Phân tích cộng đồng vi khuẩn trong rơm rạ trước và sau ủ bằng kỹ thuật PCR-DGGE và tạo dòng

Bài viết định hướng sử dụng công cụ sinh học phân tử đánh giá và phân tích đa dạng cộng đồng vi sinh vật trong điều kiện môi trường sống ảnh hưởng sự biến đổi khí hậu ngày càng phức tạp làm tiền đề cho các nghiên cứu khác.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 177-186, 2020 PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN TRONG RƠM RẠ TRƯỚC VÀ SAU Ủ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DỊNG Ngơ Đức Duy*, Nguyễn Hoàng Dũng, Hoàng Quốc Khánh Viện Sinh học nhiệt đới (ITB), Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST) * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: ngoduy007itb@gmail.com Ngày nhận bài: 22.4.2019 Ngày nhận đăng: 09.7.2019 TÓM TẮT Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gel Gradient Eletrophoresis) phân tích cộng đồng vi khuẩn dựa đoạn gen V3 từ mẫu Rơm trước ủ (R) mẫu Rơm sau ủ (Rn) Bên cạnh kết hợp với phương pháp tạo dịng (Cloning) phân tích mẫu Rn so sánh kết phân tích cộng đồng vi khuẩn với phương pháp PCR-DGGE cho kết tương tự mục tiêu nghiên cứu Kết thu nhận từ kỹ thuật PCR-DGGE mẫu R có đoạn gen V3 (R1, R2, R3, R4 R5) cịn mẫu Rn có đoạn gen V3 (Rn1, Rn2, Rn3 Rn4) So sánh nhóm vi khuẩn mẫu R Rn cho thấy đa dạng vi khuẩn mẫu R gồm dòng Agrobacterium, Clostridium, Bacteroidetes, Thermopolysporasa Bacillus Nhưng mẫu sau ủ kết vi khuẩn cịn lại dịng Agrobacterium Clostridium Tiếp tục sử dụng phương pháp tạo dòng từ mẫu Rn cho vị trí kích thước phân đoạn gen tương ứng vị trí Rn1, Rn2, Rn3 Rn4 từ đại diện khoảng 30 mẫu gen thu nhận từ sản phẩm tạo dòng Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn gen V3 từ hai phương pháp với sử liệu có ngân hàng gen NCBI, kết gen Rn1 Rn4 tương đồng với chi Agrobacterium khoảng 96%, gen Rn2 Rn3 tương đồng với chi Clostridium khoảng 99% Tóm lại kết phân tích cộng đồng vi khuẩn mẫu R cho thấy đa dạng vi khuẩn ổn định so với mẫu Rn Ngoài kỹ thuật tạo dòng PCR-DGGE cho kết tương tự mẫu Rn Từ khóa: Cộng đồng vi khuẩn, gel acrylamide, PCR-DGGE, rơm rạ, tạo dòng MỞ ĐẦU Hiện nay, có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử phát triển để xác định vi sinh vật cấp độ loài RFLP, RAPD, Multiplex PCR, DGGE, Cloning gần Metagenomic Trong đó, DGGE kỹ thuật sinh học phân tử bản, công bố lần Fischer Lerman (1983), phương pháp dựa thay đổi nucleotide cấu trúc mạch DNA kỹ thuật DGGE điện di nồng độ gel acrylamide biến tính cho phép phân tách sản phẩm đoạn gen có kích thước có thay đổi nucleotide mạch gen Phương pháp ứng dụng phổ biến việc xác định đa dạng cộng đồng vi sinh vật môi trường với điều kiện sinh thái khác xác định cộng đồng xạ khuẩn đất Antarctic từ vùng Barrientos Island (Learn et al., 2012), khảo sát tính đa dạng hệ vi sinh vật biểu mơ cỏ bị (Salet et al., 2007), hệ vi sinh vật cổ sinh khí methan từ đất ruộng Watanabe đồng tác giả (2004) Ngoài sử dụng kỹ thuật DGGE nghiên cứu đa dạng vi sinh vật phương pháp sử dụng phân tích cộng đồng tuyến trùng theo cơng bố Okada (2010) Bên cạnh đó, kỹ thuật DGGE kết hợp với kỹ thuật khác TGGE SSCP nhằm làm tăng độ 177 Ngô Đức Duy et al tin cậy phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật Muyzer đồng tác giả (1999) kết hợp kỹ thuật DGGE/TGGE xác định gen vi sinh vật từ hệ sinh thái tự nhiên Trong Hori đồng tác giả (2006) so sánh trực tiếp phương pháp SSCP DGGE liên quan tới đặc điểm cộng đồng vi sinh dựa đọan gen 16S rRNA Bên cạnh kỹ thuật DGGE, kỹ thuật tạo dòng ứng dụng phân tích hệ vi sinh vật bể phân hủy chất thải chăn nuôi công nghiệp công bố Cheon đồng tác giả (2008) Phương pháp tạo dòng chủ yếu sử dụng việc tạo thư viện gen, kiểm tra biểu gen mục tiêu, sản xuất sản phẩm thứ cấp khác thông qua chuyển gen Các cơng trình cơng bố nước kỹ thuật DGGE năm gần ứng dụng nghiên cứu đa dạng vi sinh mẫu vật hệ sinh cảnh khác xác định đa dạng vi khuẩn bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE (Nguyễn Bá Hữu et al., 2008) công thức thử nghiệm xử lý đất ô nhiễm chất độc hóa học nhóm tác giả Nguyễn Thanh Thủy đồng tác giả (2004) Bên cạnh có cơng bố phân tích cộng đồng vi khuẩn phân bò ủ phương pháp phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ kỹ thuật PCR-DGGE nhóm tác giả Ngơ Đức Duy đồng tác giả (2012, 2013) Hiện chưa có công bố nước kết hợp so sánh kỹ thuật tạo dịng PCRDGGE để phân tích cộng đồng vi khuẩn Điều chứng minh đa dạng việc ứng dụng phương pháp DGGE nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật mẫu, áp dụng chung riêng cho phương pháp PCR-DGGE tạo dịng để phân tích áp dụng Mục tiêu nghiên cứu sử dụng hai kỹ thuật PCR- DGGE tạo dòng phân tích cộng đồng vi khuẩn có khả phân hủy Rơm rạ nhằm xác định thay đổi dòng vi khuẩn diện mẫu rơm trước sau ủ Bên cạnh định hướng sử dụng công cụ sinh học phân tử đánh 178 giá phân tích đa dạng cộng đồng vi sinh vật điều kiện môi trường sống ảnh hưởng biến đổi khí hậu ngày phức tạp làm tiền đề cho nghiên cứu khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Sử dụng mẫu R Rn thu nhận từ phương pháp ủ truyền thống trước trồng nấm Rơm thu nhận Xã Tân Hòa, Huyện Lai Vung, Tỉnh Đồng Tháp Hóa chất sử dụng nghiên cứu như; Lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 100 mM sodium phosphate pH 8, 1,5 M NaCl 1% CTAB), proteinase K (10 mg/mL), SDS 10%, chloroform/isoamyl alcohol (24:1 v/v), isopropanol, ethanol 77% 99,5%… Hóa chất dùng phản ứng PCR: H20, dNTPs, PCR buffer 10X, Mg2+, Taq polymerase, cặp mồi sử dụng PCR DGGE là; 357F-GC:5’ -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’ 517R:5’ -ATT ACC GCG GCT GCT GG -3’, 357F:5’ -CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’ 517R:5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG -3’ theo Muyzer et al., 1993 Hóa chất dùng phương pháp DGGE: polyacrylamide, bis-polyacrylamide, SYBR Green, Gel Temed, PSA, urea, fomamide, TAE Vector quy trình thực sử dụng kỹ thuật cloning pGEM@-T Easy vector hãng Promega có kích thước 3015 bp, bao gồm vùng gen là: Ampicillin, Ori Lac Z, chủng vi khuẩn E.coli JM109 sử dụng phương pháp tạo dòng Phương pháp nghiên cứu Quy trình tách chiết thu nhận DNA Quy trình thực theo phương pháp CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) (Muyzer et al., 1999) tinh sản Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 177-186, 2020 phẩm genomic DNA sản phẩm gen V3 QIAGEN kit Quy trình Tạo dịng thực theo protocol hãng Promega thu nhận sản phẩm plasmid QIAGEN kit Chu kỳ phản ứng PCR cho gen 16S rDNA sau: 95oC/10p, 93oC/1p, 50oC/1p, 72oC/2p, (95oC/30g, 50oC/30g, 72oC/2p) lập lại 30 chu kỳ, 95oC/1p, 50oC/1p, 72oC/5p chu kỳ phản ứng PCR vùng V3 DGGE: 95oC/10p, (93oC/30g, 65oC/40g, 72oC/1p) lập lại chu kỳ, (93oC/30g, 60oC/40g, 72oC/1p) lập lại chu kỳ, (93oC/30g, 55oC/40g, 72oC/1p) lập lại chu kỳ, 93oC/30g, 55oC/40g, 72oC/5p Thu nhận tinh genomic DNA Quy trình tinh sau cắt band DNA gel polyacrylamide, thêm 300µl ethanol 99,9% Ly tâm 13.000 rpm/phút, loại bỏ ethanol, thêm 200µl DEB Tiếp tục sử dụng KIT QIAEX II để tiếp tục tinh thu nhận DNA từ gel acrylamide Các phần mềm web trực tuyến cho phân tích liệu trình tự đoạn gen Phần mềm SeaView thiết lập so sánh tương đồng trình tự gen, http://www.ncbi.nlm.nih.gov dùng cho việc BLAST liệu công cụ phân tích so sánh trình tự gen ngân hàng trình tự so sánh Quá trình tách chiết thu nhận plasmid thực theo protocol hãng Nippon Genetics KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu nhận DNA sản phẩm nhân đoạn gen V3 mẫu R Kết ly trích thu nhận DNA cộng đồng vi sinh vật trực tiếp từ mẫu R, cho thấy sản phẩm DNA gen tách chiết phương pháp CTAB xem Hình 1A Tiếp tục sử dụng sản phẩm DNA nhân đoạn gen V3 thuộc vùng 16S rDNA dựa cặp mồi 357F-GC 517R với kết thu Hình 1B Tuy nhiên kết chưa cho biết đoạn gen chun biệt lồi vi khuẩn mẫu Sử dụng kỹ thuật DGGE lần (Hình 1C) DGGE lần (Hình 1D) từ sản phẩm V3 mẫu R nhằm tách riêng rẽ trình tự đọan gen dựa vào gradient biến tính có nồng độ từ 40% đến 60% gel polyacrylamide cho kết luận mẫu R có tồn đoạn gen V3 ký hiệu R1, R2, R3, R4 R5 thuộc chủng vi khuẩn khác Kết giải trình tự đoạn gen so sánh mức độ tương đồng vùng gen Ngân hàng liệu NCBI với công cụ BLAST với xây dựng phân loại lồi xem Hình Cho thấy tính đa dạng nhóm vi khuẩn mẫu R có mức độ tương đồng vùng gen V3 tương ứng sau; gen R1 tương ứng với dòng vi khuẩn Agrobacterium, R2 thuộc dòng Clostridium, R3 tương ứng với dòng Bacteroidetes, R4 tương tự dòng Thermopolysporasa R5 thuộc dòng Bacillus Hình Kết ly trích thu nhận DNA cộng đồng vi sinh từ mẫu Rơm trước ủ (A), sản phẩm PCR đoạn gene V3 cộng đồng vi sinh gel agarose 1% chạy 100volt/40phút (B), sản phẩm phân đoạn gene tách theo phương pháp DGGE lần chạy nguồn điện 200volt/300phút gel polyarylamide 4060%(C) tương tự DGGE lần (D) 179 Ngô Đức Duy et al Hình Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen V3 (R1,R2,R3, R4, R5) phân lập mẫu Rơm chưa ủ chủng vi khuẩn ngân hàng liệu gen NCBI Theo liệu công bố từ nghiên cứu (Vila et.al., 2003) cho thấy cộng đồng vi khuẩn phân ủ Rơm rạ Alphaproteobacteria mẫu Rơm rạ ban đầu chưa ủ, Bacillus Actinomycetes giai đoạn ưa nhiệt, Cytophaga Clostridial giai đoạn ủ nhiều tuần Một nghiên cứu khác (Steger et al., 2007) cho thấy thay đổi thành phần cộng đồng Actinobacteria trình ủ thải hữu theo quy mơ hộ gia đình So sánh với kết thu cho thấy hệ vi khuẩn mẫu R có diện vài dịng vi khuẩn giống cơng bố Bên cạnh thấy đa dạng nhóm vi khuẩn tùy thuộc vào 180 loại Rơm rạ, trình canh tác vận chuyển Ly trích thu nhận DNA sản phẩm nhân đoạn gen V3 mẫu Rn Kết ly trích thu nhận DNA cộng đồng vi sinh vật trực tiếp từ mẫu Rơm sau ủ (Rn) sử dụng làm nguyên liệu trồng Nấm Rơm, cho thấy sản phẩm DNA gen tách chiết phương pháp CTAB xem Hình 3A Và bước thực Hình 3B, 3C 3D tương tự qui trình thực Hình Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 177-186, 2020 Kết tạo dòng vector pGEM@-T Easy hãng Promega có kích thước 3015 bp Chọn mẫu Rn sản phẩm PCR DGGE phần thực chèn vào vector pGEM@-T Easy biến nạp vào E coli JM109 theo qui trình kỹ thuật hãng sàn xuất Nippon Genetics Từ trình chuyển đoạn gen V3 vào vector biến nạp vào E coli JM109 cho thấy sản phẩm thu nhận Hình 4A, 4B có khuẩn lạc màu xanh trắng Điều cho kết luận khuẩn lạc có màu trắng chuyển gen V3 thành cơng, đoạn gen V3 chèn vào vùng gen Lac Z làm cho Lac Z kết hợp với X-Gal môi trường LB để tạo khuẩn lạc có màu xanh mà khuẩn lạc có biểu màu trắng Hình Kết ly trích thu nhận gen DNA cộng đồng vi sinh từ mẫu Rơm sau ủ Rn (A), sản phẩm PCR đoạn gene V3 cộng đồng vi sinh gel agarose 1% chạy 100volt/40phút (B), sản phẩm phân đoạn gene tách theo phương pháp DGGE lần chạy nguồn điện 200volt/300phút gel polyarylamide 40-60%(C) tương tự DGGE lần (D) @ Hình Kết khuẩn lạc có màu trắng đoạn gen chèn vào vector pGEM -T Easy vetor biến nạp vào E coli (A, B) chọn khuẩn lạc có màu trắng cấy tới đời F3 mơi trường LB (C) có chứa Ampicillin, PIG X-Gal Kết chứng minh khuẩn lạc có màu trắng khuẩn lạc chuyển thành công vector pGEM@-T Easy có chứa đoạn gen V3 Tiếp tục chọn khoảng 30 khuẩn lạc màu trắng thực cấy chuyền lập lại lần nhằm mục đích kiểm tra tính ổn định vector chuyển vào vi khuẩn E coli JM109 mà khơng bị đào thải qua vịng đời sinh sản chủng E coli JM109 181 Ngô Đức Duy et al Ly trích, thu nhận nhân lại đoạn gen V3 sau tạo dòng Chọn khoảng 30 khuẩn lạc có màu trắng cấy qua hệ F3 sử dụng qui trình QIAGEN plasmid kít tách chiết thu nhận lại vector sau PCR cho kết sản phẩm gen V3 Hình 5A, 5B Hình Kết 32 sản phẩm PCR đoạn gen V3 thể gel agarose 1% ly trích thu nhận từ vi @ kuẩn E coli JM109 cloning vector pGEM -T Easy (A B) Hình Kết 30 sản phẩm DGGE chạy hệ thống BioRad nguồn điện 200volt/300phút nồng độ gel polyarylamide 40-60% (A, B) 182 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 177-186, 2020 Hình Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen V3 (Rn1,Rn2, Rn3 Rn4) phân lập mẫu Rơm chưa ủ (Rn) chủng vi khuẩn ngân hàng liệu gen NCBI Kiểm tra sản phẩm gen V3 sau tạo dòng kỹ thuật DGGE Lấy kết sản phẩm PCR Hình 5A, 5B thực phương pháp DGGE từ kết vị trí mẫu gen cho thấy gen tương ứng với vị trí gen Rn1, đoạn gen 11, 26 tương ứng gen Rn2, tương tự đoạn gen 6, 8, 10, 12, 14, 21, 23, 25, 27 29 tương ứng vị trí gen Rn3, phần cịn lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 27 30 tương ứng với gen Rn4 So sánh sản phẩm DGGE với hình 1.3D cho thấy vị trí đoạn gen phương pháp DGGE tạo dòng điều cho kết qua giống Chọn đại diện đoạn gen V3 sản phẩm tạo dòng tương ứng với vị trí đoạn gen Rn cho mẫu sau; gen 5, gen 26, gen gen xem Hình 6A, 6B sản phẩm tạo dịng Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 sản phẩm DGGE (Hình 3D) giải trình tự gen so sánh kết liệu gen đoạn V3 ngân hàng liệu NCBI với cơng cụ BLAST Kết trình tự đoạn gen giống Rn1, gen 26 giống Rn2, gen giống Rn3 tương tự gen với Rn4 Dựa vào sánh tính tương đồng mẫu trình tự Rn với tham chiếu Genbank với mức cụ thể sau; Kết cho thấy gen (Rn1) tương đồng với chi Agrobacterium 96%, gen 26 (Rn2) gen (Rn3) thuộc chi Clostridium với mức độ tương đồng gần với lồi 183 Ngơ Đức Duy et al Clostridium thermocellum, Clostridium aurantibutyricum tương ứng 99%, 98% gen (Rn4) có mức độ tương đồng với chi Agrobacterium 95% xem Hình Thơng qua kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng với kết thu giống mẫu Rn, lại hai dòng vi khuẩn Clostridium, Agrobacterium Vì giai đoạn rơm ủ nhiệt độ đo tăng khoảng 700C thời gian ủ kéo dài khoảng 20 ngày, làm cho diện tính đa dạng dịng vi khuẩn khơng cịn mẫu rơm ban đầu kết phân tích Hình 1D Hình Tóm lại, với mẫu Rn thu nhận xã Tân Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp cho kết sản phẩm PCR từ thu nhận DNA gen nhân đoạn gen V3 thuộc vùng 16S rDNA dựa cặp mồi chung 357F-GC 517R Thơng qua phân tích cộng đồng vi khuẩn kỹ thuật DGGE cho đoạn gen V3 Rn1, Rn2, Rn3, Rn4 Kỹ thuật tạo dòng cho phân đoạn gen tương ứng với vị trí gen Rn1, đoạn gen 11, 26 tương ứng gen Rn2, tương tự đoạn gen 6, 8, 10, 12, 14, 21, 23, 25, 27 29 tương ứng vị trí gen Rn3, phần cịn lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 27 30 tương ứng với gen Rn4 Ngoài mẫu R cho thấy tính đa dạng vi khuẩn mẫu chưa thơng qua ủ khoảng dịng lại khoảng dòng vi khuẩn sau giai đoạn ủ Từ kết nghiên cứu thu nhận cho thấy ứng dụng hai kỹ thuật phân tích cộng động vi khuẩn PCR-DGGE tạo dịng cho việc phân tích cộng đồng vi khuẩn nói riêng nhóm vi sinh nói chung loại mẫu khác nhau, điều kiện hệ vi sinh ln ln thay đổi bên cạnh giúp định hướng phân lập giống vi khuẩn hỗ trợ cho nghiên cứu từ kết phân tích kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng KẾT LUẬN Kết phân tích PCR-DGGE mẫu R Rn cho thấy thành phần dịng vi khuẩn mẫu có thay đổi trước sau ủ Trong mẫu R 184 tính đa dạng lồi nhiều chi Agrobacterium, Clostridium, Bacteroidetes, Thermopolysporasa Bacillus thiếu ổn định mẫu Rn có chi Agrobacterium, Clostridium tính đa dạng chi vi khuẩn phù hợp với cơng bố trước thời gian ủ, nhiệt độ ủ làm giảm thành phần vi khuẩn mẫu Các kết tạo dòng mẫu Rn cho kết tương tự vị trí, trình tự gen với phương pháp DGGE gen Rn1 (gen 5) gen Rn4 (gen 3) tương đồng với chi Agrobacterium, gen Rn2 (gen 26) gen Rn3 (gen 8) thuộc chi Clostridium Chứng tỏ kết độc lập kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng phân tích cộng đồng vi khuẩn cho giống Kết luận việc sử dụng so sánh kỹ thuật PCR-DGGE tạo dòng với mẫu Rn cho kết hồn tồn giống vị trí chạy gel acrylamide, trình tự gen đoạn gen V3 mẫu Rn Điều cho phép sử dụng độc lập kỹ thuật PCR-DGGE tạo dịng phân tích cộng đồng vi sinh vật kết hợp hai phương pháp với Lời cảm ơn Có kết nghiên cứu nhờ hỗ trợ từ dự án “Kết hợp bền vững nông nghiệp địa phương với công nghiệp chế biến Biomass” JICA, JST Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Chân thành cảm ơn GS Yasuo Igarashi Gs Masahura Ishii đồng nghiệp GSALS, Đại học Tokyo Nhật Bản Viện Sinh học nhiệt đới TÀI LIỆU THAM KHẢO Cheon J, Hidaka T, Mori S, Koshikawa H, Tsuno H (2008) Applicability of random cloning method to analyze microbial community in full-scale anaerobic digesters J Biosci Bioeng 106 (2): 134-40 Fischer SG, Lerman LS, (1983) DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory Proc Natl Acad Sci USA 80: 1579–1583 Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 177-186, 2020 Hori T, Haruta S, Ueno Y, Ishii M, Igarashi Y (2006) Direct comparinson of singlestand conformation polymorphism (SSCP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to characterize a microbial community on the basis of 16S RNA gene fragments J Microbiol Meth (6): 165-169 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2008) Xác định đa dạng vi khuẩn bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (6): 59-65 Learn HL, Yoke KC, Shiran MS, Vui LCM, Nurul SAM, Son R, Andrade HM (2012) Identification of actinomycete communities in Antarctic soil from Barrientos Island using PCR-denaturing gradient gel electrophoresis Genet Molr Res 11: 277-291 Nguyễn Thanh Thủy, La Thị Phương, Đặng Thị Cẩm Hà (2004) Sử dụng phương pháp điện di gel gradient biến tính để xác định mức độ đa dạng vi sinh vật công thức thử nghiệm xử lý đất nhiễm chất độc hóa học Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2): 381-388 Muyzer G (1999) DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems Appl Environ Microbiol: 317-322 Okada H (2010) Technical report on the PCRDGGE analysis of soil Nematode community Ver.2.3 Muyzer G, De WEC, Uitterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA Appl Environ Microbiol 59(3): 695700 Salet S, Martin C, Meumier B, Morgavi DP (2007) PCR-DGGE analysis reveals a distinet directy in the bacterrial population a tached to the rumen epithlium Animal 1(7): 939-945 Nghiêm Ngọc Minh (2004) Sử dụng kỹ thuật điện di gel gradient biến tính để nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (2): 397-406 Ngơ ĐD, Hồng NPT, Hoang QK, Nguyễn NT, Phan ĐT, Makoto A, Chihaya Y, Kouji Y, Yasuo I (2013) Sử dụng kỹ thuật PCR-DGGE phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ huyện Lai Vung, Đồng Tháp Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 51(3A):1-16 Ngơ ĐD, Nguyễn TTV, Đào TTH, Hồng QK, Mannix P, Yamada C, Yoshida K, Igarashi Y (2012) Phân tích Cộng đồng vi khuẩn phân ủ phương pháp DGGE Tạp chí Sinh học 34(SE): 118124 Steger K, Sjogren AM, Jarvis A, Jansson JK, Sundh I (2007) Development of compost maturity and Actinobacteria populations during full-scale composting of organic household waste J Appl Microbiol (103): 487-498 Vila RC, Kazuo M, Susumu A, Makoto K (2003) Succession and phylogentic composition of bacterial communities responsible for the composting process of rice straw estimated by PCRDGGE analysis Soil Sci Plant Nut (49): 619-630 Watanabe T, Asakawa S, Nakamura A, Nagaoka K, Kimura M (2004) DGGE method for analyzing 16S rDNA of methanogenic archaeal community in paddy field soil FEMS Microbiol Lett 232: 15-163 BACTERIAL COMMUNITY ANALYSIS IN THE RICE STRAW SAMPLE BEFORE AND AFTER COMPOSTING BY PCR-DGGE AND CLONING METHOD Ngo Duc Duy, Nguyen Hoang Dung, Hoang Quoc Khanh Insititute of Tropical Biology (ITB), Vietnam Academy of Sciences and Technology (VAST) SUMMARY Applicability of PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gel Gradient Eletrophoresis) technique to analyze microbial community is based on the V3 gene fragments in the rice straw sample (R) and after composting rice straw samples (Rn) Besides clonning method combined with analyzing Rn samples and comparing the results of microbial community analysis 185 Ngô Đức Duy et al with PCR-DGGE method had the same reuslts is the main goal in this study Results obtained from PCR-DGGE technique of R sample had the V3 gene fragments (R1, R2, R3, R4 and R5) and Rn had the V3 genes fragments (Rn1, Rn2, Rn3 and Rn4) Comparison of bacterial groups in R and Rn samples showed that bacteria in R samples including Agrobacterium, Clostridium, Bacteroidetes, Thermopolysporasa and Bacillus species, but in the Rn sample after incubation, the remaining bacterial results of main species are Agrobacterium and Clostridium Using Clonning method of Rn sample also gave positions and gene fragment sizes corresponding to the positions of Rn1, Rn2, Rn3 and Rn4 from representatives of about 30 samples collected from the Clonning products Based on the comparison of the similarity among the sequence of V3 gene fragments in PCR-DGGE and Clonning with reference to the data base in NCBI gene bank the results that Rn1 and Rn4 genes are similar to Agrobacterium species, about 96%, Rn2 and Rn3 are similar to Clostridium about 99% In summary the results of microbial community analysis in the R sample show that the diversity of bacteria in the R sample is larger than in the Rn sample Summarize the results of microbial community analysis in the R sample show the diversity of bacteria but less stable than the Rn sample In addition, cloning and PCR-DGGE produced similar results on the sample Rn Keywords: bacterial community, cloning, gel acrylamide, PCR-DGGE, rice straw 186 ... Nguyễn Thanh Thủy đồng tác giả (2004) Bên cạnh có cơng bố phân tích cộng đồng vi khuẩn phân bò ủ phương pháp phân tích cộng đồng vi khuẩn Rơm rạ kỹ thuật PCR-DGGE nhóm tác giả Ngơ Đức Duy đồng tác... PCR-DGGE tạo dịng để phân tích áp dụng Mục tiêu nghiên cứu sử dụng hai kỹ thuật PCR- DGGE tạo dịng phân tích cộng đồng vi khuẩn có khả phân hủy Rơm rạ nhằm xác định thay đổi dòng vi khuẩn diện mẫu rơm. .. đa dạng vi khuẩn mẫu chưa thơng qua ủ khoảng dịng lại khoảng dòng vi khuẩn sau giai đoạn ủ Từ kết nghiên cứu thu nhận cho thấy ứng dụng hai kỹ thuật phân tích cộng động vi khuẩn PCR-DGGE tạo dịng