2.3.4.1 Tiêu hóa chất xơ (Carbohydrate vách tế bào)
Cellulose và hemicelluloses là thành phần chính của tế bào thực vật, chúng liên kết với lignin tạo thành polymer bền vững về lý học và hoá học. Một đơn vị
cellulose gồm hai phân tử glucose, cellulose nguyên chất là một chuỗi các cenlobiose lặp đi lặp lại bởi các liên kết 1,4. Như vậy cellulose nguyên chất gồm các
đường đơn glucose.
Ngược lại hemicelluloses cũng là một polymer nhưng ngoài đường glucose chúng còn chứa đường D-galactose, D-mantose, D-xilose và L-anabiose. Khi lignin liên kết với cellulose, hemicelluloses hay protein trong thành phần tế bào sẽ làm cho thành phần tế bào trở nên bền vững và rất khó tiêu hoá. Do đó những thức ăn giàu lignin như rơm rạ, cỏ khô…Thường có tỷ lệ tiêu hoá thấp.
Trong dạ cỏ vikhuẩn phân giải chất xơ tiết ra enzyme và cắt cellulose thành các cellulose (có hai glucose), sau đó cellulose tiếp tục bị phân huỷ thành glucose và lên men thành các axít béo bay hơi, CO2, CH4 và ATP.
Hình 2.5: Sơđồ tiêu hóa carbohydrate (CHO) ở bò
(Vũ Duy Giảng et al,, 2008)
2.3.4.2 Tiêu hóa tinh bột và đường
Tinh bột và đường được vi khuẩn và protozoa tiêu thụ rất nhanh. Protozoa
đồng hoá tinh bột biến thành polydextin dự trữ trong cơ thể của chúng. Khi
protozoa bị chuyển xuống dạ múi khế và ruột non poly-dextin được tiêu hoá dễ
dàng bởi men tiêu hoá của vật chủ. Ngược lại vi khuẩn phân huỷ tinh bột và đường thành các đường đơn sau đó lên men tiếp tục thành các axít béo bay hơi, CO2, CH4 và ATP. ATP là nguồn cung cấp năng lượng chính cho tế bào vi sinh vật. Những nghiên cứu gần đây cho thấy không phải tất cả tinh bột đều bị tiêu hoá ở dạ cỏ mà một phần được chuyển xuống phần dưới của dạ dày bốn túi, những thức ăn không bị lên men ở dạ cỏ gọi là “thức ăn thoát tiêu”, Tinh bột, đường “thoát tiêu” khỏi dạ
cỏ sẽ tiêu hoá ở dạ múi khế (Bùi Đức Lũng et al,1995).
2.3.4.3 Tiêu hóa Protein
Protein được phân giải thành peptid và axít amin bởi men protease và men
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 2: C s lý lu n
peptidase của vi khuẩn. Phần lớn các axít amin tiếp tục bị vi khuẩn lên men để biến thành NH3và các axít béo bay hơi. Sau đó vi sinh vật dạ cỏ tổng hợp protein và axít amin cho cơ thể chúng từ NH3. Sự tiêu hoá protein ở dạ cỏ đã tạo ra một lượng lớn NH3 cho môi trường lên men của vi sinh vật. Satter and Roffler (1997) đã đưa ra sơ đồ trao đổi protein ởđộng vật nhai lại như sau:
Hình 2.6: Sơđồ quá trình tiêu hóa và phân giải Protein
( Nguồn: Satter and Roffler, 1977)
Ngoài ra, các hợp chất phi protein trong thức ănnhư các axít amin, amid, nitrat…Cũng cung cấp một nguồn đáng kể NH3. Hàm lượng NH3 trong dạ cỏ rất quan trọng, chúng quyết định đến quá trình lên men phân huỷ xơ và các hợp chất carbonhydrate khác. Một phần protein và axít amin tuy hoà tan trong dạ cỏ nhưng không bị phân huỷ ở dạ cỏ mà được đi xuống dạ múi khế và ruột non. Phần protein này được gọi là “protein thoát tiêu” (by-pass protein).
2.3.4.4 Tiêu hóa chất béo
Lipid của thực vật rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường dạ cỏ bởi enzyme lipase của vi khuẩn tạo thành axít béo và tiếp tục lên men tạo thành các axít béo bay hơi. Phần lớn axít béo cao phân tử là các axít béo không no và dễ tách ra như:
axítoleic, axít linoleic …Chúng được hấp thu trong dạ cỏ và được vi sinh vật hydro hoá, khi đó một lượng lớn axít béo sẽ bị biến đổi thành axít bão hoà (chủ
yếu là axít stearic và axít palmitic) chỉđược hấp thu ở ruột non.
,
Hình 2.7: Sơđồ chuyển hóa lipid ở bò
(Vũ Duy Giảng et al,, 2008),
Tiêu hóa ở dạ cỏ chiếm một vị trí rất quan trọng trong quá trình tiêu hóa của loài nhai lại. Trong dạ cỏ không có men tiêu hóa, nhưng cường độ tiêu hóa, đặc biệt là tiêu hóa chất xơ xảy ra ởđây rất mạnh, phù hợp với đặc điểm thức ăn phần lớn toàn cỏ và rơm đối với loài này. Đó là nhờ trong dạ cỏ chứa một lượng lớn những vi sinh vật hữu ích, chúng đi vào dạ cỏ theo thức ăn thực vật rồi gặp điều kiện yếm khí, độ kiềm, độẩm và nhiệt độ thích hợp mà sinh sôi nảy nởở trong đó, chúng bao gồm các thảo phúc trùng, vi khuẩn và nấm.
Theo Carl and Polan (1999), sự cần thiết của tất cả các chất liệu thức ăn được sử dụng bởi gia súc nhai lại là đối tượng của môi trường dạ cỏ, phụ thuộc vào sự
cấu thành của thức ăn đó, nó là một phần hoặc tổng cộng biến đổi lên sự lên men những sản phẩm cuối cùng. Mô hình của sự lên men đánh giá những sản phẩm cuối như năng lượng từ các axít béo bay hơi, protein vi sinh vật và NH3. Mặc dù nó đánh
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 2: C s lý lu n
giá nguyên liệu loại trừ sự thoái hóa ở gia súc nhai lại như carbonhydrate, protein, peptides chất lượng không cao.
2.4 THỰC LIỆU THÍ NGHIỆM 2.4.1 Thân lá cây bắp sau thu hoạch 2.4.1 Thân lá cây bắp sau thu hoạch
Có giá trị dinh dưỡng cao nhất trong tất cả các loại phụ phế phẩm từ ngũ cốc, và vì thế nó có tiềm năng lớn trong việc cải thiện dinh dưỡng cho gia súc. Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi (Đinh Văn Cải và cộng tác 1999) thì thân lá cây bắp sau thu hoạch có 25-26% chất khô; 32% xơ thô; 68,7% NDF; Tỷ lệ tiêu hoá chất hữu cơ: 53,3% và năng lượng trao đổi cho trâu bò: 7,46 MJ/kg chất khô. Cản trở lớn nhất đối với việc sử dụng thân lá cây bắp sau thu hoạch là khô cứng vì vậy cần thiết bị cán dập, chặt ngắn, phơi khô trước khi cho ăn hoặc phơi khô dùng dần.
2.4.2 Rơm rạ
Ở nước ta có khối lượng rất lớn nhưng tỷ lệ sử dụng trong chăn nuôi trâu bò còn rất khiêm tốn. Phần lớn chúng được sử dụng làm chất đốt (ở miền Bắc), hoặc
đốt trực tiếp ngoài ruộng làm phân bón ruộng, một lượng nhỏ được sử dụng làm nấm rơm (ở miền Nam). Rơm rạ có thể sử dụng như một nguồn thức ăn chính để
nuôi trâu bò cày kéo, sinh sản. Rơm rạ còn là nguồn xơ rất tốt để phối hợp với thức
ăn nhuyễn, những thức ăn bổ sung đắt tiền khác trong chăn nuôi bò sữa và vỗ béo bò thịt.
Rơm rạ kềnh càng hơn và chất lượng thấp hơn thân cây bắp. Nếu chỉ cho ăn một mình rơm lúa thì gia súc chỉ ăn được một số lượng nhỏ. Rơm lúa rất giàu kali hòa tan nhưng thiếu canxi (Ca) có khả năng hấp thu, vì thế gia súc được nuôi dưỡng bằng rơm lúa là chính thì cần phải bổ sung thêm nguồn Ca dễ tiêu. Rơm lúa còn có thành phần lignin thấp (6-7%) nhưng thành phần silic cao (12-16%) so với các loại phế phẩm cây trồng khác (thường có khoảng 10-12% Silic). Thành phần Silic cao là nguyên nhân chính dẫn đến tỷ lệ tiêu hóa kém. Phần thân lúa được tiêu hóa nhiều hơn lá vì thế nên gặt lúa ở mức càng thấp càng tốt.
Khẩu phần chủ yếu là rơm lúa với một lượng nhỏ thức ăn bổ sung sẽ làm cho bê tăng trưởng chậm, tuổi đẻ lứa đầu lúc 4-5 năm, còi xương và bò có tỷ lệ đậu thai thấp.
Rơm rạđược ủ với 4-5% urea sẽ làm tăng tỷ lệ tiêu hoá (từ 39 lên 52%) giá trị
năng lượng tăng từ 4,74 MJ lên 5,49 MJ/kg chất khô. Khả năng ăn vào cuả trâu bò với rơm ủ cũng cao hơn so với rơm không ủ (2,6kg so với 1,6kg DM/100kg khối lượng).
2.4.3 Bã mía
Bã mía là một lại thức ăn khó tiêu do hàm lượng xơ rất cao trong đó hàm lượng lignin (khoảng hơn 20%) rất lớn và rất nghèo protein là một trong những trở
ngại cho sự tiêu hóa của gia súc nhai lại (Lê Đức Ngoan, 2005). Theo Kamstra et al, (1958) sự tăng lignin cùng với sự sinh trưởng của thực vật làm giảm tỷ lệ tiêu hóa cellulose xuống 30 – 50% do lignin rất bền vững đối với acid mạnh và enzyme của vi khuẩn. Lớp ngoài thành tế bào được tạo thành chủ yếu từcác phức chất ligno- hemicellulose mà các enzyme vi sinh vật dạ cỏ thủy phân vô cùng chậm (Lê Đức Ngoan, 2005). Thực vật càng trưởng thành số lượng lignin càng tăng nên mức độ
tiêu hóa cellulose cũng giảm (Trần Cừ, 1979).
Khi ủ phụ phẩm nhiều xơ với urea hoặc bổ sung urea, một nguồn nitơ rẻ tiền vào khẩu phần, sẽ đảm bảo sự gia tăng tỷ lệ tiêu hoá và khả năng ăn vào của gia súc. Tiêu hoá xơ cũng được cải thiện rõ nét khi bổ sung thêm một lượng nhỏ
carbonhydrate dễ lên men như rỉ mật, xác mì, khoai lang, cám…
Khi sử dụng nitơ phi protein, lưu huỳnh là yếu tố giới hạn chính đến hoạt
động của hệ vi sinh vật dạ cỏ. Một hỗn hợp gồm 90% urea và 10% sulphat natri (Na2SO4) làm cho tỷ lệ N/S được cân bằng. Rơm rạ thường có hàm lượng canxi, phospho và muối thấp. Việc bổ sung coban (Co), đồng (Cu) sẽ cải thiện được khẩu phần dựa trên rơm rạ. Tỷ lệ tiêu hóa của rơm sẽ được cải thiện một cách đáng kể
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 2: C s lý lu n
2.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TÌM RA CÁC NHÓM VI KHUẨN PHÂN GIẢI XƠ PHÂN GIẢI XƠ
Mục đích: Tách ròng những dòng vi khuẩn sống trong dạ cỏ bò để tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh cơ chất phụ phẩm nông nghiệp.
Nguyên tắc: Phương pháp tách ròng thực hiện các bước như: chuẩn bị mẫu, trải mẫu trên môi trường M1, quan sát và cấy chuyển những khuẩn lạc khác nhau về
hình dạng, màu sắc đặc trưng, tiếp tục cấy ria để tách ròng vi khuẩn.
Chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Đĩa petri và môi trường M1 được khử
trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong thời gian 20 phút.
Mô tả khuẩn lạc: Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên từng đĩa petri riêng ởđiều kiện 38oC, trong 48 giờ. Quan sát và mô tả khuẩn lạc bằng kính lúp ởđộ phóng đại 5X dựa vào một sốđặc điểm sau. (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012).
+ Hình dạng: Dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular); dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ
(rhizoid).
+ Độ nổi: Dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc phía vành khuẩn lạc lài xuống; dạng mô (convex) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate).
+ Dạng bìa: Có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous).
+ Màu sắc: Khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ, vàng, lục…
Mô tả vi khuẩn: Một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng, trạng thái, khả năng chuyển động của vi khuẩn. (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012)
+ Hình dạng, trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở
vật kính 100X.
+ Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi trường thạch bán lỏng (0,3 - 0,6% thạch); đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủở nhiệt độ 38oC và quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn sau 3 ngày.
+ Gram vi khuẩn được khảo sát dựa theo phương pháp nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram.
2.6 ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI THÂN LÁ CÂY BẮP, RƠM VÀ BÃ MÍA TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Dịch vi khuẩn gồm 4 loại vi khuẩn dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê được nuôi trong môi trường M2 với mật số 107 CFU/ml được ủ ở 380C trong 3 ngày trong bình kỵ
khí. Dịch dạ cỏ được lấy ở dạ cỏ bò, đựng trong bình tối màu được cho vào trong trong bình giữ ấm và nhanh chóng chuyển lên phòng thí nghiệm, sau đó được lọc qua 4 lớp vải muslin. Dung dịch đệm (buffer) được sử dụng trong thí nghiệm theo mô tả của Tilley và Terry (1963) (bảng 3,1). Dung dịch sau khi pha xong được sục khí CO2 cho đến khi chuyển từ đục sang trong suốt; sau đó ủ kỵ khí ở 380C. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại,.
Bã mía trước khi làm thí nghiệm được rửa loại đường do vi khuẩn dạ cỏ rất mẫn cảm với đường vì với lượng đường cao sẽ làm giảm tiêu hóa cho đến mức ngừng hoàn toàn sự phân giải chất xơ trong dạ cỏ (Kurilov và Lischenko, 1964). Theo Belasco (1956); Huhtanen và Elliott (1956) cho biết thêm sự tiêu hóa chất xơ
giảm vì đường là nguồn năng lượng dễ sử dụng nhất đối với vi sinh vật và được vi sinh vật sử dụng nhiều hơn cellulose.
Rơm và thân lá cây bắp là phụ phẩm có hàm lượng N2 hydratcarbon thấp và chứa nhiều Lignin và cellulose nên tỷ lệ tiêu hóa thấp ( preston and Leng 1987, Sundtol 1988a) khó hòa tan nhưng nó sẽđược tiêu hóa mạnh nếu có bổ sung nhiều vi sinh vật phân giải cellulose vào trong dạ cỏ và chính lượng vi khuẩn tăng lên trong dạ cỏ sau khi bổ sung vi khuẩn thì làm tăng tỷ lệ phân giải nhiều hơn.
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 2: C s lý lu n
Theo nghiên cứu của Mould et al., 2005 cho biết môi trường và các thành phần dưỡng chất cho vi sinh vật phát triển có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả xác
định tỷ lệ tiêu hóa thức ăn in vitro. Chức năng của môi trường in vitro là duy trì
được pH ởđiều kiện trung tính như trong dạ cỏ và cung cấp thêm dưỡng chất cho vi sinh vật dạ cỏ phát triển để tiêu hóa thức ăn. Kỹ thuật xác định tỷ lệ tiêu hóa thức ăn
in vitro do Tilley và Terry (1963) chuẩn hóa có công thức sử dụng hóa chất tương tự như công thức hóa chất làm nước bọt nhân tạo cừu của Mc Dougall (1948).
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm 3.1.1 Địa điểm
Đề tài tiến hành tại Phòng Chăn nuôi Tiên Tiến E103, Bộ môn chăn nuôi, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Dịch dạ cỏ dùng để thí nghiệm in vitro được lấy trên cơ thể của bò đực lai Sind, Quận Ô Môn, TP, Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ ngày 15/10/ 2013 đến ngày 15/12/2013.
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ dùng để lấy dịch dạ cỏ của bò
- Bình đá: Dùng để giữẩm, khi lấy dịch từ dạ cỏ của bò sẽđược trữ trong keo nhựa, keo nhựa được đựng trong bình đá đảm bảo nhiệt độ của dịch dạ cỏ không bị
thay đổi đáng kể khi di chuyển về phòng thí nghiệm.Vi sinh vật trong dịch dạ cỏ có thể bị chết nếu dịch dạ cỏ không đảm bảo nhiệt độ cho vi sinh vật hoạt động.
- Keo nhựa: Dung tích 5 lít, dùng để trữ dịch dạ cỏ khi lấy dịch ra khỏi dạ dày của bò.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng để thí nghiệm - Lọủ: Dùng đểủ thực liệu khảo sát trong 24 giờ.
- Ống tiêm đo thể tích khí: Dùng đểđo thể tích khí sinh ra tương ứng khi ta ủ
thực liệu.
- Bộ dụng cụ thí nghiệm tỉ lệ tiêu hóa: Gồm những ống nghiệm tối màu có nắp đậy thể tích 50 ml, trên nắp có một lỗ nhỏ thông khí và giá đỡống nghiệm.
- Tủ sấy: Xác định trọng lượng. - Bình tam giác.
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 3: Ph ng ti n & Ph ng pháp nghiên c u - Beaker 50ml, 250ml, 500ml. - Ống đong 10ml, ống hút. - Pipette. - Phiễu đong. - Ống chuẩn độ. - Bộ Kjeldahl. 3.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.3.1 Bố trí thí nghiệm
Đề tài được tiến hành với 3 thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại.
3.3.1.1 Thí nghiệm 1
- Nghiệm thức đối chứng (Đ/C): Thân lá cây bắp không bổ sung vi khuẩn dạ
cỏ.
- Nghiệm thức 1 (NT1): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ bò. - Nghiệm thức 2 (NT2): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu.