Mọi nghiên cứu và ứng dụng của công nghệ gen đều được bắt đầu từ việc thu nhận một lượng axit nucleic tinh sạch. Mối quan tân đầu tiên của kỹ thuật tách chiết axit nucleic là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy bởi tác nhân cơ học, tác nhân hóa học và enzyme như RNase, DNase.
Các phương pháp tách chiết axit nucleic Các phương pháp tách chiết axit nucleic Bởi: Bùi Chí Bửu Mọi nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen việc thu nhận lượng axit nucleic tinh Mối quan tân kỹ thuật tách chiết axit nucleic thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn, không bị phân hủy tác nhân học, tác nhân hóa học enzyme RNase, DNase Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn DNA có kích thước lớn, việc chiết tách cần phải tránh tác nhân học, hoá học tới phân tử DNA Việc tách DNA từ tế bào vi khuẩn chia làm bốn bước Nuôi cấy thu sinh khối Tùy loại vi khuẩn mà người nghiên cứu chuẩn bị môi trường điều kiện nuôi cấy khác nhiệt độ, độ pH, điều kiện dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi khuẩn Tách tế bào khỏi dịch nuôi cấy cách ly tâm làm tế bào Thông thường khoảng 1.000ml dịch nuôi cấy li tâm thu lấy khoảng 10ml cặn vi khuẩn Phá vỡ màng tế bào giải phóng thành phần bên Axít nucleic giải phóng khỏi màng tế bào phương pháp hóa học sinh học để thu dịch chiết tế bào Enzyme lysozyme enzyme có lòng trắng trứng phage T4, có khả phá vỡ thành phần trùng hợp thành tế bào EDTA (TrilonB) tạo phức với Mg +2 dạng hòa tan làm vỡ thành tế bào Đồng thời EDTA ngăn không cho enzyme tế bào phân hủy DNA Người ta phá vỡ màng tế bào giải phóng DNA khỏi liên kết histon chất tẩy rửa SDS (Sodium Derecyl Sylfat) enzyme protease 1/6 Các phương pháp tách chiết axit nucleic Các chất phá vỡ màng làm li giải màng, tách rời phần tử lipit gây gẫy màng tế bào Làm DNA từ dịch chiết tế bào Loại bỏ thành phần không mong muốn protein, lipit thành phần khác kết tủa phân đoạn Mẫu lắc mạnh hệ dung môi phenol-chloroform để biến tính, kết tủa protein giải phóng axít nucleic vào dung dịch lỏng Protein bị biến tính tách khỏi pha nước có chứa DNA tách nhờ ly tâm Dịch gồm axit nucleic nước hút tiếp tục phân hủy RNA enzyme RNase Sau đó, tách DNA nước để thực bước phân tích Thu hồi DNA dạng đặc Mục đích bước thu DNA dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme Có phương pháp kết tủa Kết tủa DNA etanol với có mặt Na+ nồng độ cao, nhiệt độ thấp, tỷ lệ etanol mẫu phân tích 3:1 Kết tủa izopropanol, tỷ lệ rượu mẫu 1:1 Với phương pháp không cần có mặt muối loại DNA có phân tử lượng thấp Ly tâm cao tốc thu nhận DNA dạng cô đặc Trong hai phương pháp, DNA thu rửa etanol-70% để loại izopropanol muối để thu DNA tinh khiết Phương pháp tách DNA plasmid Việc tách DNA plasmid khỏi DNA nhiễm sắc thể khó khăn Tuy nhiên người ta dựa vào khác lý hóa hai loại DNA như: kích thước, hình thái, cấu trúc chúng Về nguyên tắc tiến hành theo bước sau Bước Sau thu hồi làm tế bào có chứa plasmid, người ta xử lý hỗn hợp SDS, EDTA NaOH làm DNA sợi đôi biến tính thành DNA sợi đơn nằm cạnh 2/6 Các phương pháp tách chiết axit nucleic Bước Xử lý hỗn hợp môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein SDS dạng tập hợp Bước Đưa môi trường trung tính, DNA sợi đơn hồi tính trở lại Còn DNA (NST) dài nên hồi tính chậm kết tủa SDS Tách DNA plasmid cách kết tủa etanol izopropanol, sau ly tâm tách plasmid tinh Tách DNA tế bào khác Ngoài vi khuẩn, DNA virus, tế bào thực vât, động vật tiến hành tách để phục vụ cho công nghệ di truyền Các giai đoạn làm tương tự Chỉ có giai đoạn nuôi cấy phá vỡ màng tế bào khác, nhiên, tùy loại tế bào mà có cách xử lý cho thích hợp Phương pháp tách RNA tổng số mRNA Tách RNA tổng số RNA tiến hành chiết tách gồm bước tương tự DNA (bao gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) ta dùng enzyme desoxyribonuclease (DNase) để phân huỷ DNA Do RNA bền dể bị phân huỷ enzyme ribonuclease (RNase) có nhiều khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90°C), vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải tiến hành môi trường vô nghiêm ngặt Phương pháp chung để tách RNA tổng số tiến hành sau Tế bào nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng để biến tính protein Đồng thời mẫu nghiền với chất khử (2-mercaptoethanol) để ức chế RNase Nước sử dụng xử lý với DEPC (Diethylpyrocarbonat) để loại bỏ RNase Các protein, DNA loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol (phenol pH=4, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), ly tâm, ta tách RNA pha nước DNA pH=4 bị hấp phụ vào pha với phenol, protein biến tính nằm hai pha bị loại với DNA với pha phenol RNA pha nước hút sau tủa izopropanol để -20°C, li tâm rửa lại bàng ethalnol 79%, thu hồi RNA tinh khiết, bảo quản lạnh để làm thí nghiệm Chất lượng RNA tổng số đánh giá sơ qua điện di gel agarose 3/6 Các phương pháp tách chiết axit nucleic Tách loại RNA khác Dựa vào kích thước trọng lượng phân tử, người ta tiến hành sắc kí, điện di ly tâm để tách loại RNA Phương pháp tách mRNA Do kích thước bé lại chiếm lượng nhỏ (1÷5%) RNA tổng số, có cấu trúc đa dạng nên tách phương pháp Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA, đó, người ta tách mRNA khỏi mẫu phương pháp sắc ký lực oligodt-xenlulose Ngày thị trường có loại viên bi từ, bề mặt có gắn oligodt Sau mRNA bám bề mặt viên bi từ, thông qua liên kết bổ sung với oligodt, viên bi thu nhận đem ly tâm ta thu mRNA tinh khiết Lưu ý rằng, để tách mRNA, người ta từ tế bào biệt hoá, lượng mRNA nhiều đường nghiên cứu cấu trúc gen mã hoá Ngày người ta tổng hợp ngân hàng mRNA Tách thu nhận gen Ngày nay, người ta thu nhận gen để thực kỹ thuật di truyền ba phương pháp Tách đoạn DNA từ gen Đây phương pháp sử dụng rộng rãi từ buổi phát triển kỹ thuật DNA tái tổ hợp Toàn phân tử DNA sinh vật cắt nhỏ thành đoạn có kích thước 1,5÷2kb restriction enzyme (RE) Điện di sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết, sau gắn vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tái tổ hợp Nhược điểm tốn nhiều công sức thời gian ngày người ta sử dụng để tạo ngân hàng DNA gen (genonic DNA libraries) Sự tổng hợp gen phương pháp hoá học Năm 1969, gen nhân tạo tổng hợp nhóm nghiên cứu Khorama, gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) nấm men gồm 77 cặp nucleotide Gen không biểu trình tự điều hoà Về sau, nhóm tổng hợp gen có hoạt tính: gen mã hóa cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine E Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide 4/6 Các phương pháp tách chiết axit nucleic Vào năm 1977, K Itakura Boyer tổng hợp gen mã hóa sinh tổng hợp hormone somatostatin động vật có vú biểu E Coli từ đó, nòi E Coli mang gen tổng hợp hóa học tạo Sau này, người ta tổng hợp hóa học gen mã hóa hormone tăng trưởng người dàì 584pb Phương pháp tổng hợp hóa học gen sử dụng để tạo nòi vi khuẩn tổng hợp insulin, loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người Gen insuline tổng hợp từ 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, nối lại nhờ enzyme lygase để tạo hai chuỗi polynucleotide dài 271 286bp mã hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit Qua kết thu được, nhà khoa học khẳng định rằng: muốn tổng hợp gen phương pháp hoá học cần phải biết trình tự axit amin protein mà gen chịu trách nhiệm tổng hợp Sinh tổng hợp gen từ mRNA Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật Gubler Hoffman với có mặt enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase - Hình dưới) Sau đó, cDNA (complementary) gắn vào plasmid biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA Phương pháp trình bày Chương (thiết lập thư viện cDNA) Ưu điểm là: Gen thu nhận phương pháp loại bỏ trình tự không mã hoá Bằng đường này, người ta tạo dòng gen mã hoá tổng hợp globine người, động vật chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) fibroin tơ tằm Vào năm 1992 nhà khoa học Mỹ tạo dòng cDNA 2.375 gen não người Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày phát triển, kết hợp với phương pháp khác sinh học phân tử ứng dụng nhiều lĩnh vực 5/6 Các phương pháp tách chiết axit nucleic Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA 6/6