Phát hiện các dạng đột biến gen G6PD ở người Việt Nam bằng kỹ thuật sinh học phân tử

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Glucose - - phosphat dehydrogenase (G6PD hay G6PDH) enzyme oxy hóa khử, đóng vai trò then chốt q trình chuyển hóa glucose theo đường hexose monophosphat hồng cầu nhằm tạo chất khử vô quan trọng NADPH Enzym có vai trò tham gia vào q trình chống lại tác nhân oxy hóa, giúp bảo vệ màng hồng cầu bền vững, bảo vệ cấu trúc hemoglobin, cấu trúc enzyme có hồng cầu để trì sống cho tế bào hồng cầu Vì vậy, thiếu hụt enzyme này, gây nên bệnh thiếu máu tan máu Đây bệnh lý enzyme hồng cầu hay gặp người Trên giới khoảng 5% người mắc bệnh này, gặp nhiều Địa Trung Hải, Châu Phi Châu Á Tỉ lệ thiếu hụt G6PD dạng đột biến khác vùng địa lý dân tộc Tại Việt Nam, bệnh tương đối phổ biến, tỷ lệ dân tộc 0,5 -21% dân tộc phía Bắc[2]: khoảng 26% người Mường Ba Vì [17]; người Kinh Hà Nội 1,75% [5] khoảng 5,5% tỉnh phía Nam [14] Cơ sở di truyền học bệnh đột biến xảy gen mã hóa G6PD Gen nằm nhánh dài, vùng 2, băng nhiễm sắc thể giới tính X (Xq28) Khơng có alen tương ứng nhiễm sắc thể Y nên gặp nhiều nam, nữ thường người mang gen bệnh di truyền cho trai Ngy với phát triển vợt bậc công nghệ sinh học phân tử nghiên cứu Y học, sở gen học bệnh ngày sáng tá Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu phân tích sở di truyền học bệnh thiếu hụt G6PD, có 140 loại đột biến cơng bố tồn giới với nhiều dạng biến thể khác nhau[14] Hầu hết đột biến đột biến điểm dẫn đến thay đổi acid amin phân tử protein tạo enzyme G6PD Các nhà khoa học phân tích DNA người bệnh để xác định xác tổn thương gen gây bệnh thiếu me G6PD, kiểm soát bệnh tốt nhờ phát người phụ nữ mang gen bệnh tư vấn di truyền cho gia đình, tăng hiệu việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Nằm khu vực có tỉ lệ mắc bệnh thiếu hụt G6PD cao, Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ lệ mắc bệnh, dạng đột biến số nhóm dân tộc, địa lý…Tuy nhiên chưa có cơng trình nghiên cứu toàn diện đột biến gen G6PD người Việt Nam, tạo sở liệu để làm tiền đề cho việc xây dựng đồ gen bệnh nhân thiếu hụt men G6PD Việt Nam Do vậy, đề tài thực với hai mục tiêu: 1) Phát dạng đột biến gen G6PD người Việt Nam kỹ thuật sinh học phân tử 2) Bước đầu xây dựng đồ đột biến gen G6PD người Việt Nam Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những hiểu biết G6PD G6PD Warburg Christan phát năm 1931 hồng cầu ngựa, động vật, vi sinh vật, men bia hồng cầu người Năm 1936, G6PD nghiên cứu tiến hành chiết xuất làm phải 25 năm sau thành công Năm 1966, Yoshida lần tách triết G6PD từ hồng cầu người Từ thơng tin cấu trúc ban đầu, trọng lượng phân tử thông số động học G6PD dần thu thập Quá trình tách chiết enzym khỏi hồng cầu ngày đạt độ tinh cao Cùng với phát triển sinh học phân tử dạng đột biến G6PD ngày phát nhiều Các phương pháp phát thiếu hụt từ định lượng, định tính, bán định lượng, test nhanh ngày phát xác ngày áp dụng rộng rãi cộng đồng 1.1.1 Cấu trúc chế hoạt động G6PD G6PD enzym đa dạng, có cấu trúc bậc phức tạp , G6PD hồng cầu người có hai đặc tính tính khơng đồng tính chuyển dạng phân tử Cấu trúc dimer tetramer hay dimer monomer chuyển dạng lẫn in vitro, dường dạng monomer không xuất điều kiện sinh lý, có dimer tetramer hai dạng hoạt động enzyme, hồng cầu người dạng dimer chiếm ưu Cấu trúc enzyme bị ảnh hưởng pH môi trường: Ở môi trường pH thấp, enzyme tồn chủ yếu dạng tetramer; pH gần trung tính, enzyme tồn dạng dimer; mơi trường pH trung tính dimer tetramer có tỷ lệ Hình 1.1 Cấu trúc G6PD dạng monomer Một monomer gồm 515 acid amin, có trọng lượng phân tử khoảng 59.256 dalton [4], [5] Sự trùng hợp monomer thành dimer dạng cao (tetramer…) có hoạt tính xúc tác cần có mặt NADP + Như vậy, NADP+ gắn với enzyme vừa phức hợp cấu trúc, vừa chất phản ứng Mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP + : Tại vị trí gắn NADP+ xúc tác NADP+ gắn lỏng lẻo, dễ bị khử thành NADPH Tại vị trí gắn NADP+ chức NADP+ gắn chặt chẽ cần thiết để trì cấu trúc oligo hoạt động enzyme Có bốn acid amin liên quan đến vị trí gắn NADP+ cấu trúc là: Cys 385, Lys 386, Arg 387, Arg 393 Vị trí gắn NADP + xúc tác Lys 47 Ngồi hai vị trí gắn NADP + acid amin 242-248 38 - 44 NADP+ không chất cho enzyme mà ổn định G6PD việc ngăn cản chuyển enzyme dạng dimer thành dạng monomer không hoạt động , , Km G6PD với NADP+ thấp, khoảng 2-4 µmol/l enzyme bị ức chế cạnh tranh NADPH Do đó, tỷ lệ NADPH/NADP + hồng cầu tự điều hoà tốc độ phản ứng enzyme 1.1.2 Vai trò G6PD chuyển hố hồng cầu G6PD thuộc loại enzyme oxy hóa khử, xúc tác cho phản ứng oxy hóa Glucose - - Phosphat thành - Phosphogluconolacton G6PD enzyme then chốt mở đầu điều khiển tốc độ đường hexose monophosphat (hay đuờng pentose phosphate) Hexose monophosphat đường oxy hoá glucose xảy mô song song với đường đường phân, song chiếm tỷ lệ thấp nhiều (7 - 10%) Con đường không cung cấp nhiều lượng cung cấp nhiều NADPH, đồng thời cung cấp Ribose - Phosphat sử dụng cho trình tổng hợp acid nucleic Ở hồng cầu người số mơ khác, thối hố glucose theo đường hexose monophosphat lại chiếm ưu Đặc biệt trước tác nhân oxy hố bất ngờ giáng hố glucose theo đường lại tăng lên gấp hai mươi đến ba mươi lần, chí cao Trong đường này, G6PD oxy hoá G - - P thành -Phosphogluconolacton, với Coenzyme NADP+, chất nhận hydro trở thành NADPH NADPH Coenzyme khử, cần cho phản ứng nhiều đường sinh tổng hợp khác liên quan mật thiết với chuỗi phản ứng để bảo vệ hồng cầu như: tái tạo glutathion dạng khử (GSH) từ glutathion dạng oxy hoá (GSSG), khử MetHb thành Hb Hồng cầu có chức vận chuyển oxy Do đó, cấu trúc hồng cầu thường xuyên có nguy bị oxy hố dễ nhạy cảm với q trình oxy hoá nên dễ dàng bị phá huỷ Đặc biệt hồng cầu thiếu đường tổng hợp NADPH khác nên khả sống sót hồng cầu truớc cơng kích tác nhân oxy hố từ môi trường phụ thuộc vào hiệu hoạt động đường Hexose monophosphat Hình 1.2: Vai trò G6PD hồng cầu NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với tham gia enzyme glutathion reductase GSH tạo thành ngăn cản trình peroxide cấu tử hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu trước công tác nhân oxy hố Ngồi ra, để bảo vệ hồng cầu có chế khác: q trình khử MetHb đồng thời diễn nhờ hệ thống enzyme methemoglobin reductase (MetHbR) mà cần coenzyme NADPH NADH Khi NADPH bị oxy hoá, GSSG bị khử thành GSH, NADPH chuyển thành NADP+ G6PD trở nên hoạt động, khử NADP+ thành NADPH Khi hồng cầu thiếu G6PD, đường hexose monophosphat bị ngừng trệ NADPH không tạo thành, dẫn đến GSH không đủ Kết việc bảo vệ hồng cầu không hiệu Đặc biệt, hồng cầu bị công tác nhân oxy hố, q trình oxy hố vốn xảy mạnh có nguy làm tăng q trình peroxid hố cấu tử GSH khơng đủ cho nhu cầu q trình chuyển hố, làm thay đổi chức màng hồng cầu hemoglobin bị biến tính Hemoglobin bị oxy hố thành hợp chất không bền HbH 2O2 với hàm lượng cao độc cho hồng cầu Kết cuối màng hồng cầu bị tổn thương hồng cầu bị vỡ Km G6PD với NADP+ thấp, enzyme bị ức chế cạnh tranh NADPH Vì tỉ lệ NADPH/NADP + hồng cầu tự điều hòa tốc độ phản ứng enzyme Trong thời kỳ trơ, tỉ lệ cao G6PD gần bị ức chế hoàn toàn 1.2 Bệnh thiếu hụt G6PD 1.2.1 Dịch tễ học 1.2.1.1 Trên giới Từ thời xa xưa người ta nhận thấy có bệnh cảnh liên quan đến thiếu hụt G6PD hồng cầu Đầu tiên từ nhà triết học Hy Lạp nhà tốn học Pythagoras cảnh báo với học trò mối nguy hiểm ăn đậu fava Tiếp sau có nhóm nhà y học miền nam Italia Sardinia phác hoạ hình ảnh lâm sàng favism (tan máu xảy số người sau ăn đậu fava) Vào khoảng năm 1950, Ernest Beutler đưa nhận xét tan máu xảy sau dùng thuốc mà điển hình primaquine, thuốc chống sốt rét , Sau đó, 1956, Carson cộng khám phá người nhạy cảm với primaquine có hoạt độ enzyme G6PD hồng cầu thấp Cho đến có hiểu biết đáng kể enzyme G6PD hình thái lâm sàng sở sinh học phân tử liên quan đến thiếu hụt G6PD Mỗi biến thể dẫn đến mức độ thiếu hụt enzyme khác chúng liên quan đến mức độ nặng nhẹ tan máu lâm sang: thiếu máu tan máu mạn tính, thiếu máu tan máu cấp tính thứ phát sau dung thuốc, hồn tồn khơng có triệu chứng Năm 1996, tạp chí Blood, Ernest Beutler có viết: giới có khoảng 400 triệu người thiếu hụt G6PD, bệnh gặp tất dân tộc Tần suất thiếu hụt G6PD khác nhiều theo vùng dân cư vùng lãnh thổ, cao vùng Địa Trung Hải, châu Phi Nam Á - khu vực nằm vùng dịch tễ sốt rét Tỉ lệ thiếu hụt G6PD châu Phi 20%; châu Mỹ: cao người da đen (17 - 27%) ; Venezuela - 12%; người Do Thái tỉ lệ lên đến 70% Đông Nam châu Á, tỉ lệ dao động từ - 14% Ở Lào 7,2%; Thái Lan 11,5%; Indonesia 3,7%; Myanmar 4,4%; Taiwan Nam Trung Quốc - 16% Hình 1.3 Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD (1995) giới 1.2.1.2 Việt Nam Theo đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD Lucio Luzzatto (1995) Việt Nam nằm vùng có tỉ lệ dao động 0,3 - 9% Những nghiên cứu Việt Nam thiếu hụt G6PD phải kể đến tác giả như: Ngô Gia Thạch, Hoàng Văn Sơn Tỉ lệ thiếu hụt G6PD Việt Nam khác tùy vùng dân tộc Theo nghiên cứu tác giả Đoàn Hạnh Nhân cộng : thiếu G6PD có tỉ lệ cao số vùng sốt rét lưu hành Kim Bôi (34,1%); Mai Châu (20,4%); Như Xuân (19,7%); Mường La (17,8%) thấp số vùng khơng có sốt rét lưu hành Mèo Vạc (5,3%) Nga Sơn (0,5%) Theo nghiên cứu Trần Thị Chính, Nguyến Thị Ngọc Dao cộng sự, người kinh Hà Nội quanh Hà Nội 1,75% ; tỉnh phía Nam theo nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Phượng tỉ lệ thiếu hụt G6PD 5,5% 1.2.2 Biểu lâm sàng Khác với nguyên nhân gây thiếu máu tan máu khác, người bị thiếu hụt G6PD thường không biểu triệu chứng lâm sàng Chỉ tiếp xúc với tác nhân oxy hoá, triệu chứng lâm sàng thường thể chủ yếu tan máu Tuỳ thuộc vào loại đột biến mà hoạt độ G6PD người bệnh khác nhau, với tính chất tác nhân oxi hóa bệnh di truyền đồng thời khác mà triệu chứng lâm sàng khác Biểu hay gặp thiếu hụt G6PD thiếu máu tan máu mạn tính Tuy nhiên, trẻ em biểu phổ biến quan trọng lại vàng da sơ sinh Thiếu máu tan máu mạn tính khơng có hồng cầu hình cầu biểu gặp bệnh 1.2.2.1 Vàng da sơ sinh Vàng da sơ sinh triệu chứng nhiều nguyên nhân khác nhau, máu có gia tăng chất bilirubin, sản phẩm dị hoá hemoglobin Mức độ vàng da phụ thuộc vào mức độ tan máu Vàng da sơ sinh có hai loại sinh lý bệnh lý Vàng da sinh lý thường diễn ba ngày đầu kết thúc tối đa 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ Vàng da bệnh lý xuất nồng độ bilirubin máu cao 20mg/dl Hậu nghiêm trọng bệnh lý vàng nhân não , , Trẻ sơ sinh có biểu tăng trương lực cơ, xoắn văn, phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái dễ tử vong Nếu trẻ qua khỏi để lại di chứng nặng nề rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngôn ngữ…) bất thường thính lực, thị giác thiểu sản phát triển Vàng da nhân não ảnh hưởng đến khả phát triển tinh thần vận động trẻ Thiếu G6PD yếu tố nguy dẫn đến vàng da bệnh lý Do 10 việc phát thiếu hụt G6PD giúp cho trình phát triệu chứng nặng giúp cho trình theo dõi tốt tránh bỏ sót đáng tiếc 1.2.2.2 Thiếu máu tan máu cấp tính Ernet Beutler phát tượng tan máu lần sau nghiên cứu số bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét Primaquin Sau qua nghiên cứu người ta khám phá không Pnimaquin mà sau sử dụng số thuốc khác gây nên tượng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau), Procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (thuốc diệt khuẩn) Triệu chứng tan máu dẫn đến vàng da thường xảy vào ngày thứ 2,3 sau dùng thuốc Ngồi tượng tan máu biết đến sau bệnh nhân sử dụng số loại thức ăn có tính oxi hóa cao long não, rượu vang đỏ, sản phẩm từ đậu tương, đậu nành đặc biệt loại đậu Fava dẫn đến hội chương Favism Hội chứng Favism: bệnh lý thiếu máu tan máu biết đến từ thời Pythagoras Người ta nhận thấy sau ăn đậu Fava, số người 24 sau xuất hiện tượng tan máu có dội Sau nhiều nghiên cứu cho thấy tình trạng liên quan đến thiếu hụt G6PD Đa số trường hợp xảy cá thể thiếu G6PD nặng đơi thấy người có thiếu hụt nhẹ Tuy nhiên có trường hợp thiếu mà khơng có bệnh sinh lý sau ăn đậu Fava Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây tượng tan máu glucosidevicine dividine Aglycone chúng thay prymidine đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát bệnh nhân thường thấy Hemoglobin niệu vài ngày Bệnh nhân có thiếu máu cấp: da xanh, niêm mạc nhợt, nhịp tim nhanh, gan, lách to Trường hợp nặng suy tim, suy thận 1.2.2.3 Thiếu máu tan máu mạn tính hồng cầu khơng hình cầu 47 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Beutler, E., Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective Blood, 2008 111(1): p 16-24 Verle, P., et al., Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in northern Vietnam Trop Med Int Health, 2000 5(3): p 203-6 Matsuoka, H., et al., Seven different glucose-6-phosphate dehydrogenase variants including a new variant distributed in Lam Dong Province in southern Vietnam Acta Med Okayama, 2007 61(4): p 213-9 Hirono, A and S Miwa, Human G6PD: Structure and function of narmal and variant enzyme Haematologia, 1993 25(2): p 85-97 Luzzatto, L., G6PD deficiency: the metabolic basic of inherited disease 1989 M, K., et al., Structure studies of glucose-6-phosphatdehydrogensae and NADP+ binding to human glucose-6-phosphatdehydrogenase Acta Crystallogr, 2005 61(495-504) Hirono, A., Identification off the binding domain for NADP + of human G6PD by sequence analysis of mutants Proc Natinal, Academic science USA, 1989 86(10015-10017) SW, A., et al., Human glucose-6-phosphatdehydrogenase: the crystal structure reveals a structural NADP+ molecule and provides insights into enzyme deficiency Structure, 2000 8: p 293-303 Beutler, E., G6PD Creighton, T.E., ed The encyclopedia of molecular medicine New York John Wiley and sons, 2002: p 1449-1451 10 Beutler, E., G6PD deficiency Blood 1994 84(3613-3636) 11 Beutler, E., G6PD: Population genetics and clinical manifestations Blood 1996 10: p 45-52 12 Iwai, K and A Hirono, Distribution of G6PD mutations in Southeast Asia Hurn Genet, 2001 108: p 445-449 13 Nhân, Đ.H., Điều tra thiếu men G6PD hồng cầu số dân tộc sống vùng sốt rét lưu hành miền Bắc Việt Nam Báo cáo khoa học Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc, 1999 NXB khoa học kỹ thuật: p 203-209 14 Trần Thị Chính, et al., Phát thiếu hụt G6PD phân tích dạng đột biến số trường hợp thuộc dân tộc Kinh, Mường, Raclei Tày Hà Nội, Hòa Bình, Khánh Hòa Tạp chí nghiên cứu y học 2003 23(3): p 99-104 15 Phượng, N.T.N and cs, Tầm soát thiếu hụt G6PD trẻ sơ sinh bệnh viện Từ Dũ từ 15/3/2002 đến 15/4/2002 Hội nghị sàng lọc sơ sinh toàn quốc 2002, 2002 16 DJ, J and M DC, Oxidative stress, glucose-6-phosphatdehydrogenase and the red cell Adv Exp Med Biol, 2001 500(595-605) 17 Segel, G.B., Enzyme defects 2000, Nelson texbook of pediatric 18 M, K., et al., Acute hemolysis and severe neonatal hyperbilirubinemia in glucose-6-phosphatdehydrogenase deficiency heterozygotes J Pediatric, 2001 139: p 137-140 19 JW, H., J FG, and M MF, Glucose-6-phosphatdehydrogenase Guadalajara-a case of chronic non-spherocytic haemolytic anaemia responding to splenectomy and the role of splenectomy in this disorder Haematology, 2004 9: p 307-309 20 S, V., et al., Chronic non-spherocytic hemolytic anemia due to glucose-6phosphate dehydrogenase deficiency: report of two families with novel mutations causing G6PD Bangkok and G6PD Bangkok Noi Ann Haematol, 2011 90(769-775) 21 Hirono, A., Molecular analysis of eight biochemically unique G6PD variants found in Japan Blood, 1997 89(12): p 4624-4627 22 H, M and E B, Low G6PD enzyme activity level at the time of hemolysis in a male neonate with the African type of deficiency Blood cells, Molecules and Diseases, 2001 27: p 918-923 23 Tantular, I.S and F Kawamoto, An improved, simple screening method for detection of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency Trop Med Int Health, 2003 8(6): p 569-74 24 Jalloh, A., et al., Rapid epidemiologic assessment of glucose-6phosphate dehydrogenase deficiency in malaria-endemic areas in Southeast Asia using a novel diagnostic kit Trop Med Int Health, 2004 9(5): p 615-23 25 E, T., R O, and E B, Short communication malecular characterization of a German variant of G6PD deficiency (G6PD Aachen Blood cells, Molecules and Diseases, 2000 26: p 101-104 26 V, T., E B, and L L, Variants of G6PD are due to missense mutations spread throughout the coding region of the gene Human mutation 2, 1993: p 159-167 27 NM, H., G6PD variants in three minority ethnic groups in Central and Northen Vietnam Trop Med Int Health, 2009 37(1): p 17-20 28 NT, H., et al., Common mutations in G6PD of Vietnamese-Kinh deficiency patients American Journal of biotechnology, 2013 12(12): p 1318-1325 29 NT, H., et al., The Viangchan G6PD mutation in Vietnamese-kinh Hum Genet, 2013 13(2): p 85-92 30 NT, H., et al., Glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PD) mutations and haemoglobinuria syndrome in Vietnamese population Malaria, 2009 8: p 152 31 Pan, M., et al., Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) gene mutations detection by improved high-resolution DNA melting assay Mol Biol Rep, 2013 40(4): p 3073-82 32 Văn, T.T., PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử 2010, Nhà xuất y học 33 M, H., et al., Two new variants of G6PD deficiency in Singapore Nepal Med Coll, 2010 12(3): p 137-141 34 CR, N., et al., Analysis of any point mutation in DNA The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic acid Res, 1989 17: p 25032516 35 C, L and N I, G6PD Viangchan (G871 A) is the most common G6PDdeficiency variant in the Cambodian population Hum Genet, 2005 50: p 448-452 36 I, N., S S, and N S, Glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PD) mutations in Thailand: G6PD Viangchan is the most common deficiency variant in the Thai population Human mutation 2, 2002 19: p 185 37 Lê Vũ Chương and L.T.N Dung, Đặc điểm dịch tễ học thiếu men glucose-6-phosphat dehydrogenase trẻ sơ sinh sinh tỉnh Ninh Thuận Tạp chí nghiên cứu y học, 2009 13(1): p 27-34 38 A, L., S TED, and K Kubba, Glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency among ethnic groups in Iraq Bull Org mond Santt, 1972 47: p 1-5 39 Nguyễn Minh Hùng, Tạ Thị Tĩnh, and H M, Đột biến gen glucose-6phosphat dehydrogenase (G6PD) ba nhóm dân tộc Mường, Tày, Thái Việt Nam Tạp chí nghiên cứu y học, 2012 12: p 12-15 40 D, C., et al., Three mutations analysis of glucose-6-phosph defi ciency in neonates in South-west China Pediatrics International, 2007 49: p 463-467 41 SD, C., et al., Detection of the most common G6PD gene mutations in Chinese using amplification refractory mutation system Human Heredity, 1999 49: p 133-138 42 DTY, C., et al., Molecular characterization of glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PD) deficiency in patients of Chinese descent and identification of new base substitution in the human G6PD gene Blood cells, Molecules and Diseases, 1993 81(8): p 2150-2154 43 O, A., et al., Glucose-6-phosphat dehydrogenase variants in Malaysian Malays Hum Mutation, 2003 21(1): p 101 44 AU, W.-Y., et al., Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in female Octogenarians, Nanogenarians, and Centenarians Journal of Gerontology, 2006 61A(10): p 1086-1089 45 K, Y.-L., Glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency in elderly Chinese women heterozygous for G6PD variants American Journal of medical genetic, 2004 129A: p 208-211 46 CR, N., et al., Amplification refraction mutation systems for prenatal diagnosis and carrier assessment in cystic fibrosis Lancet, 1989 2: p 1481-1489 47 JM, O., V NY, and W DJ, Rapid detection and prenatal diagnosis of beta-thalassemia: Studies in Indian and Crpriot population in the UK Lancet, 1990 2(834-837) 48 MO, J., Detection of mutation by the Amplification refractory mutation system (ARMS) Hum Genet, 1992 9: p 77-84 49 J, W., G V, and P L, Structure and function of glucose-6-phosphat dehydrogenase deficiency variants in Chinese population Hum Genet, 2006 119: p 463-487 50 DC, G., et al., A comparative study of ARMS - PCR and RFLP - PCR as method for rapid SNP identification Romanian Biotechnological Letters, 2009 14(6): p 4845-4850 51 DKB, C and S SS, PCR amplification of specìic alleles: Rapid detection of know mutations and polymorphisms Mutation Research, 1993 288: p 93-102 52 E, G., et al., A comparison of ARMS and DNA sequencing for muâttion analysis in clinical biosy samples Experimental and Clinical cancer reseacher, 2010 29: p 132 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARMS : Hệ thống khuếch đại đột biến bền với nhiệt (Amplification Refractory Mutation System) ASA : Khuếch đại alen đặc hiệu (Allele Specific Amplification) ASP : PCR đặc hiệu alen (Alelle Specific) CI : Chloroform Isoamyl DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotid triphosphate EDTA : Ethylen diamin tetraacetic acid HMR : Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (High Melting Resolution) MPTP : PCR using Multiplex Tandem forward Primer PASA : Khuếch đại PCR alen đặc hiệu (PCR Amplification of Specific alleles) PCI : Phenol Chloroform Isoamyl PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase chain reaction) SSCP : Single Strand Comformation Polymorphism Analysis TAE : Tris acetate EDTA TBE : Tris borate EDTA TE : Tris EDTA MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Những hiểu biết G6PD 1.1.1 Cấu trúc chế hoạt động G6PD 1.1.2 Vai trò G6PD chuyển hố hồng cầu 1.2 Bệnh thiếu hụt G6PD .7 1.2.1 Dịch tễ học 1.2.2 Biểu lâm sàng .9 1.2.3 Cận lâm sàng 11 1.2.4 Phân loại .11 1.2.5 Chẩn đoán 11 1.2.6 Điều trị phòng bệnh 12 1.2.7 Cơ sở di truyền học bệnh thiếu hụt G6PD .14 1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen G6PD 18 Hiện có nhiều phương pháp xác định đột biến gen G6PD Bao gồm: phân tích đường cong nóng chảy HRM (High Resolution Melt), Phương pháp MPTP (PCR using multiplex Tandem forward Primer), phân tích cấu trúc đa hình chuỗi đơn SSCP (Single - strand comformation polymorphism analysis), sử dụng enzyme cắt giới hạn, hệ thống khuếch đại đột biến bền với nhiệt ARMS (Amplification Refractory Mutation system), giải trình tự gen 18 1.3.1 Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy (HRM) 18 1.3.2 Phương pháp MPTP (PCR using multiplex Tandem forward Primer) 19 1.3.3 Phương pháp phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn SSCP (Single - strand comformation polymorphism analysis) 20 1.3.4 Phương pháp ARMS (Amplification Refractory Mutation System) 20 1.3.5 Giải trình tự gen 22 1.4 Một số nghiên cứu liên quan 27 1.4.1 Trên giới: 27 1.4.2 Tại Việt Nam 28 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 31 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn: 31 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: 31 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 31 2.2.1 Chuẩn bị thiết bị: .31 2.2.2 Hóa chất: 32 2.2.3 Thiết kế mồi: 34 Thiết kế mồi khâu đóng vai trò định thành công nghiên cứu Và mồi thiết kế theo nguyên tắc chung thiết kế mồi 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 34 2.3.1 Quá trình lấy mấu: 35 Bệnh nhân chẩn đoán thiếu men G6PD lấy mL máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng EDTA với hàm lượng 1,5 mg/mL Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối 35 2.3.2 Quy trình chiết tách ADN từ máu ngoại vi: 35 2.3.3 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: 36 2.3.4 Phương pháp phân tích kết .40 2.4 Đạo đức nghiên cứu 40 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 42 3.1.1 Đặc điểm giới tuổi 42 Giới .42 Nam .42 Nữ 42 Tổng số 42 Số lượng 42 Tỉ lệ (%) 42 Đột biến 42 Giới .42 Tổng số 42 Nam .42 Nữ 42 Tổng số 42 3.1.2 Đặc điểm mức độ thiếu hụt G6PD nhóm nghiên cứu 42 Mức độ thiếu hụt G6PD 43 Nặng 43 (