BÁO cáo THỰC tập NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật

BÁO CÁO THỰC TẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NHỮNG NỘI DUNG CHÍNH MỤC TIÊU CƠ SỞ LÍ THUYẾT VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN KẾT LUẬN MỤC TIÊU  Nuôi cấy tế bào động vật kĩ thuật ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Y, Sinh, Dược  Mục tiêu:  Làm quen với kĩ thuật nuôi cấy tế bào từ tuỷ xương chuột với thao tác thu nhận mô, phân lập, quan sát đánh giá tế bào  Biết dụng cụ, bước chuẩn bị cho nuôi cấy tế bào CƠ SỞ LÍ THUYẾT Ni cấy sơ cấp: q trình ni cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào ban đầu thường hỗn hợp dòng tế bào khác chứa dòng trội nhất, có tế bào quan tâm Trong thực tập tế bào nuôi cấy tế bào tuỷ xương chuột, tế bào quan tâm tế hình thoi, có tính bám Quy trình ni sơ cấp: • • • Bước 1: thu nhận mơ có chứa tế bào sống Bước 2: phẫu tích hay tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào Bước 3: nuôi cấy (passage 0) Nuôi cấy thứ cấp: việc nuôi cấy sau lần cấy chuyền để Passage PHƯƠNG PHÁP Phương pháp: Ngày 1: (4/10/2016) o Gói dụng cụ hấp khử trùng o Pha chế mơi trườngPBSo Làm quen với thiết bị phịng thí nghiệm Ngày 2: (7/10/2016) Chiếu tủ ( tủ an toàn cấp 2): Quy trình chiếu tủ: mặc áo blouse, đeo bao tay, trang Dùng khăn thấm cồn 70 lau túi dụng cụ hấp khử trùng, lau tủ an toàn cồn 70 Dùng tay kéo cửa tủ đến mức quy định Xếp dụng cụ vào tủ Kéo cửa tủ lại, bật nút UV, chiếu UV 30 phút VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Ngày 2: (7/10/2016) Thu nhận xương đùi tuỷ VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Đếm tế bào: ‾ Đếm lần ‾ Nếu ô đếm chênh lệch phải đếm buồng đếm khác ‾ Đếm tế bào đơn, chọn tế tròn sáng, đồng kích thước VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Ngày (11/10/2016) Thay môi trường cho tế bào tuỷ xương chuột: Lấy bình ni cấy khỏi tủ ni Chiếu tủ an toàn cấp Rửa lần PBS Cho mơi trường vào Chụp hình Chụp hình Hút bỏ môi trường cũ Ủ 37 độ C, 5% CO2 Ngày (14/10/2016) Cấy trải: mật độ tế bào phân bố không nên cần cấy trải để dàn tế bào trước nuôi cấy thư cấp Chiếu tủ an tồn cấp Hút vào Fancon Cho vào bình nuôi Cào bong lớp tế bào Huyền phù Cho môi trường vào Lấy bình ni cấy khỏi tủ ni Ly tâm Chụp hình Thu cặn tế bào Ủ 37 độ C, 5% CO2 Chụp hình KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Ngày 1: (4/10/2016) Cách gói dụng cụ để hấp khử trùng Cách pha chế dung dịch: để kiểm tra dung dịch tan hết hay chưa cách kiểm tra pH Nếu pH ổn định dung dịch tan hoàn toàn Lưu ý: với dung dịch mơi trường ni cấy khơng hấp mà lọc KẾT QUẢ BIỆN LUẬN •Ngày 2: (7/10/2016) •Xác định mật độ tế bào: •Kết đếm lần 1: 171 tế bào •Kết đếm lần 2: 182 tế bào •Kết đếm lần 3: 169 tế bào •a = (171+182+169)/3 = 172 tế bào •Mật độ tế bào: A = a/5x10^4x20 = 172/5x10^4x20 = 6,9.106 (tế bào/ml) 10 Thu nhận đoạn bóng • Cắt vị trí tiếp xúc ống dẫn trứng buồng trứng, tách rời phần khỏi thể mỡ • Thu nhận phần tử cung, buồng trứng ống dẫn trứng vào Eppendorf 1.5ml chứa dung dịch fertiMed =>Thu nhận đoạn bóng phần tử cung • Khâu vết mổ: => vết khâu sai, bị bung nên phải tiến hành khâu lại 26 Thu nhận trứng từ đoạn bóng • Rửa ống dẫn trứng buồng trứng lần PBS • Xác định đoạn bóng, xé màng ống dẫn trứng vị trí đoạn bóng, thu nhận cụm trứng 27 Kết Trứng Cụm trứng 28 Thu nhận trứng từ đoạn bóng Kết quả: • Thu nhận cụm trứng, nhiên bị trứng trình di chuyển đĩa => Giải quyết: Mượn trứng từ nhóm (trứng loại bỏ cumulus nhờ enzyme hyaluronidase) 29 Thu nhận tinh trùng • Quan sát , phân biệt thu nhận mào tinh ống dẫn tinh (cắt phần mào tinh tinh hoàn, cắt cho thu đoạn chứa đoạn gấp ngược) từ chuột mổ nhóm • Lăn đoạn ống dẫn tinh mào tinh thu giấy để loại mỡ • Dùng kẹp giữ chặt đầu đoạn gấp ngược, dùng kẹp đẩy phần tinh dịch dồn đoạn gấp ngược (đoạn gấp ngược phải căng phồng lên) • Dùng kim tiêm chọc thủng đoạn gấp ngược  KẾT QUẢ: thu giọt tinh dịch đầu kim tiêm, sau cho vào dung dịch swim-up 30 Thu nhận trứng từ đoạn bóng • Ủ dung dịch swim-up chứa tinh dịch tủ ấm 37ºC, 5% CO2 ,30 phút, đặt nghiêng 45 ã Hỳt khong 400àl dung dch gn b mt swim-up • Ly tâm 800rpm, phút • Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tinh trùng hũa vi 50àl dd FertiMed ã m v chun b tinh trựng 50àl dd FertiMed ã20àl nhum vi 20àl Trypan Blue quan sát KHV xác định mật độ, độ di ng, t l sng cht tinh trựng ã30àl pha loóng để đạt mật độ thụ tinh 1-2,5x106 tinh trùng/ml  Chuyển vào vi giọt thụ tinh 31 Kiểm tra mức độ sống chết độ di động tinh trùng • Nhuộm trypan blue (20ul) • pha loãng mẫu với Trypan blue (1:1) 32 Kết đếm tinh trùng: • Vì n xấp xỉ 10 => đếm hết 25 với n đếm 284 tinh trùng, Mật độ tinh trùng: 5.68x106 tinh trùng/ml • Tỷ lệ sống chết: N==100% tinh trùng sống (không bắt màu xanh Trypan Blue) - khơng có tinh trùng chết • Độ di động: 5.63% 33 Sau thụ tinh Trứng Tinh trùng thụ tinh bám xung quành mang zona trứnng Tinh trùng khơng thụ tinh 34 Giải thích kết • Độ di động: độ di động 5.63% thấp so với điều kiện thụ tinh 8090%  Do li tâm hai lần  ảnh hưởng độ di động  Nhuộm Trypan Blue huyền phù mạnh, lâu ảnh hưởng đến độ di động mẫu 20µl đem xem kính hiển vi  Thao tác chưa nhanh nhẹn, xác Nhiệt độ mơi trường bị thay đổi liên tục • Tỉ lệ sống chết: khơng có tinh trùng chết Do thu nhận từ lớp bề mặt swim-up => có tinh trùng sống Các thao thác sau khơng làm chết tinh trùng 35 Chuẩn bị tinh trùng để thụ tinh • Mật độ: 5.68x 106 tinh trùng/ml mà mật độ thích hợp thụ tinh 1-2.5x 106 tinh trùng/ml => pha loãng lần để mật độ xấp xỉ 2.5x106 tinh trùng/ml trước đem thụ tinh • Pha lỗng lần 30µl dung dịch chứa tinh trùng để đạt mật độ 30µl FertiMed huyền phù cho 40µl vào vi giọt thụ tinh 36 Thụ tinh • Trứng xin từ nhóm (trứng loại bỏ cumulus nhờ enzyme hyaluronidase) chuẩn bị vi giọt 10ul • Tiêm 40ul dung dịch chứa tinh trùng để đạt mật độ 2.5x106 tinh trùng/ml vào vi giọt • Chuyển thêm trứng thu từ nang chuột vào vi giọt Tổng cộng có trứng đem thu tinh • Cho đĩa ni chứa vi giọt vào tủ nuôi Nuôi Trứng thu nhận từ nuồng trứng chuột 37 Trứng thu Sau ni phơi Kết quả: • Trứng sau thụ tinh có tế bào chất khơng đồng • Không thấy xuất tiền nhân thể cực thứ hai • Tế chất trứng bị co cụm, không đồng trứng chết Thụ tinh không thành công Tế bào chất trứng Khoảng không hai màng 38 Sau ni phơi Biện luận: • Độ di động tinh trùng thấp (chỉ 5.6%)  hiệu thụ tinh • Điều kiện mơi trường đĩa thụ tinh nuôi phôi bị thay đổi liên tục Ảnh hưởng đến hiệu suất • Mật độ tinh trùng đĩa thụ tinh chết nhiều => Ảnh hưởng đến môi trường thụ tinh phát triển phôi • Thao tác chuyển trứng làm ảnh hưởng học đến trứng => Ảnh hưởng đến sức sống trứng 39 Chuột sau thực phẫu thuật Kết quả: • Vết mổ hở, không lành lặn  Sức khỏe chuột khơng bình thường sau thực thực tập • Biện luận Do thao tác khâu không kĩ thuật Khâu không thắt gúc lần Chuột thả chung nên bị đè bị chuột khác cắn => Bung chỉ, không giữ vết khâu 40 ... trước lần cấy chuyền Trong nuôi cấy sơ cấp, tế bào ban đầu thường hỗn hợp dòng tế bào khác chứa dòng trội nhất, có tế bào quan tâm Trong thực tập tế bào nuôi cấy tế bào tuỷ xương chuột, tế bào quan... mơi trường trước cấy trải 14 Tế bào bám dính hình thoi Tế bào bám dính hình trịn Cụm tế bào bám dính Hình chụp tế bào trước cấy trải • Hình chụp tế bào cho thấy có tế bào bám tế bào khơng bám •... sau thay môi trường thấy rõ tế bào bám hình thoi tế bào bám dính khác hình trịn, Tế bào bám dính hình thoi Tế bào bám dính hình trịn Cụm tế bào bám dính Hình chụp tế bào sau thay mơi trường 13