Bài viết nghiên cứu tạo đột biến ở vị trí axit Aspactic 101 (D101) của Enzym Epoxit Hydrolaza ở hạt đậu tương bằng kỹ thuật PCR. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
26(4): 41-45 12-2004 Tạp chí Sinh học Tạo đột biến ë vÞ trÝ axÝt aspactic 101 (D101) cđa enzym EPOxit hydrolaza hạt đậu tơng kỹ thuật PCR Nghiêm Ngäc Minh ViƯn C«ng nghƯ sinh häc Chikafusa Fukazawa ViƯn Công nghiệp thực phẩm quốc gia Nhật Bản Epoxit hydrolaza (EHs) enzym phổ biến có chức xúc tác để thủy phân vòng epoxy thành sản phÈm cã nhãm hydroxyl (diols) gÇn cã mặt phân tử nớc (H2O) Trong năm gần đây, số phòng thí nghiệm quan tâm nghiên cứu tới cấu trúc, vai trò chức enzym ngời [1, 2], động vật [3, 11], côn trùng [4] vi sinh vật [5, 6] Trong hạt thực vật có chứa số axít béo khác có vòng epoxy dẫn xuất chúng, có chức kháng nấm tự nhiên [7, 8] Năm 1995, Katsube cs công bố trình tự cDNA mã hoá cho enzym EH [9] Sau đó, Masaomi cs thông báo kết biểu làm đợc enzym hạt đậu tơng dạng hoà tan [10] Trong chuỗi axít amin EH, axÝt aspactic ë mét sè vÞ trÝ nh− D103 cđa Arabidopsis, D101 cđa thc l¸, D334 cđa ng−êi axít amin bảo thủ có vai trò định việc trì hoạt tính enzym chúng Để nghiên cứu vai trò vị trí D101 EH hạt đậu tuơng, tiến hành tạo đột biến trực tiếp vị trí (D101E, D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S) kỹ thuật PCR để phục vụ cho nghiên cứu mức độ biểu số tính chất khác enzym i phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu ADN plasmit có mang trình tự cDNA gien EH bình thờng hạt đậu tơng (dùng làm khuôn cho phản ứng PCR), lấy từ phòng thí nghiƯm cđa Dr Fukazawa- NhËt B¶n Takara Ex taqTM Kit cđa h·ng Takara Shuzo co., LTD NhËt B¶n: dïng phản ứng PCR, TA Cloning(R) Kit có véctơ pCR2.1, T4 DNA ligaza, tế bào khả biến E coli INV F' hãng InvitrogienTM Kit đọc trình tự: Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP (RPN 2438/ RPN 2538) hãng Amersham pharmacia biotech Mồi đọc trình tự: Fluorescein-Labeled Primer M4 (5´CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3´) vµ Fluorescein-Labeled Primer RV-M (5´CGCCAGGGTTTTCCCAGT CACGAC-3´) hãng Takara Shuzo co., LTD Nhật Bản Các enzym giới hạn Nde I EcoR I hãng Wako/ Nipon Giene Các cặp mồi đột biến đợc thiết kế dựa trình tự cDNA gien EH hạt đậu tơng có trình tự nh sau: D101E: AT GAT GGC TCC CCA CTC ATG AGC CAC AAG G D101Q: AT GAT GGC TCC CCA TTG ATG AGC CAC AAG G D101G: AT GAT GGC TCC CCA GCC ATG AGC CAC AAG G D101S: AT GAT GGC TCC CCA GGA ATG AGC CAC AAG G D101C: AT GAT GGC TCC CCA GCA ATG AGC CAC AAG G D101H: AT GAT GGC TCC CCA GTG ATG AGC CAC AAG G D101T: AT GAT GGC TCC CCA GGT ATG AGC CAC AAG G EH-Star-Sense2: ATATACATATGGAGCAAATAAAGCACAGAAC EH-End-Anti2: GTTGAATTCGTTTTTGGACAGATCAGAACTTG 41 Phơng pháp Phơng pháp PCR đợc sử dụng để nhân gien EH đột biến Điều kiện phản ứng PCR lần đợc tiến hành nh sau: H2O khử ion khử trùng: 31,5àl TM Dung dịch 10x Ex Taq àl Hỗn hợp dNTP àl EH-DNA khuôn (template) (10ng/ àl) àl Mồi EH-Start-Sense (20pmol) àl Mồi đột biến (20pmol) àl (gồm loại đợc tổng hợp) 0,5 àl Ex Taq: Tổng cộng: 50 µl NhiƯt ®é đ lµ 62 C, tiÕn hµnh 30 chu o kỳ Điều kiện phản ứng PCR lần đợc tiến hành nh sau: H2O khử ion khử trùng: 31,5 àl TM Dung dịch 10x Ex Taq àl Hỗn hợp dNTP àl EH-DNA khuôn (template) (10ng/µl) µl Måi EH-Start-Sense (20pmol) µl Sản phẩm PCR lần (1 nmol/àl) àl (Đun sôi 100oC phút, sau ủ đã) 0,5 àl Ex Taq: Tổng cộng: 50 àl Nhiệt độ ủ 64oC, tiến hành 30 chu kỳ - Phơng pháp tách ADN plasmit (Sambrook cs 1989) - Phơng pháp nhân dòng (cloning) đợc tiến hành theo hớng dẫn TA CloningR Kit đọc trình tự ADN Điều kiện phản ứng PCR cho việc đọc trình tự đợc tiến hành nh sau: H2O khử ion khử trùng: 22 àl Mồi M4 (hoặc RV-M) µl ADN plasmit (3,8 µg/µl) Tæng céng: 42 µl 25 àl Hỗn hợp phản ứng đợc chia ống eppendof (6,1àl/ ống) có sẵn àl loại dNTP (G, A, T, C) Sau hỗn hợp đợc chạy phản ứng PCR với chu trình nhiệt trải qua bớc nh sau: B−íc 1: [95oC/5 phót]/ 1chu kú B−íc 2: [95oC/30 gi©y –% 50oC/ 30 gi©y –% 72 C/ phót]/15 chu kú o B−íc 3: [95oC/30 gi©y –% 72oC/ phút]/15 chu kỳ Trớc tra mẫu vào gel để đọc trình tự, hỗn hợp phản ứng đợc làm nóng lên tới 94oC/5 phút làm lạnh nớc đá ii Kết thảo luận Kết thu nhận sản phẩm PCR lần Chúng sử dụng cặp mồi đột biến mồi EH-Star-Sense (có chứa vị trí cắt enzym Nde I vị trí khởi đầu phiên mã ATG) để nhân đoạn gien có kích thớc 326 bp (trong bao gồm vị trí đột biến cần quan tâm) Bằng kỹ thuật PCR với công thức phản ứng chu trình nhiệt nh nêu phần phơng pháp, nhận đợc kết nh sau: sau kiểm tra sản phẩm PCR lần điện di gel agaroza 1% nhận đợc băng ADN có kích thớc khoảng 326 bp đặc hiệu Băng ADN đợc cắt cách dùng túi thẩm tích điện di mét chiỊu ë 100V víi thêi gian lµ 30 Sau đó, ADN đợc làm bớc butanol b·o hoµ TE, phenol b·o hoµ TE, hỗn hợp clorophóc + isoamyl cuối đơc hoà tan dung dÞch TE (pH = 8) víi nång độ 1nmol/àl Nh vậy, sau cắt làm đoạn ADN (326 bp) sản phẩm PCR lần 1, có đoạn ADN (mỗi đoạn chứa vị trí đột biến khác nhau) đợc dùng làm mồi cho phản ứng PCR lần 2 Kết thu nhận sản phẩm PCR lần Chúng sử dụng đoạn ADN có kích thớc 326 bp (sản phẩm PCR lần 1) mồi EH- End-Anti (có vị trí cắt enzym EcoR I vị trí kết thúc phiên mã TGA) để nhân đoạn gien có kích thớc khoảng 1kb, gồm toàn chiều dài gien EH (cDNA) với vị trí đột biến cần quan tâm kỹ thuật PCR Trong phản ứng PCR lần này, sử dụng sản phẩm PCR lần có trọng lợng phân tử lớn (326 bp) làm mồi mà phải tăng nhiệt độ ủ lên 64oC để tạo điều kiện cho việc bắt cặp mồi sợi khuôn xảy đợc tốt Kết nhận đợc băng ADN có kích thớc khoảng gần 1kb đặc hiệu Những đoạn ADN có kích thớc khoảng kb (từ đột biến khác nhau) đợc cắt, làm nh sản phẩm PCR lần Sau đó, ADN đợc hoà tan dung dịch TE (pH = 8) với nồng độ 40 ng/àl để nhân dòng vào véctơ pCRR 2.1 (hình 1) Đối với đột biến khác (D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S), thu đợc kết tơng tự nh D101E (không minh họa hình ảnh này) khuẩn lạc trắng đợc chọn để tách ADN plasmit Để kiểm tra xem đoạn ADN (khoảng kb) đợc gắn vào plasmit hay cha, ADN plasmit đợc tách ủ với enzym EcoR I 37oC 3giờ, sau kiểm tra sản phẩm điện di gel agaroza 1% Kết nhận đợc băng ADN có kích thớc khoảng 1kb (hình 2) Một vài plasmit có mang đoạn ADN khoảng 1kb đợc làm với số lợng lớn dùng để đọc trình tự nucleotit MK 1080 bp MK Nhân dòng đọc trình tự gien EH đột biến a Kết nhân dòng gien EH đột biến Đoạn ADN có kích thớc khoảng 1kb, sau cắt làm sạch, đợc gắn vào véctơ pCRR 2.1 nhờ enzym T4- DNA ligaza Sau véctơ đợc biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli INV F' đợc chọn lọc môi trờng LB đặc có chứa 50 mg/lít ampixyllin, 80 mg/lít X-Gal ủ 37oC qua đêm Kết nhận đợc nhiều khuẩn lạc trắng xen kẽ với khuẩn lạc xanh Một số MK B A H×nh A Sản phẩm PCR lần D101E B Sản phẩm PCR lần (của D101E) sau đợc cắt làm Chú thích: MK: Máckơ; Giếng 1-2: đoạn ADN đợc làm để nhân dòng; Giếng 3, 4, 5: sản phẩm PCR lần cha đợc làm 10 11 12 1080 bp Chú thích: MK: Máckơ; Lane 1-11: ADN plasmit mang gien EH; Lane 12: ADN không mang gien EH Hình ADN plasmit đợc cắt kiểm tra EcoR I 43 b Kết đọc trình tự nucleotit Để chuẩn bị nguyên liệu cho việc đọc trình tự, t¸ch ADN plasmit, xư lý ARN b»ng c¸ch đ víi enzym RNaza 37oC giờ, sau làm kết tủa ADN 20%PEG + 2,5 M NaCl hoà ADN dung dịch TE (pH = 8) với nồng độ 3,8 àg/àl Quá trình đọc trình tự đợc tiến hành qua đêm máy DSQ-1000/DNA Sequencer Shimadzu Sau kết thúc đọc trình tự, xử lý chọn lọc kết quả, nhận đợc nh÷ng NdeI ATATACATAT TTGCAGAGAA GAGCTCTGGT CTACCGCGCC CACCTTCAAT GCGCTTATTG CTGGGGAGCC TTAAGGCCTA ATCAGAACGG CTGCAGATTT GCACTGAGTA CCAATTCTTC CTTGCCCTCT TTGAGAAAAC TTAAATTGGG CGTAAAATAC TGAAGGAGTA GAACAAGTGA AGCAGAGGAA CTTGTCCAAA GGAGCAAATA AGGAGAGGGT ACTCATGGCG GTCGCTCCCG CAGCAGCTAC ACTCTCTGGG ATCATAGGTT TGTCTGCCTC TGGATGGCAT CAGAAACCAG TGTTCTCAAA CCAAGGGAAG TGGCTCACAG CGGATTCACT AGTTGACGGC ATAACAGGTG TATCCACGGC TTGTGCAGAA ATCGATAATT AACGAATTCA EcoRI trình tự gien EH có vị trí đột biến cần thiết theo yêu cầu thí nghiệm (hình 3) Các plasmit có mang vị trí đột biến đợc giữ 20oC để sử dụng cho nghiªn cøu biĨu hiƯn enzym EH ë E coli Tơng tự nh vậy, trình tự khác gien EH đột biến vị trí D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S nhận đợc phơng pháp tơng tự (không minh hoạ hình ảnh này) CAGTTGAAGT CCAGTGGTGT CCATCAGATT ATCTCCGTGG AACTGCTTCC TGTCCAACAA GGTATCTATG AGTGTCCCTC GCGTGCTTTG GGGAAATGGA AACATCCTTA GTTTCAATTC AAGAAGATCT GGACCCTTGA ACCATGGACA AGTTGGACAT GGAGGGTTCA AGGAGTGGCT ACATATACGA AC GAATGGCATA TGTTCCTCCA CTCTCTCTCA CTACGGTGAC ACATAGTGGG GTGTTCCTTG CATGTTTCGC TCCTCCGCAG TATGGAGACG GGCTCAGATG CAACTCGCAA AATCCAGAAA CGCCTATTAT ACTACTACAG GGAGGGCAAA GGTATACAAC AGCAAGATGT CACTTCAATA TTTTATCAAC AAAATGCATG CGGCTTCCCT GCTCCCTCGG ACCGAGGCAC TGATCTCGTT TGGCTCATGA CCTGACAAAG AGACCCAAAC ACTACTATGT GCTGAAGTTG TCCTGGTCCT TGCCCAACAC GTCTCCAAAT AAATTTCAAC TCAAGGTGCC TCGCTGAACT GCCAAATTTA ATCAAGAAGC AAGTTCTGAT Stop codon Hình Trình tự nucleotit gien EH đột biến ë vÞ trÝ D101E (axit aspactic ë vÞ trÝ 101 đổi thành axit glutamic) Chú thích: GA C: Vị trí đột biến D101E iii kết luận Đã nhận đợc sản phẩm PCR lần (trọng lợng phân tử khoảng 326 bp) mang vị trí đột biến D101E, D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S vị trí khởi đầu phiên mã (ATG) Đã nhận đợc sản phẩm PCR lần (trọng lợng phân tử khoảng kb) toàn gien EH mang đột biến vị trí D101 44 (bao gồm vị trí khởi đầu phiên mã vị trí kết thúc phiên mã - TGA) Bằng kỹ thuật nhân dòng đọc trình tự, nhận đợc trình tự nucleotit gien mã hoá cho enzym EH nhng có điểm đột biến vị trí axít aspactic 101 Tài liệu tham kh¶o Takashi Y., et al., 2000: J Biol Chem., 275(30): 23082 -23088 2 Armstrong R N., 1999: Drug metab Rev., 31: 71-86 Michael A., Heike W., and Franz O., 1996: J Biol Chem., 271(8): 4223-4229 Linderman R J., et al., 1995: Tetrahedron, 51: 10845-10856 Rick R., et al., 1997: J Biol Chem., 272(23): 14650-14657 Rink R., et al., 1999: J Am Chem Soc., 121: 7417-7418 Badami R C., and Patil K B., 198: Prog Lipid Res., 19: 119-153 Hemberg M., and Fahlstadius P., 1992: Plant Physiol., 99: 987-995 Katsube T et al 1995: Plant Physiol., 109: 722-723 10 Masaomi A., et al., 2000: Eur J Biochem., 267: 2649-2657 11 Bentley P., and Oesch F., 1975: FEBS Lett., 59: 291-295 Production of the soybean epoxide hydrolase mutants at Asp101 (D101) site by the PCR Technique Nghiem Ngoc Minh, Chikafusa Fukazawa Summary The epoxide hydrolases are widely distributed among many species, including bacteria, fungi, plants and mammals These enzymes are an interesting group of functionnally related enzymes that catalyse the addition of water molecule to an epoxide (oxirane moiety), producing the corresponding 1-2 diol Recent studies have been provided valuable information on the molecular structure of these enzymes, as well as insight to the enzymatic mechanisms that involved In this report, we demonstrate the production of the soybean epoxide hydrolase mutants at Asp101 site (D101E, D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S) by the PCR technique, using the taget mutant primers Employing the 1st PCR products as primer and the EH- End-Anti primer, the entire cDNA fragment (nearly 1kb) consisted of target mutants encoding epoxide hydrolase from the soybean seeds was obtained by PCR The cloning and the sequencing of this EH gien were also performanced Ngµy nhËn bµi : 7-5-2003 45 ... mang vị trí đột biến D101E, D101Q, D101C, D101T, D101H, D101S vị trí khởi đầu phiên mã (ATG) Đã nhận đợc sản phẩm PCR lần (trọng lợng phân tử khoảng kb) toàn gien EH mang đột biến vị trí D101... nucleotit cđa gien EH đột biến vị trí D101E (axit aspactic vị trí 101 đổi thành axit glutamic) Chú thích: GA C: Vị trí đột biến D101E iii kết luận Đã nhận đợc sản phẩm PCR lần (trọng lợng phân... gồm vị trí khởi đầu phiên mã vị trí kết thúc phiên mã - TGA) Bằng kỹ thuật nhân dòng đọc trình tự, nhận đợc trình tự nucleotit gien mã hoá cho enzym EH nhng có điểm đột biến vị trí axít aspactic