Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết giới thiệu một số kết quả bước đầu trong quy trình chọn dòng lúa kháng bệnh đạo ôn bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp sự trợ giúp của các dấu phân tử. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
26(3): 48-55 Tạp chí Sinh học 9-2004 Tạo dòng lúa kháng bệnh đạo ôn có chất lợng gạo tốt phơng pháp nuôi cấy bao phấn kỹ thuật PCR Phan Thị Bảy, Đào Thị Hạnh, Quách Thị Liên, Lê Thị Muội, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ sinh học Ngoài tiêu suất chất lợng, giống lúa đợc phát triển cải tạo cần phải có khả chống chịu với sâu bệnh , chống chịu với điều kiện bất lợi môi trờng thích nghi với điều kiện ngoại cảnh đa dạng phát triển đợc vùng địa lý khác suất cao chất lợng tốt Trong này, giới thiệu số kết bớc đầu quy trình chọn dòng lúa kháng bệnh đạo ôn phơng pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp trợ giúp dấu phân tử I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu - Một số dòng/giống lúa kháng bệnh đạo ôn Moroberekan-nhận từ Viện nghiên cứu lúa quốc tế C71 Tẻ tép nhận từ Viện Bảo vệ thực vật BR12 dòng lúa kháng bệnh đạo ôn chọn tạo phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học - Hai gièng lóa cã chÊt l−ỵng tèt KDML105, WAB56-125 nhËn tõ Viện nghiên cứu lúa quốc tế - Khang dân giống lúa có suất cao chất lợng nhận từ Viện Bảo vệ thực vật - Cây F1 cặp lai: Moroberekan/KDM L 105 Moroberekan/WAB 56-125 BR12/WAB56-125 C71/ KDML105 Khang dân/Moroberekan 48 WAB56-125/Tẻ tép - Các mồi STS: RG64 mồi liên kết với gien kháng bệnh đạo ôn Pi-2(t) RG28 mồi liên kết với tính thơm gạo RG171 G243 mồi liên kết với độ bền gel Wxa Wxb mồi liên kết với hàm lợng amyloza RZ323 mồi liên kết với độ dài hạt Phơng pháp Lai giống phơng pháp lai cổ điển Nuôi cấy bao phấn: Các đòng lúa đợc lấy giai đoạn có tai đòng cách tai thứ chừng 2-5 cm, tuỳ thuộc dòng/giống lúa khác Đòng đợc lấy vào buổi sáng từ 910h Đòng đợc xử lý lạnh trớc đem cấy điều kiện 6-8oC thời gian 2-5 ngày Khử trùng đòng cách dùng tẩm cồn 96o lau kỹ toàn bề mặt đòng, sau tách bỏ lớp bẹ bao bọc bên lớp vỏ mỏng bên Chọn hoa có hạt phấn giai đoạn đơn nhân, cắt lấy bao phấn cấy lên môi trờng tạo mô sẹo Tạo mô sẹo từ bao phấn lúa môi trờng MT4 (N6 + mg/l 2,4D +10 mg/l AgNO3 +0,5 mg/l kinetin +8 g/l th¹ch + 60 g/l đờng), điều kiện không chiếu sáng nhiệt độ phòng 26-28oC Tái sinh từ mô sẹo nuôi cấy bao phấn môi trờng MSC1 (MS + mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 100 ml/l nớc dừa + 30 g/l đờng + g/l thạch), tạo rễ môi trờng MS chất kích thích sinh trởng, điều kiện ánh sáng đèn nê-ông nhiệt độ phòng 28oC Trồng ruộng thí nghiệm, đánh giá tiêu nông sinh học theo phơng pháp thông dụng Trung tâm Khảo nghiệm giống trồng thuộc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn chuẩn hóa chất lợng nông sản, Viện Công nghệ sau thu hoạch, tháng 12 năm 2002 Phản ứng PCR đợc tiến hành nh sau Kết tạo mô sẹo tái sinh từ nuôi cấy bao phấn Hỗn hợp phản ứng PCR với mồi STS (25 µl) chøa èng Eppendorf (0,5 ml) bao gåm: n−íc vô trùng 17,4 àl; dung dịch đệm 10 X PCR 2,5 µl; dNTP (5 mM) 0,6 µl; MgCl2 (50 mM) 0,5 µl; måi (primer) µl ; Taq polymeraza 0,5 µl; ADN mÉu t¸ch tõ l¸ lóa 2,5 µl ( 0,02 àg/àl) Chơng trình chạy PCR cho mồi STS: 1) 94oC phót; 2) 40 chu kú (94oC phót, 58oC 30 gi©y, 72oC phót); 3) 72oC phút Điện di đọc kết PCR: Sản phẩm PCR đợc kiểm tra phơng pháp điện di gel agaroza 1% Mẫu ADN (sản phẩm PCR) đợc trộn với đệm nạp mẫu 3X trớc nạp mẫu vào giếng Thời gian điện di khoảng giê ë ®iƯn thÕ 70V Nhm ADN b»ng EtBr, thêi gian 30 Rưa gel b»ng n−íc cÊt 30 phút Sau gel đợc quan sát chụp ảnh dới đèn tử ngoại Phân tích tiêu sinh hóa theo phơng pháp thông dụng Trung tâm kiểm tra tiêu II Kết thảo ln Trong nu«i cÊy bao phÊn, cã nhiỊu u tè ảnh hởng đến khả phát triển mô sẹo tái sinh cây, nhng yếu tố quan trọng kiểu gien đa vào nuôi cấy Các bao phấn đ khử trùng đợc cấy lên môi trờng MT4; sau 4-6 tuần, số bao phấn bắt đầu phát triển thành khối mô sẹo màu trắng Khi khối mô sẹo đ lớn, đạt đờng kính khoảng chừng 1-2 mm, chúng đợc cấy chuyển sang bình chứa môi trờng tái sinh MSC1 Các bình mô tái sinh đợc nuôi điều kiện ánh sáng đèn nê-ông, nhiệt độ phòng 26-28oC Sau 3-4 tuần nuôi cấy, số mô sẹo bắt đầu tạo chồi, kết tạo chồi đợc ghi nhận bảng Các chồi tái sinh đợc chuyển sang môi trờng MS chất kích thích sinh trởng để phát triển thành hoàn chỉnh (lá, thân, rễ) Sau đó, hoàn chỉnh đợc trồng nhà kính, tiếp tục theo dõi, đánh giá chọn dòng nhị bội có đặc điểm nh mong muốn Bảng Kết tạo mô sẹo tái sinh từ nuôi cấy bao phấn Cặp Số bao phấn nuôi cấy lai Tái sinh Số mô sẹo hình thành cấy chuyển Số mô tái sinh Số mô tạo xanh Số mô tạo bạch tạng Số mô % Số mô % Số mô % Sè m« % 750 38 5,1 12 31,5 16,6 10 83,4 720 130 18 94 72,3 32 34 62 66 870 285 32,7 44 15,4 15 34 29 66 1050 140 13,3 16 14,4 12,5 14 87,5 1870 131 59 45 56 95 2160 248 11 111 44 29 20 82 74 Chú thích: thứ tự cặp lai xem trang Kết nhận đợc (bảng 1) cho thấy khả tạo mô sẹo dòng lai khác môi trờng nuôi cấy chọn lọc khác thay đổi từ 5,1-32,7% Tỷ lệ tạo mô sẹo 49 cao F1 cđa cỈp lai sè (BR12/ WAB56-125), thÊp nhÊt F1 cặp lai số (Moroberekan/KDML105) Số liệu bảng cho thấy khả tái sinh từ mô sẹo dòng lai nói thay đổi từ 14,4-72,3%, cao F1 cđa cỈp lai sè (Moroberekan/WAB56-125), thÊp nhÊt ë F1 cặp lai số (C71/ KDML105) Khả phát triển xanh quần thể tái sinh khác Sự phát triển xanh mô sẹo F1 cặp lai số cao nhất, đạt tỷ lệ 34% chồi khỏe (hình 1), chồi có thân màu xanh đậm, mô sẹo từ F1 cặp lai số số phần lớn bình nuôi cấy toàn cho bạch tạng (hình 2), tỷ lệ xanh thấp cặp lai số (Kháng dân/Moroberekan), đạt 5% Hình Hình Kết nhận đợc cho thấy kiểu gien có ảnh hởng lớn đến khả tạo mô sẹo tái sinh xanh nuôi cấy bao phấn Các kết mà nhận đợc phù hợp với kết nghiên cứu trớc Nghiêm Nh Vân cs (1996), Phạm Ngọc Lơng cs (1999), Nguyễn Đức Thành cs (1999) Trong thí nghiệm này, tập trung nghiên cứu quần thể tái sinh từ nuôi cấy bao phấn cặp lai số 2; cặp lai nhận đợc số dòng xanh nhiều số cặp lai kể lới có 195 từ 15 dòng mô sẹo (47%) đơn bội 285 từ 17 dòng mô sẹo (53%) nhị bội Trong số 17 dòng cho nhị bội, có 12 dòng có số lợng lớn sinh trởng phát triển tốt, dòng khác có 1-2 Các tái sinh từ khối mô sẹo đợc tính dòng trình thí nghiệm 12 dòng từ bao phấn có khả sinh trởng tốt nhà kính bố mẹ, F1 cặp lai số đợc lấy mẫu để tách ADN Sự đa dạng phân tử ADN dòng/giống lúa đợc phân tích kỹ tht PCR víi mét sè cỈp måi STS (RG64, RG28, RG171, Wx1, Wxa, Wxb, G243, RZ323) Điện di đồ sản phẩm PCR nhận đợc: có mồi RG64 cho khác bố, mẹ, F1 dòng nuôi cấy bao phấn (hình 3), sản phÈm PCR cđa ADN cđa c¸c gièng lóa Moroberekan, WAB56-125, KDML105, Tẻ tép, Khảo sát tính kháng bệnh đạo ôn chất lợng gạo mức phân tử số dòng nuôi cấy bao phấn Trong 480 tái sinh từ 32 dòng mô sẹo nuôi cÊy bao phÊn cđa cỈp lai sè trång nhà 50 BR12 với mồi liên quan đến chất lợng hạt, cho băng ADN giống hệt nhau, cha có đa hình dòng/giống lúa (h×nh 4) 10 11 12 13 14 15 16 17