel 30- 45 phút - Bước 2: Đặt khuôn gel vào bể điện di Bước 3: Trộn mẫu ADN với dye, tra mẫu vào giêng chạy điện di hiệu điện 80110V - Bước 4: Nhuộm gel EtBr 5- 10 phút, chụp ảnh để phân tích Một số ứng dụng điện di ADN: - Phương pháp điện di ADN dùng để kiểm tra kết tách chiết ADN - Kiểm tra độ tinh ước lượng hàm lượng, kích thước ADN dung II - dịch tách chiết Phân tích đa hình ADN: điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm - AFLP, sản phẩm RAPD Xác định có mặt đoạn ADN, tách dòng xác định trình tự gen PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (polymerase chain reaction: PCR) Phương pháp Mullis cộng đề xuất vào năm 1985 Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – polymerase Chain Reaction) phương pháp invitro để nhân nhanh đoạn ADN đó, có độ nhạy cao, mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế Nguyên lý phương pháp: Kỹ thuật tổng hợp ADN thể tuân thủ nguyên tắc chép ADN thể như: Đoạn cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn, cần có cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu điều kiện môi trường thích hợp enzyme ADN polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzyme ADN polymerase chịu nhiệt hệ thống điều nhiệt thích hợp cho giai đoạn phản ứng tổng hợp với đoạn mồi thiết kế chủ động Nhờ kỹ thuật PCR mà với lượng nhỏ ADN ban đầu thu đủ lượng ADN cần thiết để tiến hành thí nghiệm ADN Mục đích phương pháp: phát nhân đoạn ADN nhiều lần ống nghiệm Để thực phương pháp cần có: phân tử ADN ban đầu, hai đoạn ADN mồi (primers), mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi gắn hai đầu phân tử ADN ban đầu: mồi ngược mồi xuôi loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao; enzym tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus Phương pháp PCR thực qua nhiều chu kỳ, mồi chu kỳ gồm giai đoạn (phụ lục 3): - Giai đoạn biến tính: ủ ADN ban đầu nhiệt độ cao: 92-95 0C để tách ADN thành sợi - đơn Giai đoạn lai ghép: ADN mồi lai ghép với sợi đơn ADN ban đầu Thực - nhiệt độ: 50-520C Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển gắn tiếp Nu vào sau ADN mồi dựa ADN ban đầu làm khuôn Thực nhiệt độ: 70-720C Sau chu kỳ, từ phân tử ADN ban đầu tổng hợp nên hai ADN, đến chu kỳ sau hai ADN lại làm khuôn để tổng hợp nên phân tử ADN Qua trình nêu trên, thực tiếp chu kỳ sau Sau 30 chu kỳ từ phân tử ADN ban đầu có 230 phân tử tạo thành Phương pháp PCR phương pháp nhạy, từ lượng ADN ban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau áp dụng phương pháp PCR có lượng lớn ADN đủ dùng cho chẩn đoán, nghiên cứu Phương pháp PCR nhiều trường hợp thay cho phương pháp Southern bloting phương pháp thực nhanh, cần lượng ADN Từ phương pháp PCR ban đầu, ngày người ta đề xuất nhiều cải biến để nâng cao tính phương pháp - PCR lồng (Nested PCR): kỹ thuật dùng hai cặp mồi, có trình tự Nu lồng vào (có nghĩa cặp mồi thứ hai có trình tự Nu nằm cặp mồi thứ nhất) Đoạn ADN tổng hợp cặp mồi thứ dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ Điều làm tăng độ đặc hiệu phản ứng PCR Nó chỉnhân lên đoạn đặc hiệu ADN lần 1, đồng thời không nhân lên với sản phẩm - không đặc hiệu lần Nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang: QF – PCR (quantitative – fluorescense – polymerase chain reaction): năm 1993, Manfield lần ứng dụng phương pháp nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang – từ năm 1998 đến số phòng thí nghiệm thực thành công kỹ thuật chẩn đoán trước sinh hội chứng Down Ví dụ: dựa vào kết định lượng gen DSCR1 (gen định vị vùng 21q21.1 – q22.2 liên quan đến dị tật tim chậm phát triển tâm thần hội chứng Down), để xác định thai bị Down không Xem thêm kết xét nghiệm PCR: phụ lục III XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID TRONG PHÂN TỬ ADN (Sequencing) Về nguyên lý người ta xác định trình tự Nu gen (genome) điều kiện nay, người ta xác định trình tự Nu đoạn ADN xác định Sau hai phương pháp ứng dụng để thực xác định trình tự Nu: phương pháp hóa học phương pháp enzyme học, phương pháp enzyme học ứng dụng nhiều Phương pháp enzym học (phương pháp Sanger) Nguyên tắc phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động enzyme ADN polymerase trình tổng hợp ADN Enzyme ADN polymerase xúc tác gắn cácnucleotide vào mạch đơn ADN tổng hợp vị trí 3'có chứa nhóm -OH tự do, gặp nucleotide nhóm 3'-OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại Đặc trưng phương pháp sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng phản ứng tổng hợp ADN cách ngẫu nhiên Trong phản ứng sử dụng đoạn ADN mồi đoạn ADN mạch đơn - có kích thước 20 nucleotide Phương pháp gồm bước (Phụ lục 6): Bước 1: phân tử cần xác định trình tự Nu dùng làm khuôn để tổng hợp nên số đoạn ADN bắt đầu vị trí giống sợi ADN khuôn, loại Nu (dATP, dCTP, dGPT, dTTP) Đánh dấu phóng xạ 32P cho loại dideoxyribonucleotid khác Ví dụ ống cho ddATP, ống cho ddGTP, ống cho ddCTP ống cho - ddTTP Bước 2: trình tổng hợp dùng dideoxyrinucleotid Nu bị nhóm OH vị trí thứ nên gắn vào chuỗi ADN gắn thêm Nu Hiện tượng tạo thang gồm đoạn ADN có chiều dài khác nhau, rõ - điện di Bước 3: để xác định vị trí tất loại Nu phải có kết hợp hình ảnh điện di ống thể với băng khác mà vị trí băng đặc trưng cho vị trí Nu đọc theo thứ tự từ lên Tất băng đọc phương pháp tự chụp hình phóng xạ đánh dấu huỳnh quang Xem thêm bảng kết trình tự theo phương pháp Sanger: phụ lục Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam Gilbert) Nguyên lý phương pháp dùng hóa chất liều để phá hủy bốn loại Nu tạo nên chuỗi ADN.Điện di đoạn AND nhận biết vị trí chúng nhờ đánh dấu phóng xạ Dựa vào để đọc trình tự AND Các bước phương pháp sau: - Bước 1: tách ADN sợi kép thành sợi đơn, cho sợi đơn tiếp xúc với hóa chất để phá hủy số loại base (ví dụ A) Vì xử lý liều nên hóa chất phá hủy A có mặt Cách xử lý tạo số đoạn ADN có chiều dài khác - phản ánh bị trí A bị phá hủy theo trình tự chuỗi Bước 2: đoạn ADN điện di gel, phát tự chụp hình phóng xạ: đoạn ADN đánh dấu 32P đầu 5’ rõ gel, kích thước chúng biểu khoảng cách từ đầu đánh dấu đến vị trí A cần xác - định Bước 3: để xác định vị trí tất Nu phân tử ADN, cách xử lý thực đồng thời với ống cho loại Nu, thông thường T cho mẫu 1, C cho - ống 2, G cho ống A cho ống Bước 4: đọc vị trí Nu tương tự phương pháp enzyme Vị trí loại Nu biểu băng, vị trí đọc từ lên đoạn nhỏ điện di chạy nhanh đoạn có kích thước lớn Xem thêm bảng đọc kết theo phương pháp Maxam Gilbert: phụ lục IV ENZYME GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYME GIỚI HẠN Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) Enzyme giới hạn hay gọi enzyme hạn chế có đặc điểm cắt ADN vị trí xác định Những enzyme phân huỷ liên kết phosphodieste khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại đến bases Các liên kết hóa học mà bị enzyme cắt nối trở lại loại enzyme khác ligases, phân đoạn giới hạn (sản phẩm phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ nhiễm sắc thể gene khác ghép có trình tự đầu dính bổ sung với Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử kỹ thuật di truyền dựa vào enzyme giới hạn Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc enzyme khám phá từ chủng E coli mà hạn chế phát triển thực khuẩn thể Vì enzyme giới hạn cho chế vi khuẩn nhằm ngăn chặn công virus giúp loại bỏ trình tự virus (Xem thêm phụ lục 9) Cho đến người ta biết khoảng 500 loại enzyme giới hạn Các loại - enzyme giới hạn có đặc điểm sau: Các loại enzyme giới hạn chiết tách từ vi khuẩn Tên enzyme giới hạn - mang tên viết tắt vi khuẩn Cắt phân tử ADN xoắn kép vị trí xác định cho loại enzyme giới hạn Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng trình tự nhận biết đoạn ADN gồm đến cặp Nu có trình tự giống đọc theo chiều 5’-3’ Vì vị trí cắt enzyme giống mạch Vị trí cắt số enzym (phụ lục - 10) Sau bị cắt ADN có đầu kết dính sợi đơn Cùng bị cắt với loại - enzyme giới hạn, phân tử ADN có đầu kết dính với Nu bổ sung cho RE không cắt DNA tế bào chủ nucleotit trình tự nhận biết methyl hóa bền vững tác động cắt RE (thường A) Chức enzyme giới hạn Enzyme giới hạn vi khuẩn có vai trò phân giải ADN virus virus thâm nhập vào vi khuẩn Trong vi khuẩn có enzyme biến đổi để metyl hóa enzyme giới hạn làm cho enzyme giới hạn hoạt tính, không tác dụng đến ADN vi khuẩn Chức cắt enzyme giới hạn làm cho phân tử ADN dài bị cắt đoạn để phân tích Sau bị cắt, đoạn ADN điện di agarose gel để xác định tính chất, dùng để tạo nên phân tử ADN lai Một số ứng dụng enzyme giới hạn kỹ thuật sinh học phân tử: - Tạo DNA tái tổ hợp để thiết lập thư viện hệ gen, thư viện cDNA; chọn dòng phân tử + Tách chiết DNA tổng số tách chiết plasmid (phage) + Cắt DNA tổng số mở vòng plasmid loại RE Nối đoạn DNA vào plasmid - tạo DNA tái tổ hợp nhờ enzyme ligase Lập đồ cắt hạn chế: Là sơ đồ mô tả vị trí cắt enzyme giới hạn phân tử - DNA Thiết lập đồ chỉ thị phân tử RFLP liên kết với tính trạng V LAI ACID NUCLEIC ADN dò (DNA probes) Trước thực kỹ thuật lai acid nucleic người ta phải tạo ADN dò ADN dò đoạn ADN sợi đơn mà trình tự Nu, tính chất chúng biết Một số loại ADN dò bán thị trường Có tên ADN dò có chức dò tìm đoạn ADN sợi đơn tương ứng phân tử ADN cần phân tích, ví dụ đoạn ADN bất thường số bệnh cần chẩn đoán (Xem thêm phụ lục 11) Phương pháp tạo ADN dò: - Phương pháp mã ngược: Protein Ví dụ: ADN sợi đơn Hoặc -  mARN  cADN -Phe – Trp – Met – Asp – Cys – Arg –       TTT – TCC – TAC – CTA – TCT – GCT – (TTG) (CTG) (TCG) (GCC) Phương pháp tổng hợp từ Nu theo trình tự biết Phương pháp tách chiết từ ADN gen Trong phương pháp lai acid nucleic có phương pháp sử dụng phương pháp lai alen với mẫu dò đặc hiệu (allel specific oligonucleotide), phương pháp thường dùng với kỹ thuật sau Các phương pháp lai acid nucleic 2.1 Phương pháp Southern blotting Kỹ thuật Southern phát vào năm 1975 Phương pháp lai Southern blot phương pháp lai DNA tế bào với mẫudò DNA Phương pháp cho phép nghiên cứu DNA gen, kiểm tra kết chuyển gen kiểm tra có mặt gen gen tế bào 10 - Phân tích kết phần mềm BioPRO Xác định tính di truyền phần mềm thông dụng Các số liệu thu cho thấy - gần gũi hay cách biệt di truyền mẫu nghiên cứu Hệ số đồng dạng di truyền tính theo công thức M Nei & Li (1979) Sij=2Nij/Ni+Nj Ni: số vạch giống i Nj: số vạch giống j Nij: số vạch chung giống i j Ứng dụng Kỹ thuật RAPD ứng dụng đê nghiên cứu đa dạng di truyền giống Phát khả di truyền liên quan đến tính trạng: chương trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến tính trạng mà biểu bên kiểu hình (phynotype) tính trạng tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu phèn mặn Nhưng việc phân tích di truyền dựa kiểu hình thường kết dẽ bị sai lệch, kiểu hình tương tác kiểu gen môi trường Chính thế, nhà chọn giống cần phải biết tính trạng liên kết với kiểu gen nào, phương pháp RAPD giúp phát điều (Vương Đình Trị, 1998) Thiết lập đồ di truyền: từ quần thể cha mẹ F1 quần thể phân ly F2, người ta đánh giá băng diện , sau dùng phần mềm phổ biến Mapmarker để thiết lập đồ di truyền Sử dụng kỹ thuật RAPD ”Nghiên cứu đa dạng sinh học giống có múi huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang” Nhóm nghiên cứu sử dụng mồi A02, A04, A11 A13 phân tích đa dạng di truyền ; kết có 49 dấu phân tử ghi nhận Từ vẽ giản đồ phả hệ giống Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn Nguyễn Văn Được Tạp chí Khoa học 2004:1, trang 105114 Phương pháp RAPD có nhược điểm: - Sự xuất băng tính trội, điều không phân biệt cá thể đồng hợp - tửvà cá thể dị hợp tử Tính lập lại không cao primer primer ngẫu nhiên phụ thuộc điều kiện - phản ứng PCR Trở ngại việc giải thích băng có tốc độ di chuyển 20 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO Di truyền y học (Bộ y tế) – Chủ biên: GS TS Trịnh Văn Bảo 22 PHỤ LỤC Phụ lục 1: bước tách chiết ADN Phụ lục 2: qui trình tách chiết mARN 23 Phụ lục 3: bước phương pháp PCR Phụ lục 4: kết xét nghiệm PCR 24 Phụ lục 5: kết xét nghiệm PCR Phụ lục 6: bước phương pháp Sanger 25 Phụ lục 7: kết trình tự theo phương pháp Sanger 26 Phụ lục 8: kết trình tự theo phương pháp Maxam Gilbert Phụ lục 9: enzyme giới hạn Phụ lục 10: vị trí cắt số enzyme 27 Phụ lục 11: ADN dò Phụ lục 12: bước kỹ thuật Southern blot 28 Phụ lục 13: mô tả phương pháp Southern blot Phụ lục 14: đồ gen phương pháp Southern blot 29 Phụ lục 15: sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot Phụ lục 16: hệ thống dot-blot 30 Phụ lục 17: kết xét nghiệm FISH Phụ lục 18: quy trình dùng đoạn nối linker tạo ADN tái tổ hợp 31 Phụ lục 19: bước kỹ thuật RFLP 32 Phụ lục 20: bước kỹ thuật RFLP Phụ lục 21: ADN 33 Phụ lục 22: vân tay 34 [...].. .Phương pháp Southern Blotting được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: - Tách chiết gen PCR Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu) Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ y u bao gồm: - Tăng độ nh y - Giảm một số bước trong quá trình lai Mục đích của kỹ thuật: dò tìm một phân tử ADN trong. .. nghiệm phân tử Để ứng dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong y học như tách chiết - ADN – PCR • Trang thiết bị cơ bản M y ly tâm thông thường trong phòng thí nghiệm với ống ly tâm (5 – 100ml) hoặc ly - tâm ống nhỏ (0,5 - 2µl) M y ly tâm lạnh Tủ ấm, bình cách th y (tốt nhất là bình có lắc) Tủ lạnh từ 40C đến -200C hoặc -800C: t y mức độ bảo quản mẫu, có thể bảo quản ADN - trong nitơ lỏng... 19 - Phân tích kết quả bằng phần mềm BioPRO Xác định tính di truyền bằng các phần mềm thông dụng Các số liệu thu được cho th y - sự gần gũi hay cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu Hệ số đồng dạng di truyền có thể được tính theo công thức của M Nei & Li (1979) Sij=2Nij/Ni+Nj Ni: số vạch của giống i Nj: số vạch của giống j Nij: số vạch chung của 2 giống i và j Ứng dụng Kỹ thuật RAPD được ứng dụng. .. những phân tử chưa nhận ADN cho vì v y cần phân lập riêng phân tử lai, ví dụ trong trường hợp vi khuẩn kháng kháng sinh, có vi khuẩn vẫn mọc trong môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử cho mang tính cảm ứng với kháng sinh) , có vi khuẩn không mọc được trong môi trường đó vì đoạn ADN mang tính chất kháng kháng - sinh đã được thay bằng đoạn ADN cảm ứng với kháng sinh Bằng phương pháp vi sinh vật học, ... trong số rất nhiều phân tử ADN Đ y là một phương pháp đã được dùng để phát hiện bệnh ở mức độ phân tử Southern blotting cũng được dùng trong nhiều kỹ thuật lai ADN khác Các bước cơ bản của kỹ thuật: (phụ lục 12) - Tách chiết ADN từ các vật mẫu như bạch cầu, từ tế bào nước ối, tế bào ở tua rau thai… Phân tử ADN được cắt bằng enzyme giới hạn tạo nên những đoạn ADN có kích thước - khác nhau, trong số n y. .. với kiểu gen như thế nào, phương pháp RAPD cũng giúp phát hiện được điều n y (Vương Đình Trị, 1998) Thiết lập bản đồ di truyền: từ quần thể cha mẹ F1 và quần thể phân ly F2, người ta có thể đánh giá các băng hiện di n , sau đó dùng phần mềm phổ biến hiện nay là Mapmarker để thiết lập bản đồ di truyền Sử dụng kỹ thuật RAPD ”Nghiên cứu đa dạng sinh học của giống c y có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”... 2.2 Phương pháp Northern blotting Khác với phương pháp Southern blotting, acid nucleic đích ở đ y là ARN chứ không phải ADN Phát hiện ARN bằng cách lai với cADN đã đánh dấu cho nên kỹ thuật n y được gọi là Northern blotting Phương pháp lai Northern blotting là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA Phương pháp n y được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một. .. phóng xạ để tạo phân tử lai RNA-DNA Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi  Lai tại chỗ Lai tại chỗ là phương pháp lai phân tử, trong đó, trình tự axit nucleic cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu axit nucleic mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào Các ứng dụng của kiểu lai n y rất đa dạng đi từ kĩ thuật định vị gen... phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô Phương pháp n y ít tốn kém hơn là lai Southern blot, mẫu dò được đánh dấu bằng huỳnh quang thay cho mẫu dò đánh dấu phóng xạ T y từng loại tế bào và mô có thể thực hiện các phương pháp lai tại chỗ khác nhau  Lai trên khuẩn lạc Phương pháp n y được sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn... ADN bất lợi để tạo nên những phân tử ADN lai quy định tổng hợp nên sản phẩm (chế phẩm) có chất lượng cao, với số lượng nhiều hơn, thời gian sản xuất ngắn hơn Để thực hiện được kỹ thuật n y cần: phân tử ADN cho (có chất lượng tốt), phân tử - ADN nhận (có khả năng nhân lên nhanh) Các bước cơ bản của kỹ thuật n y bao gồm: Chọn ADN cho và ADN nhận hay còn gọi là vector (thể truyền) Vector thường được - dùng