Xác định đột biến gen Kras trên bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Bạch mai bằng kỹ thuật Stripassay

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định tình trạng đột biến gen KRAS trên bệnh nhân (BN) ung thư đại trực tràng (UTĐTT) tại Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.

Tạp chí y - dợc học quân số 8-2016 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI BẰNG KỸ THUẬT STRIPASSAY Mai Trọng Khoa*; Phạm Cẩm Phương*; Nguyễn Tiến Lung* TĨM TẮT Mục tiêu: xác định tình trạng đột biến gen KRAS bệnh nhân (BN) ung thư đại trực tràng (UTĐTT) Trung tâm Y học Hạt nhân Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai Phương pháp: 92 mẫu bệnh phẩm (mẫu mô sau phẫu thuật sinh thiết), chẩn đoán xác định giải phẫu bệnh UTĐTT xác định đột biến gen KRAS kít KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab) Kết quả: tỷ lệ đột biến gen KRAS 37,0% (34/92 bệnh phẩm), tập trung chủ yếu codon 12 (chiếm 65,7% tổng số đột biến) Kết luận: kết phân tích đột biến gen KRAS BN UTĐTT Bệnh viện Bạch Mai tương tự nhiều nghiên cứu khác Việt Nam giới * Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Đột biến gen KRAS; KRAS 12/13/61 StripAssay® The Results of KRAS Mutation Testing in Colorectal Cancer at Bachmai Hospital Summary Objectives: To determine the KRAS mutation status in colorectal cancer at Nuclear Medicine and Oncology Center, Bachmai Hospital Hospital Methods: 92 formalin-fixed, paraffinembedded specimens (needle biopsy and surgical specimens) of colorectal cancer patients were tested for KRAS mutations using KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab) Results: 34 of 92 specimens had KRAS mutations (37.0%), mutations in codon 12 were most common (65.7%) Conclusion: The results of KRAS mutations determination in colorectal cancer in Bachmai Hospital were similar to other studies in Vietnam and over the world * Key words: Colorectal cancer; KRAS mutation; KRAS 12/13/61 StripAssay® ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng loại ung thư có tỷ lệ mắc tử vong cao Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi 10,1/100.000 dân, đứng thứ sáu bệnh ung thư (theo GLOBOCAN 2012) Các phương pháp điều trị UTĐTT bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa trị điều trị đích, có kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor - EGFR) Các nghiên cứu chứng minh kháng thể đơn dòng kháng EGFR (cetuximab, panitumumab…) có hiệu BN UTĐTT khơng có đột biến KRAS so với BN mang đột biến KRAS Vì vậy, xét nghiệm đột biến gen KRAS có vai trò quan trọng định kháng thể đơn dòng cetuximab, panitumumab… cho BN UTĐTT [1, 3] * Bệnh viện Bạch Mai Người phản hồi (Corresponding): Phạm Cẩm Phương (camphuongmd@yahoo.com) Ngày nhận bài: 04/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 08/09/2016 Ngày bỏo c ng: 19/09/2016 80 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 8-2016 Hiện có nhiều phương pháp phát biến gen KRAS Đơn vị Gen Trị liệu, đột biến gen KRAS sử dụng Trung tâm Y học Hạt nhân Ung bướu, giải trình tự gen, real-time PCR, PCR Bệnh viện Bạch Mai đặc hiệu alen… Các phương pháp khác độ nhạy, độ đặc hiệu, số lượng đột biến phát hiện… [3] Từ tháng 11 - 2014, Đơn vị Gen Trị liệu, Trung tâm Y học Hạt nhân Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai áp dụng xét nghiệm đột biến gen KRAS kỹ thuật PCR đặc hiệu alen kết hợp lai đầu dò phân tử theo kít KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab, Áo) Bộ kít có khả phát 98% loại đột biến gen KRAS, bao gồm 13 đột biến phổ biến codon 12, 13 61 với độ nhạy cao (có khả xét nghiệm xác tỷ lệ tế bào đột biến mẫu xét nghiệm 1%) [3] Nghiên cứu thực nhằm: Đánh giá tỷ lệ đột biến gen KRAS BN UTĐTT Bệnh Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả tiến cứu - Thu thập thông tin đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, giai đoạn bệnh BN theo mẫu thu thập thông tin thống - Quy trình xét nghiệm: gồm giai đoạn + Tách ADN từ mô cố định formalin vùi paraffin + Khuếch đại đoạn gen quan tâm phản ứng PCR + Lai sản phẩm khuếch đại với đầu dò đặc hiệu phân bố Teststrip + Phân tích kết * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm SPSS 16.0 viện Bạch Mai, giúp bác sỹ lâm sàng đưa phác đồ điều trị phù hợp với trường hợp cụ thể ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 92 BN UTĐTT chẩn đoán điều trị Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 11 - 2014 đến - 2016 Các mẫu bệnh phẩm (mẫu mô sau phẫu thuật sinh thiết) chẩn đoán xác định giải phẫu bệnh Trung tâm Giải phẫu bệnh Tế bào học, sau xét nghiệm đột KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU * Tỷ lệ phát đột biến gen KRAS: 34/92 BN (37,0%) UTĐTT phát có đột biến gen KRAS, không phát đột biến 58 BN (63%) Đặc biệt, BN mang đột biến gen KRAS (codon 12 codon 13) * Vị trí đột biến gen KRAS: Trong tổng số đột biến phát 34 BN, đột biến codon 12 chiếm ưu với 23 BN (65,7%); codon 13: 10 BN (28,6%), có BN (5,7%) mang đột biến codon 61 81 Tạp chí y - dợc học quân sè 8-2016 Hình 1: Phân tích kết Teststrip Trên Teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control (vạch 14 - 15) PCR positive control (vạch 16) làm đối chứng Các vạch - 13 tương ứng với 13 đột biến phát codon 12, 13 61 (A) Mẫu không phát đột biến (B) Mẫu mang đột biến 12Val (p.G12V, c.35G>T) (C) Mẫu mang đồng thời đột biến: 12Asp (p.G12D, c.35G>A) 13Asp (p.G13D, c.38G>A) (D) Mẫu mang đột biến 61Arg (p.Q61R, c.182A>G) Bảng 1: Tương quan tỷ lệ đột biến gen KRAS độ tuổi Tuổi Số lượng mẫu Số mẫu đột biến Tỷ lệ > 50 74 30 40,5% ≤ 50 18 22,2% Chung nhóm 92 34 37,0% Tỷ lệ đột biến nhóm tuổi < 50 (22,2%) thấp so với nhóm tuổi > 50 (40,5%), nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 2: Tương quan tỷ lệ đột biến gen KRAS giới tính Giới tính Số lượng mẫu Số mẫu đột biến Tỷ lệ Nam 53 18 34,0% Nữ 39 16 41,0% Chung giới 92 34 37,0% Tỷ lệ nữ đột biến nhiều nam (41,0% so với 34,0%), nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 82 T¹p chÝ y - dợc học quân số 8-2016 Bng 3: Tng quan tỷ lệ đột biến gen KRAS vị trí u Vị trí Số lượng mẫu Số mẫu đột biến Tỷ lệ Đại tràng 60 23 38,3% Trực tràng 32 11 34,4% Chung nhóm 93 34 37,0% Khơng có khác biệt tỷ lệ đột biến gen KRAS đại tràng, trực tràng tỷ lệ đột biến chung, 23/60 (38,3%) mẫu bệnh phẩm đại tràng 11/32 (34,4%) mẫu bệnh phẩm trực tràng mang đột biến gen KRAS (sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05) Bảng 4: Tương quan tỷ lệ đột biến gen KRAS loại bệnh phẩm Loại bệnh phẩm Số lượng mẫu Số mẫu đột biến Tỷ lệ Phẫu thuật 76 29 38,2% Sinh thiết 16 31,3% Chung nhóm 92 34 37,0% Tỷ lệ phát đột biến KRAS bệnh phẩm phẫu thuật (38,2%) cao so với bệnh phẩm sinh thiết (31,3%), nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) BÀN LUẬN Ở tế bào UTĐTT, đường tín hiệu phụ thuộc EGFR thường kích hoạt Theo đường này, yếu tố tăng trưởng biểu mơ liên kết với EGFR, từ hoạt hóa protein RAS truyền tín hiệu qua đường khác nhau: qua RAF, MAPK để kiểm soát tăng sinh biệt hóa; qua PI3K, AKT, mTOR giúp tế bào trì khả sống sót, khơng vào chết theo chương trình… Vì vậy, hướng điều trị UTĐTT hiệu ngăn chặn kết hợp yếu tố tăng trưởng thụ thể nó, chế hoạt động kháng thể đơn dòng cetuximab, panitumumab… Tuy nhiên, gen KRAS bị đột biến, protein KRAS có khả tự hoạt hóa, kích thích đường tín hiệu nội bào mà khơng phụ thuộc tín hiệu từ EGFR, thuốc kháng EGFR dùng khơng có hiệu [3] Nghiên cứu 92 BN UTĐTT, thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS 37,0%, tương tự với nghiên cứu giới Việt Nam Theo công bố năm 2011 Ciardiello CS, tần số đột biến KRAS châu Á, châu Âu, châu Mỹ Latinh tương ứng 24%, 36% 40% [6] Các nghiên cứu khác thống kê tỷ lệ nhìn chung khoảng 30 - 45% (trong sở liệu COSMIC ghi nhận tỷ lệ 37%) [1, 2, 3, 6] Tỷ lệ loại đột biến có chênh lệch lớn Theo kết xét nghiệm Bệnh viện Bạch Mai, đột biến codon 12 chiếm ưu (65,7%), codon 13 (28,6%), đột biến 83 T¹p chí y - dợc học quân số 8-2016 codon 61 gặp (chỉ 2/92 mẫu) Kết có khác biệt với nghiên cứu Bệnh viện K, đột biến codon 13 chiếm ưu (66,7%), tương tự với hầu hết nghiên cứu khác giới (tỷ lệ đột biến codon 12 khoảng 65 - 80%, Tổ chức Nghiên cứu Hệ gen Ung thư Mỹ công bố tỷ lệ 67,9%) [2, 3, 8] Thực tế có 5.000 đột biến điểm gen KRAS báo cáo, xảy thay nucleotid codon 12 13 exon 2, dạng chiếm > 95% tổng số đột biến có liên quan đến đáp ứng với thuốc ức chế EGFR [3] Các nghiên cứu gần chứng minh vai trò xét nghiệm KRAS lâm sàng: BN có khối u mang đột biến gen KRAS có khả đáp ứng với thuốc kháng EGFR (như cetuximab, panitumumab) BN khơng mang đột biến KRAS [2, 3] Ngồi ra, số nghiên cứu cho thấy đột biến codon 61 (exon 3) 146 (exon 4) chiếm tỷ lệ nhỏ làm tế bào không đáp ứng với thuốc ức chế EGFR [5] Vì vậy, xét nghiệm đột biến gen KRAS thực cần thiết để bác sỹ lâm sàng định lựa chọn thuốc cho BN Về mối tương quan tỷ lệ đột biến gen KRAS số sinh học, nhiều báo cáo mối liên hệ định tỷ lệ đột biến với tuổi (thường gặp tuổi 50) giới tính (ở nữ cao nam) [8] Trong nghiên cứu này, tỷ lệ đột biến gen KRAS BN > 50 tuổi cao gần lần so với độ tuổi < 50, gặp nhiều nữ, tỷ lệ không khác biệt theo vị trí u, khơng có ý nghĩa thống kê So với báo cáo khác Việt Nam, kết tương đồng [7] 84 Về kỹ thuật phát hiện, chúng tơi sử dụng kít KRAS 12/13/61 StripAssay® (ViennaLab) để phân tích đột biến gen KRAS Đây kít thiết kế theo nguyên tắc PCR đặc hiệu alen kết hợp lai đầu dò phân tử: giai đoạn PCR sử dụng mồi đặc hiệu (có gắn biotin) giúp khuếch đại xác với trình tự gen quan tâm Ở giai đoạn lai, đoạn ADN khuếch đại kết hợp xác với đầu dò tương ứng Teststrip, phân tử biotin đoạn hoạt hoá streptavidin thành dạng phát màu Nhờ đó, dễ dàng phát kết cách so màu Teststrip, đối chiếu với thang chuẩn mắt thường phần mềm StripAssay® Evaluator Bộ kít có khả phát 13 đột biến chiếm tỷ lệ cao (phát > 98% tổng tỷ lệ loại đột biến), có khả phát số lượng tế bào mang đột biến < 1%, đồng thời cấp chứng tiêu chuẩn xét nghiệm châu Âu áp dụng cho chẩn đoán bệnh (European Conformity - In Vitro Diagnostics, CE-IVD) Hiện nay, có nhiều phương pháp khác để xét nghiệm đột biến gen KRAS giải trình tự gen (giải trình tự Sanger pyrosequencing), real time PCR (tiêu biểu kít Therascreen - Qiagen), lai đầu dò (tiêu biểu kít StripAssay ViennaLab)… Phương pháp sử dụng kít StripAssay Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai có số ưu điểm phương pháp khác: độ đặc hiệu độ nhạy cao, thời gian thực xét nghiệm ngắn, khơng đòi hỏi thiết bị chuyên dụng hệ thống giải trình tự hay real time PCR, cấp chứng CE-IVD [5, 8] Hiện nay, chuyển sang sử dụng kớt KRAS XL Tạp chí y - dợc học quân sù sè 8-2016 StripAssay® cải tiến từ kít KRAS 12/13/61 StripAssay®, số lượng đột biến phát cao (29 đột biến codon 12, 13, 59, 60, 61, 117 146 gen KRAS) để nâng cao chất lượng xét nghiệm KẾT LUẬN Kết phân tích đột biến gen KRAS 61 BN UTĐTT Bệnh viện Bạch Mai theo kít KRAS 12/13/61 StripAssay® cho thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS 37,0%, đột biến codon 12 chiếm tỷ lệ cao (65,7% tổng số đột biến), đột biến codon 61 tương đối gặp (5,7%) Kết bổ sung thêm liệu phân tích trạng thái đột biến gen KRAS BN UTĐTT Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Sarasqueta AF, Moerland E et al SNaPshot and StripAssay as valuable alternatives to direct sequencing for KRAS mutation detection in colon cancer routine diagnostics The Journal of Molecular Diagnostics 2011, 13 (2), pp.199-205 Loupakis F, Ruzzo A et al KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer British Journal of Cancer 2009, 101, pp.715-721 Parsons BL, Myers MB Personalized cancer treatment and the myth of KRAS wildtype colon tumors Discovery Medicine 2013, 15 (83), pp.259-267 Ciardiello F, Tejpar S, Normanno N, Mercadante D, Teague T, Wohlschlegel B, van Cutsem E Uptake of KRAS mutation testing in patients with metastatic colorectal cancer in Europe, Latin America and Asia Targeted Oncology 2011, 6, pp.133-145 Nguyễn Kiến Dụ, Trần Vân Khánh CS Phát đột biến gen KRAS bước đầu đánh giá hiệu điều trị đích BN UTĐTT Tạp chí Y học Việt Nam 2013, 405 (2), tr.37-41 Rosty C, Young JP et al Colorectal carcinomas with KRAS mutation are associated with distinctive morphological and molecular features Modern Pathology 2013, 26 (6), pp.825-834 Vương Diệu Linh, Nguyễn Ngọc Quang, Nguyễn Phi Hùng Phân tích đột biến gen Kras BN UTĐTT kỹ thuật giải trình tự tự động Tạp chí Ung thư học 2014, 4, tr.138-143 Jancik S, Drabek J et al A comparison of direct sequencing, pyrosequencing, high resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras StripAssay for detecting KRAS mutations in non small cell lung carcinomas Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2012, 31, pp.79-91 Tan C and Du X KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer World Journal of Gastroenterology 2012, 18 (37), pp.5171-5180 85 ... tích đột biến gen KRAS 61 BN UTĐTT Bệnh viện Bạch Mai theo kít KRAS 12/13/61 StripAssay cho thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS 37,0%, đột biến codon 12 chiếm tỷ lệ cao (65,7% tổng số đột biến) , đột biến. .. phát có đột biến gen KRAS, khơng phát đột biến 58 BN (63%) Đặc biệt, BN mang đột biến gen KRAS (codon 12 codon 13) * Vị trí đột biến gen KRAS: Trong tổng số đột biến phát 34 BN, đột biến codon... lệ đột biến gen KRAS vị trí u Vị trí Số lượng mẫu Số mẫu đột biến Tỷ lệ Đại tràng 60 23 38,3% Trực tràng 32 11 34,4% Chung nhóm 93 34 37,0% Khơng có khác biệt tỷ lệ đột biến gen KRAS đại tràng,