PHÂN GIẢI XƠ
Mục đích: Tách ròng những dòng vi khuẩn sống trong dạ cỏ bò để tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh cơ chất phụ phẩm nông nghiệp.
Nguyên tắc: Phương pháp tách ròng thực hiện các bước như: chuẩn bị mẫu, trải mẫu trên môi trường M1, quan sát và cấy chuyển những khuẩn lạc khác nhau về
hình dạng, màu sắc đặc trưng, tiếp tục cấy ria để tách ròng vi khuẩn.
Chuẩn bị đĩa môi trường phân lập: Đĩa petri và môi trường M1 được khử
trùng nhiệt ướt ở 1210C, 1 atm trong thời gian 20 phút.
Mô tả khuẩn lạc: Nuôi cấy mỗi vi khuẩn trên từng đĩa petri riêng ởđiều kiện 38oC, trong 48 giờ. Quan sát và mô tả khuẩn lạc bằng kính lúp ởđộ phóng đại 5X dựa vào một sốđặc điểm sau. (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012).
+ Hình dạng: Dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular); dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ
(rhizoid).
+ Độ nổi: Dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có hai dốc phía vành khuẩn lạc lài xuống; dạng mô (convex) thường nổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (umbonate), nổi hố (umbilicate).
+ Dạng bìa: Có 5 dạng bìa phổ biến như sau: bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose), bìa sợi (filamentous).
+ Màu sắc: Khuẩn lạc thường có màu trắng trong, trắng đục, xám, đỏ, vàng, lục…
Mô tả vi khuẩn: Một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng, trạng thái, khả năng chuyển động của vi khuẩn. (Đỗ Thị Cẩm Hường, 2012)
+ Hình dạng, trạng thái vi khuẩn được quan sát bằng phương pháp giọt ép ở
vật kính 100X.
+ Khả năng di động vi khuẩn: vi khuẩn được chuyển vào môi trường thạch bán lỏng (0,3 - 0,6% thạch); đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủở nhiệt độ 38oC và quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn sau 3 ngày.
+ Gram vi khuẩn được khảo sát dựa theo phương pháp nhuộm Gram của nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram.
2.6 ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI THÂN LÁ CÂY BẮP, RƠM VÀ BÃ MÍA TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Dịch vi khuẩn gồm 4 loại vi khuẩn dạ cỏ bò, trâu, cừu và dê được nuôi trong môi trường M2 với mật số 107 CFU/ml được ủ ở 380C trong 3 ngày trong bình kỵ
khí. Dịch dạ cỏ được lấy ở dạ cỏ bò, đựng trong bình tối màu được cho vào trong trong bình giữ ấm và nhanh chóng chuyển lên phòng thí nghiệm, sau đó được lọc qua 4 lớp vải muslin. Dung dịch đệm (buffer) được sử dụng trong thí nghiệm theo mô tả của Tilley và Terry (1963) (bảng 3,1). Dung dịch sau khi pha xong được sục khí CO2 cho đến khi chuyển từ đục sang trong suốt; sau đó ủ kỵ khí ở 380C. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại,.
Bã mía trước khi làm thí nghiệm được rửa loại đường do vi khuẩn dạ cỏ rất mẫn cảm với đường vì với lượng đường cao sẽ làm giảm tiêu hóa cho đến mức ngừng hoàn toàn sự phân giải chất xơ trong dạ cỏ (Kurilov và Lischenko, 1964). Theo Belasco (1956); Huhtanen và Elliott (1956) cho biết thêm sự tiêu hóa chất xơ
giảm vì đường là nguồn năng lượng dễ sử dụng nhất đối với vi sinh vật và được vi sinh vật sử dụng nhiều hơn cellulose.
Rơm và thân lá cây bắp là phụ phẩm có hàm lượng N2 hydratcarbon thấp và chứa nhiều Lignin và cellulose nên tỷ lệ tiêu hóa thấp ( preston and Leng 1987, Sundtol 1988a) khó hòa tan nhưng nó sẽđược tiêu hóa mạnh nếu có bổ sung nhiều vi sinh vật phân giải cellulose vào trong dạ cỏ và chính lượng vi khuẩn tăng lên trong dạ cỏ sau khi bổ sung vi khuẩn thì làm tăng tỷ lệ phân giải nhiều hơn.
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 2: C s lý lu n
Theo nghiên cứu của Mould et al., 2005 cho biết môi trường và các thành phần dưỡng chất cho vi sinh vật phát triển có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả xác
định tỷ lệ tiêu hóa thức ăn in vitro. Chức năng của môi trường in vitro là duy trì
được pH ởđiều kiện trung tính như trong dạ cỏ và cung cấp thêm dưỡng chất cho vi sinh vật dạ cỏ phát triển để tiêu hóa thức ăn. Kỹ thuật xác định tỷ lệ tiêu hóa thức ăn
in vitro do Tilley và Terry (1963) chuẩn hóa có công thức sử dụng hóa chất tương tự như công thức hóa chất làm nước bọt nhân tạo cừu của Mc Dougall (1948).
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm 3.1.1 Địa điểm
Đề tài tiến hành tại Phòng Chăn nuôi Tiên Tiến E103, Bộ môn chăn nuôi, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Dịch dạ cỏ dùng để thí nghiệm in vitro được lấy trên cơ thể của bò đực lai Sind, Quận Ô Môn, TP, Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ ngày 15/10/ 2013 đến ngày 15/12/2013.
3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1 Dụng cụ dùng để lấy dịch dạ cỏ của bò
- Bình đá: Dùng để giữẩm, khi lấy dịch từ dạ cỏ của bò sẽđược trữ trong keo nhựa, keo nhựa được đựng trong bình đá đảm bảo nhiệt độ của dịch dạ cỏ không bị
thay đổi đáng kể khi di chuyển về phòng thí nghiệm.Vi sinh vật trong dịch dạ cỏ có thể bị chết nếu dịch dạ cỏ không đảm bảo nhiệt độ cho vi sinh vật hoạt động.
- Keo nhựa: Dung tích 5 lít, dùng để trữ dịch dạ cỏ khi lấy dịch ra khỏi dạ dày của bò.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng để thí nghiệm - Lọủ: Dùng đểủ thực liệu khảo sát trong 24 giờ.
- Ống tiêm đo thể tích khí: Dùng đểđo thể tích khí sinh ra tương ứng khi ta ủ
thực liệu.
- Bộ dụng cụ thí nghiệm tỉ lệ tiêu hóa: Gồm những ống nghiệm tối màu có nắp đậy thể tích 50 ml, trên nắp có một lỗ nhỏ thông khí và giá đỡống nghiệm.
- Tủ sấy: Xác định trọng lượng. - Bình tam giác.
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 3: Ph ng ti n & Ph ng pháp nghiên c u - Beaker 50ml, 250ml, 500ml. - Ống đong 10ml, ống hút. - Pipette. - Phiễu đong. - Ống chuẩn độ. - Bộ Kjeldahl. 3.3 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 3.3.1 Bố trí thí nghiệm
Đề tài được tiến hành với 3 thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại.
3.3.1.1 Thí nghiệm 1
- Nghiệm thức đối chứng (Đ/C): Thân lá cây bắp không bổ sung vi khuẩn dạ
cỏ.
- Nghiệm thức 1 (NT1): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ bò. - Nghiệm thức 2 (NT2): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu. - Nghiệm thức 3 (NT3): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ cừu. - Nghiệm thức 4 (NT4): Thân lá cây bắp bổ sung vi khuẩn dạ cỏ dê.
3.3.1.2 Thí nghiệm 2
- Nghiệm thức đối chứng (Đ/C): Rơm không bổ sung vi khuẩn dạ cỏ. - Nghiệm thức 1 (NT1): Rơm bổ sung vi khuẩn dạ cỏ bò.
- Nghiệm thức 2 (NT2): Rơm bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu. - Nghiệm thức 3 (NT3): Rơm bổ sung vi khuẩn dạ cỏ cừu. - Nghiệm thức 4 (NT4): Rơm bổ sung vi khuẩn dạ cỏ dê.
- Nghiệm thức đối chứng (Đ/C): Bã mía không bổ sung vi khuẩn dạ cỏ. - Nghiệm thức 1 (NT1): Bã mía bổ sung vi khuẩn dạ cỏ bò.
- Nghiệm thức 2 (NT2): Bã mía bổ sung vi khuẩn dạ cỏ trâu. - Nghiệm thức 3 (NT3): Bã mía bổ sung vi khuẩn dạ cỏ cừu. - Nghiệm thức 4 (NT4): Bã mía bổ sung vi khuẩn dạ cỏ dê.
3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi
- Thành phần dưỡng chất thức ăn trong các thí nghiệm được phân tích theo tiêu chuẩn AOAC (1990).
- Tổng lượng khí sinh ra (ml) ở 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ và 24 giờ. - Tỷ lệ tiêu hóa DMD ở 24 giờ.
- Hàm lượng N-NH3, pH.
3.3.3 Tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Cân 2 gDM mẫu thức ăn theo các bảng lượng cân các nghiệm thức
ứng với từng mức độ khi đem đi thí nghiệm, cẩn thận không được vương vảy mẫu, sau khi cân xong cho mẫu vào lọủ tối màu.
Bước 2: Pha dung dịch đệm. Dung dịch đệm được sử dụng trong thí nghiệm là theo mô tả của Tilley and Terry (1963).
Bảng 3.1 Lượng cân các hóa chất có trong một lít dung dịch đệm
STT Hóa chất Lượng cân (g/lít)
1 NaHCO3 50,96 2 KCl 2,94 3 CaCl2 0,21 4 Na2HPO4,12H2O 48,36 5 NaCl 2,44 6 MgSO4,7H2O 0,62 7 Cystein 1,32
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 3: Ph ng ti n & Ph ng pháp nghiên c u
Công thức pha được trình bày trong (bảng 3.1). Dung dịch sau khi pha xong
được sục khí CO2 cho đến khi chuyển từ đục sang trong suốt. Chúng ta có thể làm
ấm dung dịch đệm bằng cách cho thùng chứa dung dịch vào bồn ủ (water bath) khoảng 15 phút, nhiệt độ nước trong bồn ủ được kiểm soát ở 38ºC trước khi sử
dụng để tạo điều kiện nhiệt độ tốt, tránh sốc nhiệt cho vi sinh vật dạ cỏ.
Bước 3: Lấy dịch dạ cỏ, dịch dạ cỏ được thu thập và được giữ ấm trong thùng đá sau đó nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. Tại đây dịch dạ cỏđược lọc qua 4 lớp vải muslin vào lọ, bơm khí CO2 rồi đậy kín tạo yếm khí và ủ ấm ở
nhiệt độ 38ºC trước khi dùng để thực hiện thí nghiệm. Dựa vào số lượng đơn vị thí nghiệm và lượng thực liệu khi đem ủ là bao nhiêu từ đó ta cũng tính được lượng dung dịch dạ cỏ cần thí nghiệm là bao nhiêu. Đối với 1 gDM thực liệu ta cần 20 ml dung dịch dạ cỏ.
Bước 4: Trộn dịch dạ cỏ đã lấy vào dung dịch đệm tạo hỗn hợp dung dịch
đệm và dịch dạ cỏ, khuấy đều cho lượng vi sinh vật trong dịch dạ cỏ phân bố đều trước khi chia ra từng lọ ủ. Dùng ống đong, đong 200 ml hỗn hợp dịch dạ cỏ và dung dịch đệm cho vào lọ ủ đã có sẵn 2 gDM thực liệu, dùng đũa thủy tinh khuấy
đều cho thực liệu thấm ướt hoàn toàn, tránh để thực liệu dính trên thành keo ủ, dùng bình tia chứa nước cất rửa thực liệu bị dính trên đũa thủy tinh vào trong lọủ, tránh thất thoát mẫu ảnh hưởng đến kết quả, đậy kính lọủ, dùng nút nhôm đóng kín xung quanh kẽ hở giữa nắp lọủ và miệng lọủ ngăn không cho không khí đi vào.
Sắp xếp tất cả các lọ ủ thực liệu vào khung inox cho vào bồn ủ (water bath) nhiệt độủở 38ºC, tiến hành ủ và theo dõi lượng khí sinh ra tương ứng sau 24 giờ.
Bước 5: Tính tỷ lệ tiêu hóa, Sau khi mẫu ủ trong 24 giờđem ra lọc bằng túi vải đã xác định trọng lượng, lọc xong đem sấy ở 105oC cho đến trọng lượng không
đổi. Công thức tính tỷ lệ tiêu hóa:
Dưỡng chất trước khi ủ - Dưỡng chất sau khi ủ
Dưỡng chất trước khi ủ
X 100% TLTH (%) =
3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ
Số liệu thô được nhập vào bảng tính Microsoft Excel 2007. Sau đó được xử lý thống kê bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình tuyến tính tổng quát (General Linear Model) trên phần mềm Minitab 16.
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 4: K t qu th o lu n
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THỨC ĂN TRONG THÍ NGHIỆM
Bảng 4.1: Thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm (%DM)
Qua bảng 4.1 ta thấy thân lá cây bắp có phần trăm vật chất khô (DM) là 15,23% và phần trăm đạm thô là 9,4 %, thấp hơn kết quả của Danh Mô và Nguyễn Văn Thu (2008) có phần trăm vật chất khô là 17,4% và phần trăm đạm thô là 9,86%. Hàm lượng NDF của thân lá cây bắp thí nghiệm 65,2% bằng với Danh mô và Nguyễn Văn Thu (2008) là 65,1%.
Rơm lúa sau khi thu hoạch được phơi khô dự trữ là nguồn thức ăn quanh năm cho bò, rơm thường có giá trị dinh dưỡng thấp, qua phân tích cho thấy hàm lượng vật chất khô (DM) của thí nghiệm 90,2% cao hơn so với báo cáo của Nguyễn Văn Thu (2009) là 83,2% và thấp hơn với kết quả phân tích của Tống Văn Hiền (2012) là 92,97% DM. Hàm lượng protein thô của rơm trong thí nghiệm này 4,7% cao hơn kết quả Tống Văn Hiền (2012) và thấp hơn kết quả Thạch Tăng Ly (2013) lần lượt là 4,59% và 5,07%. Hàm lượng ADF của rơm trong thí nghiệm 45,51% cao hơn so với kết quả của Nguyễn Nhật Xuân Dung et al, (2006) là 36,44% và NDF của rơm trong thí nghiệm 68,5% cao hơn so với Danh Mô (2009) là 63,0%.
Hàm lượng vật chất khô của bã mía sau khi sấy ở nhiệt độ 105oC cho đến khi trọng lượng không đổi thu được kết quả là 84,37%. Kết quả này thấp hơn so Đỗ Thị
Cẩm Hường (2012) là 93,69%. Theo Pozy (1998), vật chất khô của thức ăn phơi khô và thức ăn tinh là từ 85% đến 92%. Hàm lượng protein thô của bã mía 4,48% thấp hơn
STT Thực liệu %DM %OM NDF ADF Ash %CP
1 Thân lá cây Bắp 15,23 92,36 65,2 35,46 7,64 9,45
2 Rơm 90,2 85,47 68,5 45,51 14,53 4,7
kết quả Nguyễn Nhật Xuân Dung et al, (2006) là 4,88%. Tỉ lệ NDF của bã mía thu
được 81,24%, kết quả này thấp hơn với kết quảĐỗ Thị Cẩm Hường (2012) là 89,05%.
4.2 THÍ NGHIỆM 1
Bảng 4.2: Ảnh hưởng bổ sung vi khuẩn vào thức ăn của thân lá cây bắp lên sự sinh khí và tiêu hóa DMD (%) Thân lá cây Bắp Thời gian (giờ) V (ml) DMD (%) V/gDM (ml) 6 12 18 24 Đ/C 20,5b 25,7d 33,5c 29c 108,75c 23,5d 463,79a NT1 26,5ab 36,7ab 47,0a 45,5a 155,75a 37,5b 415,56ab NT2 31,2a 41,0a 44,0ab 37,7b 154,00a 44,5a 346,79c NT3 23,0b 33,0bc 41,0b 38,0b 135,00b 34,5c 391,34bc NT4 22,2b 31,2c 41,0b 42,2ab 136,75b 34,5c 396,75b SEM 1,43 1,42 1,21 1,05 3,10 0,65 0,01 P 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 Các chữa, b, c
khác nhau trên cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa thống kê,
Đ/C: NT đối chứng, NT1: bổ sung vi khuẩn bò, NT2: bổ sung vi khuẩn trâu, NT3: bổ sung vi khuẩn cừu, NT4: bổ sung vi khuẩn dê.
Biểu đồ 4.1 Biểu đồ biểu thị lượng khí sinh ra của thân lá cây bắp
Qua bảng 4.2 và biểu đồ 4.1 ta thấy khi bổ sung vi khuẩn vào thì tổng lượng khí sinh ra 6 giờ NT2 là 31,2 ml/g cao hơn NT1 là 26,5 ml/g, tỷ lệ tiêu hóa và lượng khí sinh ra trên gDM tiêu hóa ở NT1 415,56 ml/gDM, NT2 là 346,79 ml/gDM đều khác biệt
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Đ/C NT1 NT2 NT3 NT4 G.Vol 6 giờ (ml) G.Vol 12 giờ (ml) G.Vol 18 giờ (ml) G.Vol 24 giờ (ml)
Lu n v n T t nghi p i h c Ch ng 4: K t qu th o lu n
có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Trong khi đó nghiệm thức đối chứng, NT3 và NT4 chênh lệch nhau cũng không nhiều.
Ở thời điểm 12 giờ thì tổng lượng khí sinh ra ở NT2 là 41 ml cao hơn các nghiệm thức còn lại ở mức có ý nghĩa thống kê (P<0,05) do khả năng phân hủy thức ăn cao làm cho thể tích khí tăng lên, ở các nghiệm thức còn thể tích khí cũng tăng nhưng ở
mức trung bình. Sau 18 giờ thì tổng lượng khí sinh ra ở NT2 44 ml/g nhưng lại thấp hơn NT1 và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại ở mức (P<0,05). 24 giờ thì lượng khí sinh ra ở NT2 lại giảm đáng kể so với NT1 và NT4 lần lượt là 45,5 ml/g và 42,2 ml/g.
Khi bổ sung vi khuẩn vào thân lá cây bắp thì lượng khí sinh ra và tỷ lệ tiêu hóa cao, lượng khí sinh ra trên gDM tiêu hóa cao nhất so với S. Salehpor, 2012 (144 ml/ gDM). Bổ sung vi khuẩn vào thân lá cây bắp cho gia súc ăn thì khả năng tiêu hóa mạnh nhất trong 12 đến 18 giờ và sau đó giảm dần.
4.2.1 Ảnh hưởng của bổ sung vi khuẩn lên hàm lượng N-NH3 (mg/l), pH của thân lá cây bắp
Bảng 4.3: Hàm lượng N-NH3(mg/l), pH sinh ra trong từng nghiệm thức