Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người việt nam bằng kỹ thuật PCR RFLP

Phát hin mt loi t bin gen ty th  i Vit Nam bng k thut PCR-RFLP Phm Minh Hu i hc Khoa hc T nhiên, Khoa Sinh hc LuChuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30 ng dn: PGS.TS Phan Tu o v: 2011 Abstract: Tp trung nghiên cu v t bin mn 9 bp CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V) nm gia gene mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân t RNA vn chuyn Lysine (tRNALys). Ngoài ra, tìm hiu v t bi     c chng minh là chim khong 80% s ca mang hi chng là MELAS         9          bin này. Keywords: Sinh hc thc nghim; t bin gen; i Vit Nam; K thut PCR-RFLP; Gen ty th Content Ty th là m ca t bào nhân thc có vai trò ti dng ATP cho các hong sng ca t bào. Ty th i DNA dng mch vòng, kích tc 16,5 kb,   37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vn chuyn và 2 RNA ribosome ca ty th. Các gen trong ty th di truyn t m sang con.    v            .                         .   (reactive oxygen species)  gây nên         . T l t bin cao, có kiu tha k khác nhau và s bn sao ln trên mi t bào là nhc a DNA ty th (mtDNA). Nghiên ct bin trong mtDNA là mt trong nhng cách cho phép chúng ta hic quá trình tii, c th là v ngun gc, quan h h hàng, kh i vi h khác, s i nhng vùng mi ca th gii. Mt lot các loi hi chng và bnh t ng cht a t t bin trong h gen ty tht bin trong h gen ty th, cho dù là mt bin hay ng xy ra  các loi mô bào cn nn, tuyn ni tit và u ng ln chi v. t biu tiên gây bnh trên h gen ty th c bi t bin gây bnh trên h gen ty th c phát hit bin trong mtDNA n kh ng hp ATP ca t bào và t ng n ht c các h th. Tuy nhiên, các t  ng nhiu nht là nhng b phn có mc tiêu th ng cao nh bt bin mtDNA xut hin là nguyên nhân ch yu gây mt chn kinh. Không phi tt c các phn ca genome ty th phát trin  cùng mt m t bin, phn ng xuyên nht ca mtDNA là phn không mã hóa, phn nu khin gi là D-loop (cha hai vùng siêu bin HVR1 và HVR2 chim khong 7% genome ty th). Mt trong nhng phc coi là ch th sinh h cho ngun gc các t i là phn trình t lp li 9 bp nm trong vùng V gia gen mã hóa cho cytochrome c oxidase (COII) và tARN Lys ng t bin mn  các bnh nhân b hi chng bnh ty th.  Vit Nam, nhng nghiên cu v genome ty th c quan tâm nhiu. Vic nghiên cu t bin trong h gen ty th n, góp phn làm sáng t nguyên nhân ca nhiu bnh di truyn và chuyi quan h tin hóa, di truyn trong qun th.  c hi tài: “Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP”, p trung nghiên cu v t bin m n 9 bp CCCCCTCTA trong vùng không mã hóa (vùng V) nm gia gene mã cho cytochrome c oxidase subunit II (COII) và gen mã hóa cho phân t RNA vn chuyn Lysine (tRNA Lys ). Ngoài ra, cng thi nghiên ct bim A3243G và A8344G c chng minh là chim khong 80% s ca mang hi ch  ng là MELAS và         n 9        các     ph bin này . Đối tượng nghiên cứu:     -20 o  Hóa chất: gm các cp m  sàng lc các lo t bi m trên mtDNA và cp mi pUC19Fw và pUC19Rv (b  c mua t hãng Invitrogen và Fermentas, thang chun c mua t hãng Fermentas; b kit tách chic mua t hãng Qiagen, kit pGEM- c mua t hãng Invitrogen; Taq DNA polymerase ca Hãng Enzynomics và Protein cung cp, hóa cht cho gii trình t ca hãng Beckman Coulter. Các hóa cht còn l tinh sch cho nghiên cu sinh hc phân t. Hai loi cp m kim tra s có mt ca 2 lot bim A3243G và A8344G trên mtDNA gây nên các hi chng là MELAS và MERRF (bp mi c s d sàng lng thi hai lot bin là A8344G và t bin mn 9 bp CCCCCTCTA. Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR STT Tên mồi Trình tự mồi 1 Mt Fw -CAAGAGAAATAAGGCTTACTTC-  Mt Rv -GGAGTAGGAGGTTAGCCATGGG- 2 MRAGFw -GGTATACTACGGTCAATGCTC-  MRAGRv -TTTCACTGTAAAGAGGTGTGGG- Các cp mc thit k  bt cc hiu vn DNA cng mi cha nucleotide không ghép c to thêm hoc gim bt v trí ct ca các enzyme gii hn, t n di khác nhau  mu bnh nhân b t bin và t bin. Thit b máy móc chính gng, máy PCR (Eppendorf), máy soi và ch  hp th quang hc trình t CEQ 8000 ( Beckman Coulter) và nhiu thit b cn thit khác. Phương pháp nghiên cứu 1.  2. Tách plas 3.  4.  5.  6.  7.               - RFLP) 8. -T 9.  10.  Kết quả nghiên cứu 1. Thu thập mẫu máu bệnh nhân và tách chiết DNA tổng số Một số đặc điểm của mẫu phân tích  --        Tách chiết DNA của các mẫu DNA tng s t 200 µl mu máu ca bc tách theo kit ca Qiagen, ch phm DNA tng s n di trên gel agarose 1%. Kt qu n di cho thu có mv ng n thp, chng t DNA tng s u nguyên vn  hp th ánh sáng t ngoi ca ch phm DNA tng s t 72 mu b  tinh sng DNA. Kt qu c cho thy các mu có t s A 260 /A 280 nm trong khong t ch phm ít lc các sn phm DNA tng s t yêu c tic thí nghim tip theo. 2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP t bin hi chng MERRF nm gn lp 9 bp CCCCCTCTA, nên chúng tôi nghiên cu s có mt ct bin này cùng nhau. Nhân bản đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR  thut PCR vi mi xuôi (8155-8175) bt cp hoàn toàn vi si khuôn và mi c (8366-8345) cha mm không bt cp vi si khuôn có trình t  nhân bn n gen 212 bp (8155-8366) trong h gen ty th. Tên mồi Trình tự MRAG Fw -8175) MRAG Rv G-8345) n DNA mà chúng tôi nhân bn là trình t ng có th t bin mn 9 bp nm  mt trong hai trình t lp li CCCCCTCTA t v trí 8272-  t bi m A8344G. t bin mt bin A8344G s có chiu dài 212 bp t bin A8344G thì chm ct ca BanII (GAGCCC và GGGCCC). c nhân bn bc ct bng enzyme BanII s tn vi c là 99 bp, 41 bp và 72 bp. Nt bin A8344G, vi cách thit k mi va nêu n DNA nhân bn s có thêm mm ct  n 72 bp (GAGCCC)n phm ct bng BanII s gn vc là 99 bp, 41 bp, 52 bp và 20 bp. t bin mn gen nhân bn ch còn 203 bp và nc ct bng BanII s cho c là 99 bp, 32 bp, 52 bp và 20 bp. c nhìn thy trên gel c qúa nh nên có th chy ra khi gel. Kt qu n di agarose 2% sn phm PCR cho thy s xut hin ci kích i (203-212 bp)  các mu có DNA tách t bmu kim tra âm (không cha DNA) không n nào. y, cp mi chúng tôi thit k c hiu cao cho vic nhân bn DNA c 212 bp Sau khi kim tra sn phn hành ct trc tip các sn phm PCR bng enzyme gii hn Bann di sn phm trên gel polyacrylamide 15%. Kt qu cho thy sn phm PCR ca tt c 72 mu bnh nhân chúng tôi nghiên cu c enzyme BanII ct t y n DNA mà chúng tôi nhân bn ch có 2 v trí nhn bit cho enzyme BanII, chng t tt c các mu kit bim A8344G. Mc dù tt c các mu b c khác nhau gia hai nhóm: nhóm th nht sn phm PCR b ct t là 99 bp, 41 bp, 72 bp; nhóm th t hic ngChúng tôi nghi ng các mu  nhóm th hai này xy ra hing mt mn nucleotide và s mn này nm  (t v  ch t. Tt c các mu nghi ng        t bin m n này  dng homoplasmy  tt c ng ht bin mn có mt  tt c các bn copy ca DNA ty th.  khnh tính cht di truyn theo dòng m ca các gen trên h gen ty th kim tra ph -RFLP cu I, II, III và IV) có bnh nhân nghi ng mn. Kt qu n di cho thy sn phm PCR vi mu DNA khuôn ca b bnh nhân ca c t bng Bani kích c 99 bp, 72 bp và 41 bp gi mn phm PCR vi DNA khuôn ca m bnh nhân  c 4 gia c ct bng Banc 99 bp, 72 bp và 32 bp gi mu bnh nhân nghi ng t bin mn. Kt qu này chng t b bnh nhân ca c  t bin mn, còn bnh nhân và m bnh nhân ct bin mn.  có thêm bng chng v di truyn t m sang con ct bin m tin hành kim tra ph n gen 212 bp cnh nhân khác  V và VI), mt qu n di sn phm PCR trên gel polyacrylamide 15% cho thn  mu các con và m bu ch nhân bn  mu b bnh nhân. Kt qu này mt ln na b sung tính cht di truyn theo dòng m ct bin mn 9 bp.  kh nh chc chn nhng kt lu    -     chúng tôi tic nhân bn bng PCR vào vector pGEM-T và gii trình t c 212 bp i vi  Sn phc gn vi vector pGEM-c bin np vào t bào kh bin E. coli  ch LB có 50-t X-gal và cht cm    37 o C, các khun lc xanh và khun lc trng xut hin. Các khun lc màu trng theo lý thuyt là cha vector tái t hp.  h     pGEM- -T.  t              ,      .              pUC19Fw và             . T các khun lc, mt s khun lc trc chn ngu nhiên  nuôi trong ng LB lng, chun b c tinh sch plasmid   hàng gen). Kt qu so sánh trình t n gen cho thn gen t vector tái t hp pGEM-T ca b bnh nhân  ng 99,53% so vi  trên GenBank . (C) nucleotide (A)                        CCCCCTCTACCCCCTCTA. Tuy nhiên, trình t n gen ca bi m ch  ng 95,3% so vi             trên GenBank, do m    -83 -  - chú  Lys     .   RRF là                   COII/tRNA Lys         3. Phân tích đột biến A3243A Nhân đoạn gen mang đột biến A3243G Nhm tìm hiu s liên quan gi t bin m n 9 bp vt bin A3243G ca hi chng n hành sàng lc s có mt ct bin này  72 bnh nhân mà chúng tôi chn t bin mt bin A8344G nêu trên. t bin thay th A thành G  v trí 3243 làm xut hin trình t nhn bit ca enzyme HaeIII           -  c nêu trong nghiên cu ca Trnh Lê Pp th. Cp mc hiu trên (MtFw và MtRv  bng 1) cha hai v trí nhn bit ca enzyme HaeIII và  mc thay bng 3149T còn  mc thay bng 3318A (so vi trình t gc). Vi cách thit k p mloi b hai trình t nhn bit ca HeaIII trong sn phm PCR. Vì vy, ch nhn DNA cht bin mi có v trí nhn bit ca enzyme HaeIII và b cn mn DNA không cht bin thì không có v trí nhn bit ca enzyme HaeIII nên không b ct và gi c ban u. Theo tính toán lý thuyt, PCR vi cp mi thit k chúng tôi nhân bn DNA t v n v c 198 bp. Chúng tôi s dng ch phm DNA tng s tách t mu máu ca các bnh nhân cho PCR. Kt qu n di sn phm PCR trên gel agarose 2% cho thy sn phm PCR t các mu DNA tng s tách t máu ca các bu cho m toán lý thuyn phm PCR ca mu không c DNA nào c. Phát hiện đột biến A3243G bằng PCR-RFLP Sau khi kim tra sn phn hành ct trc tip các sn phm PCR bng enzyme gii hn HaeIII, sn phm ca phn ng ct gii hn di trên gel polyacrylamide 15%. Theo lý thuyt, enzyme HaeIII cc 198 bp cht bin mn DNA không cht bin không b enzyme HaeIII ct và gi u 198 bp. Da vào ph c chúng ta có th kt lut bin hay không. i ch  c ct t DNA khuôn bnh nhân b t bi  nh trong nghiên cu Trp th sau khi ct bng Haeg DNA là 198     t bi   c nhóm nghiên cu gii trình t và kh nh t bin A3243G bng PCR-RFLP là hoàn toàn chính xác    y, di cht, t 72 mu bu tra, chúng tôi phát hin ra mng hp mt bnh nhân b t bin A3243G và bnh nhân này nm trong s 23 bt bin mu tra  t bin A thay th G  v trí 3243 nm trên gen mã hóa cho tRNA Leu(UUR) thuc hi chng não gi tai bin mch (MELAS). Bnh nhân này là mt tr nam 11 tui (Nguyi Hu-nh), có biu hin ri lon chuyn hóa ty th c ng acid lactic máu rt cao 9,2 mmol/L so vi nng là 1,0 - 1,78 mmol/L. Du hiu v thi chng MELAS: bnh nhân có biu hin b ng kinh co git nng, run tay phi, co git chân phi, hay b co git dn lit ni và hi phc cht v m n mt ý thc. Phát trin tinh thn vng chm, tay chân nhi cao và rt gy (tr là 18 kg, so vi bình ng là khong 25 kg). Kt qu chp cng t cho thy bnh nhân b viêm não, hình nh tm hai bên. Nhng t ph bin trong hi chng Melas vt bin A3243G, nhiu nghiên cng s mt ch góp phn cho nhng phá hy thn kinh trong hi chng Melas. Kim tra sau c thy kh ng Ca 2+ là 0,95 mmol/L gim so vi mc ng là 1,1-1,3 mmol/L, có th do nhiu ty th b hng làm gim kh  và  ng ion Ca 2+ trong máu bnh nhân. Bnh nhân này có th trng gy yu, mt mi, rt bing b t qu kip, tiêu hóa, -p, th lc không phát hic bit. Các ch u trong mc ng. Kt qu phát hin các virus EV, EBV, CMV, HSV1 cho kt qu âm tính. m tra s có mt ct binh nhân Nguyt qu n di sn phm PCR-RFLP cho thy sn phm PCR vi mu DNA khuôn ca b bnh nhân sau khi ct bng HaeIII ch cho mt kích c 198bp gin phc khi ct bng HaeIII. n phm PCR vi mu DNA khuôn ca bnh nhân, m và anh trai bnh nhân thì sau khi ct bng Haeu i cha vào thang chu t là 87 bp, 111 bp và 198 bp. Kt qu này chng t b bnh t bin A3243G, còn m bnh nhân, anh trai bnh nhân và bu mang t biu này mt ln nnh m ca bt bin A3243G cho con. S tn ti cu 198 bp  các sn phm ct ca mu bnh nhân, anh và m bc lý gii bng hi t bin A3243G chng thi bt bin và bt bin nên sn phm PCR có cha c t bit bin phm PCR-RFLP ca mu m, anh trai bnh nhân và bnh nhân v Thêm na, d sáng c sn phm ct ca bnh nhân, anh và m bnh nhân nh rng: t l sn phm PCR b ct bi enzyme HaeIII  m bnh nhân thi con rt nhiy t l ty th t bin A3243G/ty th t bin  m bnh nhân thi con. Nhnh này phn nào gic bnh nhân có biu hin ca hi chng MELAS rõ rt, còn m bnh nhân thì không có các biu hin bnh.      CCCCCTCTA      - 20,3 mmol/L. Axit lactic là mt hp cht h     c sn sinh t   ng phân (glycolysis). Hu h ch duy trì hong nh vào quá trình cung cng hiu khí. Tuy nhiên khi ty th b hng thì t bào s dng toàn phn hay mt phng t ngun oxy hóa glucose ym khí và sn sinh axit lactic khuch tán vào máu. t bin mn 9 bp không thuc vùng gen mã hóa cho mt RNA hay protein nào, nên không phi là nguyên nhân trc tip gây nên các ri lon ch. Các ri lo u hin bng v thn kinh và vng (không nêu   ca các bu tra rt có th n s có mt ct bin khác trong h gen ty th c phát hin thy trong nghiên cu ca chúng tôi. T l t bin mn 9 bng trong nghiên cu ca chúng tôi có th nói lên rng, có s liên quan nhnh gia mn 9 bp vi kh  t bin khác trong h gen ty th. References Tài liệu Tiếng Việt 1.     -Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học- -829. 2. L                 , Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ hai, Nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học-26/7/2003 -919. 3.          ,            -   Tạp chí Di truyền học và ứng dụng-9. 4.   ,             (2006),  , Báo cáo kết quả nghiên cứu đề mục, -04-25,  , Hà Ni, tr.10-20. 5. PCR và Real-time PCR, các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Chí Minh. [...]... mitochondrial genome – mutation screen”, Biochem Genet., 48, pp 157-163 Tài liệu từ trang web 44 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J01415.2 45 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=melas DiMauro S., Hirano M (2001) “MELAS”, GENE Reviews 46 https://notes.utk.edu/bio/bcmb421.nsf/f5b2cbf2a827c0198525624b00057d30/217c10a4bee dc0298525651300613209?OpenDocument 47 http://genome.wellcome.ac.uk/doc_WTD020876.html... Biochem J., 365, pp 451-459 26 Musumeci O., Andreu A L., Shanske S., Bresolin N., Comi G P., Rothstein R., Schon E A., and DiMauro S ( 2000), “Intragenic Inversion of mtDNA: A New Type of Pathogenic Mutation in a Patient with Mitochondrial Myopathy”, Am J Hum Genet., 66, pp 1900– 1904 27 Nelson D L., Cox M M (2009), Lehninger Principles of biochemistry, Worth publishers, Inc 28 Nogueira C., Nunes J.,... (1992), “Southeast Asian mitochondrial DNA analysis reveals genetic continuity of ancient Mogoloid migrations”, Genetics, 130, pp 139-152 9 Barrietos A., Casademont J., Solans A., Moral P., Cardellach F., Urbano-Márquez A., Estivill X and Nunes V (1995), “The 9-bp deletion in region V of mitochondrial DNA: evidence of mutation recurrence”, Hum Genet, 96, pp 225-228 10 Bouzisi M F., Schager H., Collombet... Laforet P., Jardel C., Godinot C., Lombes A (2001), “Functional characterization of novel mutations in the human cytochrome b gene”, Eur J Hum Genet., 9, pp 510-518 22 Liu C S., Cheng W L., Chen Y Y., Ma Y S., Pang C Y., and Wei Y H (2005), “High Prevalence of the COII/tRNALys Intergenic 9-bp deletion in Mitochondrial DNA of Taiwanese Patients with MELAS or MERRF Syndrome”, Ann NY Acad Sci., 1042, pp 82-87... COII–tRNALys Intergenic Region of Mitochondrial DNA in Indonesian Populations”, Hum Biol., 73, pp 205–223 16 Hertzberg M., Mickleson K N P., Serjeantson S W., Prior J F., and Trent R J (1989), “An Asian-specific 9-bp Deletion of Mitochondrial DNA Is Frequently Found in Polynesians”, Am J Hum Genet., 44, pp 504-510 17 Ida H., Rennert O M., Iwasawa K., Kobayashi M., Eto Y (1999), “Clinical and genetic studies... L., Ueda S., Saitou N., Stoking M (2002), “Extreme mtDNA homoleneity in continental Asia populations”, Am J Phys Anthropol., 118, pp 146-153 30 Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J K., Markowitz S D., Trush M A., Kinzer K W., Vogelstein B (1988), “Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours”, Nat Genet., 20, pp 291-293 31 Redd A J., Takezaki N., Sherry S T., McGarvey... point mutation: a neuropathological study”, Acta Neuropathol., 99, pp 31-38 39 Thomas M G., Cook C E., Miller K., Waring M J and Hagelberg E (1998), “Molecular instability in the COII±tRNALys intergenic region of the human mitochondrial genome: multiple origins of the 9-bp deletion and heteroplasmy for expanded repeats”, Phil Trans R Soc Lond., 353, pp 955-965 40 Watkings W S., Bamshad M., Dixon M E.,... “Clinical and genetic studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P mutation”, Hum Genet., 105, pp 120–126 18 Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A., Hors J and Charron D (1999), “Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population”, Eur J Immunogenet., 26, pp 417–422 19 Keightley J A., Anitori R., Burton M D., Quan F., Buist N R., Kennaway N... Keightley J A., Anitori R., Burton M D., Quan F., Buist N R., Kennaway N G (2000), “Mitochondrial encephalomyopathy and complex III deficiency associated with a stopcodon mutation in the cytochrome b gene”, Am J Hum Genet., 67, pp 1400-1410 20 Kolesnikova O A., Entelis N S., Mireau H., Fox T D., Martin R P., Tarassov I A (2000), “Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm”,... H., Van Oost B A., Smeets H J (1999), “A 4-base pair deletion in the mitochondrial cytochrome b gene associated with parkinsonism/ Melas overlap syndrome”, Ann Neurol., 45, pp 130133 13 DiMauro S., Hirano M., Kaufmann P., Tanji K., Sanno M., Shugu D C., Bonillia E., DeVivo D C (2002), “Clinical features and genetics of myoclonic epilepsy with ragged red fibers”, Adv Neurol., 89, pp 217-229 14 Du W D., .  c hi tài: Phát hiện một loại đột biến gen ty thể ở người Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-RFLP , p trung. c tic thí nghim tip theo. 2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP t bin