Khảo sát khả năng phát sinh mô sẹo (Callus) và tái sinh cây bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro trên một số tổ hợp lai của lúa (Oryza sativa L)

i LI CM N u tiên, con xin cm n ba má đư sinh con ra, dy d, nuôi nng cho con n hc nên ngi K đn, em xin gi li cm n chơn thƠnh đn tt c thy cô trong khoa Công ngh sinh hc đư truyn đt cho em kin thc trong sut quá trình hc tp. Em xin gi li cm n sơu sc đn cô Lê Th Kính đư hng dn em thc hin đ tài. Em cm n anh Hi, ch Trang, anh Khánh cng nh các ch trong t Nuôi Cy Mô ca Trung Tâm Nghiên Cu Ging Cây Trng Min Nam đư luôn giúp đ em trong thi gian qua. ii Mc lc I. TNG QUAN 1 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1 1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii 1 1.1.2. Tình hình nuôi cy bao phn  Vit Nam 4 1.2. C s khoa hc ca nuôi cy in vitro 6 1.2.1. Tính toƠn nng ca t bào 6 1.2.2. S phân hoá và phn phân hoá t bào 7 1.2.3. C ch di truyn thông qua các th h t bào 8 1.2.4. Môi trng nuôi cy (môi trng dinh dng) 9 1.2.5. iu kin vô trùng 10 1.2.6. iu kin ánh sáng và nhit đ 10 1.2.7. Vt liu nuôi cy 11 1.3. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy bao phn lúa 12 1.3.1. Kiu gen ca cây cho bao phn 12 1.3.2. Giai đon phát trin ca bao phn 12 1.3.3. iu kin sinh lý ca cây cho bao phn 13 1.3.4. Nhit đ và thi gian x lỦ đòng 13 1.4. Các giai đon chính trong nuôi cy bao phn 14 1.4.1. Khái nim nuôi cy bao phn 14 1.4.2. Các giai đon chính 15 1.5. K thut đn bi in vitro và công tác ging cây trng 17 1.5.1. Cơy đn bi 17 1.5.2. K thut đn bi trong công tác chn to ging cây trng 18 II. VT LIU VÀ PHNG PHÁP NGHIÊN CU 22 iii II.1 Vt liu. 22 II.1.1 a đim và thi gian thí nghim 22 II.1.2 Vt liu 22 II.2 Phng pháp nghiên cu. 22 II.2.1 Kho sát kh nng to mô so (callus) ca mt s kiu gen (thí nghim 1).22 II.2.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 23 II.2.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 25 III. KT QU VÀ THO LUN 26 III.1 Kho sát kh nng to mô so ca mt s kiu gen (thí nghim 1). 26 III.2 Kho sát kh nng tái sinh cơy ca mt s kiu gen (thí nghim 2). 28 III.3 Xác đnh cơy đn bi vƠ đn bi kép. 34 IV. KT LUN VÀ  NGH 40 IV.1 Kt lun 40 IV.2  ngh 40 iv Mc lc Hình nh, Bng và Biu đ Hình 1: Chiu dƠi đng lúa cn thu khong 20 cm 24 Hình 2: V trí ly bông lúa t đng lúa 24 Hình 3: Gié lúa thích hp cho nuôi cy bao phn (A), bao phn tách ri (B) (3x) 25 Hình 4: on bông lúa chun b đem cy bao phn 25 Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26 Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái sinh MS 28 Hình 7: Quá trình phát trin mô so ca t hp lai LL5 29 Hình 10: Mô so cht (t hp lai LL3) 32 Hình 11: Cây bch tng ậ LL5 (2 tun tui) 33 Hình 12: Cơy bình thng ậ LL5 (2 tun tui) 33 Hình 13: Cây bch tng ậLL5 (1 tháng tui) 34 Hình 14: Cơy bình thng ậ LL5 (1 tháng tui) 34 Hình 15: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 (A) và LL2 (B) 1 tháng tui34 Hình 16: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 45 ngày tui 35 Hình 17: cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 2 tháng tui 35 Hình 18: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 3 tháng tui 36 Hình 19: Chun b thu ht 36 Hình 20: S khác bit v kh nng sinh trng và phát trin gia cơy đn bi vƠ đn bi kép, (A) cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5, (B) cơy đn bi ậ t hp lai khác 37 Hình 21: S khác bit v hoa ca cơy đn bi kép ậ t hp lai LL5 (A) vƠ cơy đn bi ậ t hp lai khác (B) 38 Bng 1: Bng b trí nghim thc 22 Bng 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 26 v Bng 3: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 29 Biu đ 1: nh hng ca kiu gen đn kh nng to mô so 27 Biu đ 2: nh hng ca kiu gen đn kh nng phát trin ca mô so 30 Biu đ 3: nh hng ca kiu gen đn s bit hóa ca mô so 31 Biu đ 4: nh hng ca kiu gen đn kh nng to cây tái sinh 33 Bng vit tt Cs: cng s IAA: Indole-3-acetic acid NAA: 1-Naphthaleneacetic acid BA: 6-Benzylaminopurine 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid vi T VN  Cây lúa (Oryza sativa L.) lƠ cơy lng thc gi vai trò quan trng hƠng đu. Mi nm, khong 1/2 dân s th gii s dng lúa go lƠm lng thc chính. Lúa đc trng ph bin  các nc Châu Á, Châu Phi, Châu M La Tinh. i vi các nc Chơu nh: n , Trung Quc, Indonesia, Bangladesh, Myanmar, Thái Lan và Vit Nam thì lúa go lƠ cơy lng thc đc bit quan trng trong đi sng con ngi. Trong nhng nm gn đơy, cùng vi đƠ tng dơn s, s phát trin mnh m ca nn công nghip vƠ đô th hoá nông thôn làm cho din tích đt trng trt ngày càng thu hp li.  đáp ng đ nhu cu lúa go ca ngi tiêu dùng vƠ an ninh lng thc quc gia, các nhà to ging phi tìm cách lƠm tng nng sut, sn lng lúa trên din tích đt trng không th m rng. Phng án s dng các bin pháp k thut thâm canh trên nhng ging lúa cao sn, chu thâm canh là thích hp nht. Bng phng pháp lai to truyn thng các nhà to ging đư có nhiu thành công vi nhng ging mi có nng sut và sn lng cao. Song vic s dng phng pháp này tuy có to ra nhng t hp lai nng sut cao nhng đ thun cha n đnh. Mt khác, nu áp dng phng pháp lai to truyn thng thì phi mt khong 10 v (4-5 nm) mi có đc dòng thun. Trong nhng nm gn đơy, vic ng dng bin pháp nuôi cy bao phn to các dòng đn bi kép, nhanh chóng to các ging lúa thun có nng sut cao, chng chu tt, đư thu đc nhiu kt qu. ó lƠ phng pháp to dòng thun nhanh (1 nm) và hiu qu nht.  thành công trong vic to các dòng thun bng k thut nuôi cy chúng ta phi xác đnh đc nhng yu t v kiu gen, môi trng dinh dng, các tác nhân vt lý, hoá hc… Trong đó, kiu gen là yu t đc nhiu nhà khoa hc đt lên hƠng đu (Sharmin S. 2003, Sharmin S.2004) do nó nh hng rt ln đn kh nng to mô so cng nh s lng, cht lng cây tái sinh. Tuy nhiên, đó lƠ nhng nghiên cu  nc vii ngoài, trong khi các ging lúa  nc ta phát trin  nhit đ, điu kin sinh trng khác nhau. Do đó, yu t kiu gen cn đc kho sát li nhm xác đnh phng pháp nuôi cy bao phn có hoàn toàn thích hp cho tt c các kiu gen ca lúa  nc ta hay không, hay ch ti u cho mt s kiu gen thôi. Xut phát t nhng vn đ trên, chúng tôi tin hành thc hin đ tài: Kho sát kh nng phát sinh mô so (callus) và tái sinh cây bng phng pháp nuôi cy bao phn in vitro trên mt s t hp lai ca lúa (Oryza sativa L.)”. 1 I. TNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1.1.1. Tình hình nuôi cy bao phn lúa trên th gii Nm 1968 Nishi vƠ cng s là nhng tác gi đu tiên thƠnh công trong lnh vc nuôi cy bao phn trên nhng cây mt lá mm sau khi công b kt qu tái sinh cây lúa hoàn chnh t mô so. Sau đó, hƠng lot các tác gi cng công b nhng kt qu kh quan nh: Chu et. al (1975), Chen (1977),. Kt qu to cơy đn bi và lng bi thun thu đc ch yu  loài ph Japonica, đi vi loài ph Indica thì kt qu cha cao. Các ging lúa có ngun gc h ph Indica là nhng ging lúa khó tính trong vic nuôi cy bao phn.  tin ti thành công, các nhà khoa hc đư vƠ đang tìm cách xác đnh s nh hng ca các yu t có tác đng trc tip hoc gián tip đn quá trình nuôi cy. Các yu t đó lƠ: Kiu gen ca cây cho phn, giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu, thành phn môi trng nuôi cy, các yu t vt lý nh nhit đ, ánh sáng * nh hng ca kiu gen cây cho bao phn: S thay đi ca tn s to mô so và kh nng tái sinh ca mô so  phn hoa ph thuc phn ln vào kiu gen ca cây. Kt qu quan sát ca Sharmin S. (2004) cho thy s khác bit ca các kiu gen kéo theo s khác bit trong kh nng nuôi cy lúa. Kiu gen loài ph Indica phát trin và to mô so kém so vi loài ph Japonica. Theo Mathias và Fukki (1986) kh nng tái sinh ca cây lúa trong nuôi cy t bào b chi phi bi s tng tác t bào cht, nhân ca chính nó. * nh hng ca giai đon phát trin ca cây trong thi đim ly mu Các tác gi Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thy: mu bao phn đc ly vào thi đim các tiu bào t trong bao phn đang  giai đon đn bƠo mun là tt nht. Bao phn  giai đon t th không có kh nng phát trin trong môi trng nuôi cy in vitro, Bao phn  giai đon đn bƠo sm phát trin kém. 2 Ht phn ch có th phát trin tt khi đư tách ra khi t t (giai đon đn bƠo gia đn đn bƠo mun). *nh hng ca nhit đ và thi gian x lý đòng Kêt qu nghiên cu ca Zhou vƠ Cs (1983) đư cho thy rng: X lỦ đòng  nhit đ thp rt có hiu qu trong nuôi cy bao phn lúa. iu kin lnh lƠm tng kh nng to cây xanh.  Chaleff và Cs (1975) x lỦ đòng  6 o C trong 5 ngày  Hu vƠ Cs (1978) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10 0 C trong thi gian 4 - 8 ngày.  Matitin vƠ Drimo Millo (1981) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 2 ậ 4 o C trong thi gian 48h.  Gupta vƠ Borthakeu (1987) đư x lỦ đòng lúa  nhit đ 10 0 C trong thi gian 11 ngày.  Guapta, Quimio và Zapata (1990) x lỦ đòng  6-8 o C trong thi gian 8 ngày.  Rush và cng s (1982) đư tin hành x lỦ đòng lúa  nhit đ 40 o C trong thi gian 15 phút.  Nm 1886, Torrizo x lỦ đòng  35 o C trong 15 phút cng cho kt qu kh quan. Nói chung, đư có nhiu thí nghim nghiên cu v s nh hng ca nhit đ và thi gian x lỦ đòng đn kt qu nuôi cy bao phn lúa. Kt qu nghiên cu ca các tác gi cho thy rng x lỦ đòng  nhit đ khác nhau s cho nhng kt qu nuôi cy khác nhau * nh hng ca nng đ Cacbon đn quá trình to mô so và tái sinh cây. Nng đ cacbon có th lƠm thay đi t l hình thành mô so và kh nng tái sinh cây trong nuôi cy bao phn lúa. Chen (1978) cho bit đng có tác dng lƠm thay đi áp sut thm thu ca môi trng nuôi cy. Nng đ đng trong môi trng nuôi cy t 6 - 8% s lƠm tng c hai quá trình hình thành mô so và tái sinh tip theo. 3 Nm 1988 Kim vƠ Paghavan thông báo rng: T l hình thành mô so t bao phn s gim đi khi nng đ đng trong môi trng nuôi cy cao (8 -12%) * nh hng ca cht điu hoà sinh trng đn quá trình to mô so và tái sinh cây. Trong k thut nuôi cy bao phn lúa, các cht điu hoà sinh trng có th s dng  dng đn hay kt hp theo nhng t l khác nhau Nm 1980, Khi nuôi cy bao phn lúa Japonica, Yang và cng s đư s dng kt hp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l . Kt qu cho thy rng nu môi trng to mô so có cha 2,4D nng đ 1mg/l thì mô so d dàng tái sinh thành cây. Theo Wasakd (1982): IAA xúc tin quá trình hình thành r, S kt hp các auxin: IAA, NAA, Kinetin mt cách hp lý s xúc tin mnh m quá trình phân hoá t bào và tái sinh cây xanh. Nhìn chung, các cht tham gia vào môi trng nuôi cy bao phn lúa nh cht điu hoà sinh trng, mui, đng, st, Vitamin đu có s nh hng ln nhau và nh hng chung đn kt qu ca quá trình nuôi cy. * nh hng ca các yu t vt lý trong môi trng Các yu t vt lý ca môi trng bao gm:  Trng thái vt lý ca môi trng  dng rn hay lng   pH môi trng   m không khí  Ánh sáng và nhit đ ca phòng nuôi cy Các yu t trên tác dng trc tip đn s hình thành mô so và kh nng tái sinh chi. Kt qu nghiên cu lúa mì ca Bjarmsta (1989) cho thy rng x lý ánh sáng cng đ cao s kìm hãm quá trình to mô so nhng li kích thích quá trình to cây [...]... t ng d a vào s phân hóa và ph n phân hóa c a t a t bào th c v ng i ta th tính u khi n s phát sinh hình thái c a mô nuôi c y, ng b sung vào môi ng nuôi c y 2 nhóm ch u ti t sinh tr ng th c v t là auxin và cytokinin N u t l auxin/cytokinin th p thì s phát sinh hình thái theo h ng t o ch i; n u t l này cao thì t o thành r , còn khi t l này cân b ng thì s phát sinh theo h ng t o mô s o (Lê Tr n Bình, 2004)... i và dòng thu n cây lúa Nh k thu t nuôi c y bao ph n có th rút ng n th i gian ch n gi ng m i xu ng t n 6 th h và t o ra hàng lo t các dòng thu n m i Thành t u nuôi c y mô h a 19 h n nhi u tri n v tách r i i v i ch n t o gi ng lúa là tái sinh cây lúa t nuôi c y h t ph n c 2d c Japonica và Indica do Raina và Irfan công b c tái sinh t 80.000 h t ph n nuôi c 3.5 cm R t nhi ng kính c tái sinh t h t ph n... lai nào có kh m ng t o mô s o t t s cho r ng mô s c l i Trong thí nghi m này thì t h p lai LL5 cho s ng mô s o cao nh t và t h p lai LL 3 cho s ng mô s o th p nh t K t qu thí 27 nghi m trên phù h p v i nh nh nghiên c u c a Sarmin S., 2004 khi tác gi cho r ng ki u gen ng tr c ti p n kh o mô s o (Hình 6) Hình 6: Mô s o phát sinh t bao ph n lúa s sinh MS c chuy ng tái 28 B ng 3: ng c a ki n kh o cây tái. .. u nuôi c y nh nh sinh ng, ch i, bao ph n, gieo qua h t, thân m 11 1.3 Các 1.3.1 Ki u gen c a cây cho bao ph n nuôi c y có nh h ng r t l n k t qu nuôi c y Nuôi c y bao ph n c a các gi ng lúa thu c loài ph Japonica (k c không x lý l nh tr t t l thành cây th ng h p y bao ph n c a các gi ng lúa thu c loài ph Indica Chen và Lin (1981) còn th y r ng t l bao ph n t o callus, kh l cây xanh /cây b ch t ng và. .. t o thành cây lúa t h t ph n b ng ph pháp nuôi c y in vitro Sau nhi n hành nghiên c u v nuôi c y bao ph H u H và Nguy n ng k t lu n sau: - Trong mô túi ph n có ch t c ch - Gi a phôi dinh d nh h ng t i s phát tri n h t ph n ng và h t ph n ho c là gi a các phôi v i nhau luôn luôn có s c nh tranh làm c ch quá trình tái sinh cây - Trong môi ng nuôi c y, phôi dinh d ph n tách r i d ng nh b i phát tri n... loài Lan, môi ng MS thích h p cho 9 các loài cây thân th o và m t s loài cây thân g sinh tr ng nhanh nh Keo, B ch ng WMP ch thích h p cho các loài cây thân g (Tr Tu thu c vào t lo i môi it ng c th , trong m n nuôi c y, mà l a ch n ng thích h p thì m i có k t qu kh quan Thông th d ng môi ng H5 và môi 97) ng, ng i ta hay s ng N6 cho nuôi c y bao ph n lúa (Sharmin S., 2004) Nuôi c y in vitro là nuôi c u... trong phòng nuôi c y 1.4 Khi m u c y trong ng nghi sinh Yêu c u c n này là tái sinh m c nhi u mô s o thì ti n hành c y tái ng s phát tri n c a mô nuôi c y 15 c u khi n ch y u d a vào t ng nuôi c nghi ng s d ng ch l c a các h p ch t tái sinh m u nuôi c y trong ng nh, ch i nách, mô s 1.4 t o h s nhân ch i cao nh t, ti n hành c y chuy n các ch m c tái sinh ng m i ng nhân t o các ch ng: tb ng th ch u khi... phòng nuôi cây 1.2 Ánh sáng và nh tr là hai y u t chính có nh h n quá trình sinh ng c a mô nuôi c y (Thái Xuân Du, 2001) 1.2.6.1 Ánh sáng: S phát sinh hình thái c a mô nuôi c y ch u nh h gian chi u sáng, c ánh sáng và ch t l ng t các y u t nh : th i ng ánh sáng.Th i gian chi u sáng tác n quá trình phát tri n c a mô nuôi c y Th i gian chi u sáng thích h p v s các loài cây là 12 18 h/ngày 10 C n s phát sinh. .. c a bao ph n t i th nh h là tr ng r t quan tr c và gi n k t qu nuôi c m tách r i ra và nuôi c iv n h t ph n m ng nuôi c n ph n ng t t nh t u ki n n ng trong môi n 9% (Chen, 1978) Các tác gi Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho th y: M u bao ph n c l y vào th m các ti u bào t trong bao ph là t t nh t Bao ph n n t th không có kh nuôi c y in vitro Bao ph n th phát tri n t n n trong môi ng m phát. .. trình nuôi c y in vitro Môi ng nuôi c y là ngu n cung c p các ch t c n thi t cho s phân chia và phân hoá c a mô t bào trong su t quá trình nuôi c y Vì v y, môi ch t dinh d ng nuôi c y bao g m các nguyên t ng, ngu n các bon, các axitamin, các ch s ch t ph gia Thành ph n dinh d tr ng ph ng, các ch t c n thi t i v i h u h t các loài th c v t, Môi ng, vi l ng dinh d ng t t nh ng, hàm l u hoà sinh tr ng và . lúa chun b đem cy bao phn 25 Hình 5: Mô so phát sinh t bao phn lúa trên môi trng N6 sau 1 tháng nuôi cy 26 Hình 6: Mô so phát sinh t bao phn lúa s đc chuyn vƠo môi trng tái. tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 45 ngày tui 35 Hình 17: cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa LL5 ậ 2 tháng tui 35 Hình 18: Cây tái sinh t bao phn t hp lai ca lúa. (callus) và tái sinh cây bng phng pháp nuôi cy bao phn in vitro trên mt s t hp lai ca lúa (Oryza sativa L.)”. 1 I. TNG QUAN 1.1. Tình hình nghiên cu nuôi cy bao phn lúa. 1.1.1.