BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP Họ và tên: Trần Chí Linh, lớp: KH1394A1 – Sinh học, khóa 39 Giảng viên giảng dạy: PGS.TS Lâm Ngọc Phương Địa điểm thực tập: Phòng vi nhân giống, môn Sinh lý-Sinh hóa, khu II, Đại học Cần Thơ Thời gian thực tập: Từ 06/09/2015 đến 11/10/2015 I Mục đích – mục tiêu thực tập - Các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật pha chế môi trường - Kỹ thuật tạo mô sẹo, nhân chồi, tạo rễ, nuôi cấy túi phấn, đỉnh sinh trưởng II Nội dung và kỹ cần đạt được đợt thực tập II.1 Nội dung cần thực tập Pha môi trường nuôi cấy keo Nhân chồi, tạo rễ trạng nguyên, long, tử la lan, thủy trúc Gieo hạt lan, cam Vô mẫu kim phát tài Vô mẫu đỉnh sinh trưởng khóm, mía Nuôi cấy túi phấn phát hoa bắp, mai trắng, diên điển trắng đỏ Tạo hoàn chỉnh, trồng vườn ươm: tử la lan, cam, mã đề, long, cát tường II.2 Các kỹ thuật cần đạt được thời gian thực tập Các kỹ thuật phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật (chuẩn bị môi trường, nuôi cấy keo, dưỡng nhà lưới …) III Tiến hành thí nghiệm Phương pháp pha môi trường nuôi cấy Mục đích Giúp học viên nắm được phương pháp pha môi trường và khử trùng Nguyên lý Tùy theo đối tượng và mục đích nuôi cấy, để pha các loại môi trường đặc hoặc lỏng với thành phần và nồng độ các chất phù hợp Môi trường sử dụng thí nghiệm là môi trường MS (Murashige – Skoog), có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… tất cả các hóa chất đều phải hòa tan đều, không kết tủa Môi trường không rắn, không quá mềm để cấy mẫu vật dễ dàng Khử trùng môi trường nồi hấp khử trùng Dụng cụ và hóa chất a) Dụng cụ: Ống đong, đũa thủy tinh, phễu, keo Nước cất lần Giấy gián nhãn Bếp đun Cân điện tử b) Hóa chất: Môi trường MS Vitamin Vi lượng Fe-EDTA Các chất kích thích sinh trưởng (IAA, NAA, IBA, BA, 2,4-D,…) Đường aga Các bước tiến hành Xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất cần sử dụng Môi trường pha theo công thức sau: MS 100ml/l Nước dừa 100ml/l Vi lượng 10ml/l Fe-EDTA 10ml/l Vitamin (mỗi loại) 1ml/l Agar 6,5g Đường 30g Các chất điều hòa sinh trưởng bổ sung tùy theo loại nghiệm thức dùng để nhân chồi hay rễ Định mức nước cất đến thể tích cần pha, bổ sung saccharose, agar Đo pH (pH môi trường thường là 5,8) Đun sôi, khuấy đều Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Chia đều cho các keo (mỗi bình khoảng 40 ml) Đậy nấp keo lại Khử trùng ở nhiệt độ 119 – 1210C, áp suất 0,8 – 1,2 at Khảo sát ảnh hưởng BA lên tạo chồi Tử la lan, Trạng nguyên (TN), Thủy trúc Thanh long (TL) Môi trường BA sử dụng với nồng độ 0,2mg/ml cho kết nhân chồi trình bày bảng Bảng Kết nhân chồi loại nuôi cấy thí nghiệm Loại Tuần Số chồi Số Chiều dài chồi (cm) Tỷ lệ TB TB TB nhiễm 0,20 TN Thủy trúc TL 4 4 6 0 0 0 1 12 16 12 14 14 0 0 0,30 0,35 0,55 0,30 0,50 0,55 0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0 0 0 100 100 100 100 0,00 0 0,15 0,40 0,65 0 Tử la lan *Nhận xét: -Tử la lan tác động BA tuần phát triển chồi sang tuần số chồi tang lên gấp lần so với tuần 1, số chiều dài chồi tăng dần qua tuần, cụ thể từ tuần đến tuần tăng lên dài thêm 0,35cm -Trạng nguyên tương tự Tử la lan, số chồi, số chiều dài chồi tăng dần qua tuần Ở tuần 1, số chồi 4, số 4, chiều dài chồi trung bình 0,3 sang tuần số chồi, số lá, chiều dài chồi trung bình (tăng 1,5 lần), 14 (tăng 3,5 lần), 0,7 (tăng 2,3 lần) -Thủy trúc: trình thao tác chưa vững mẫu khử trùng từ môi trường tự nhiên vào tủ cấy đạt nên tất mẫu điều bị nhiễm chết tuần -Thanh long tạo chồi BA (0,2mg/ml) tương đối chậm tạo chồi tuần chiều dài trung bình chồi tăng lên cao tuần đạt 0,15 cm sang tuần đạt tới 0,65 cm (tăng 4,3 lần) Nhìn chung, mẫu thí nghiệm BA với nồng độ BA (0,2mg/ml) cho hiệu nhân chồi tốt với trạng nguyên với hệ số nhân trung bình chồi đoạn thân Hình Mẫu cấy Trạng nguyên sau tuần vào mẫu Khảo sát ảnh hưởng IAA lên tạo rễ Tử la lan, Trạng nguyên, Thanh long Nồng dộ IAA 0,2mg/ml cho kết tạo rễ bảng Bảng Kết tạo rễ loại nuôi cấy thí nghiệm Loại (cm) Tử la lan Trạng nguyên Thanh long Tuần Tỷ lệ nhiễm Chiều dài rễ dài 0 0,5 0,8 4 0 0 0 0 1,05 0 0 0,8 1,1 1,35 1,5 *Nhận xét: Nhìn chung, mẫu cấy vào keo không nhiễm qua tuần theo dõi phát triển bình thường chiều dài rễ phát triển đặng qua tuần Trong đó: -Tử la lan nuôi cấy môi trường MS bổ sung IAA hình thành rễ số rễ tạo nhiều Chiều dài rễ tăng qua tuần ( tuần đầu chiều dài rễ dài 0,5 cm sang tuần thứ 1,05 cm) Tỷ lệ mẫu nhiễm 0% ( mẫu nhiễm) -Mẫu cấy Trạng nguyên bị nhiễm hoàn toàn không cho thấy ảnh hưởng IAA lên tạo rễ nghiệm thức Tỷ lệ mẫu nhiễm 100% ( mẫu không nhiễm ) -Thanh long mẫu phát triển tương đối tốt cho rễ rễ phát triển dài qua tuần ( tuần cho rễ dài 0,8 cm sang đến tuần rễ dài đạt 1,5 cm) Tỷ lệ mẫu nhiễm 75% ( mẫu nhiễm mẫu không nhiễm ) Trong thí nghiệm này, phát triển Thanh long nhanh nhất, Thanh long thích ứng tốt môi trường Riêng mẫu Trạng nguyên có lẽ nồng độ IAA chưa đủ mạnh, môi trường nuôi cấy không thích hợp thời gian ngắn nên mẫu chưa thể tạo rễ sau tuần theo dõi Hình Rễ Thanh long sau tuần nuôi cấy Xác định giá thể thích hợp giai đoạn dưỡng Tử la lan, Mã đề, Cát tường, Cam, Thanh Long Trong nghiệm thức lần lược trồng vào loại giá thể khác nhằm khảo sát giá thể thích hợp cho loài Kết trình bày tronf bảng Bảng Chiều dài rễ, chiều cao ban đầu sau ba tuần dưỡng loại thí nghiệm Loại Giá thể Chiều dài rễ dài (cm) Tử la lan Sơ dừa Tro Trấu Sơ dừa + trấu Sơ dừa + tro + trấu Cát tường Sơ dừa Tro Trấu Sơ dừa + Trấu Sơ dừa + Tro +Trấu Thanh long Sơ dừa Tro Trấu Sơ dừa + Trấu Sơ dừa +Tro +Trấu Mã đề Sơ dừa Tro Trấu Sơ dừa + Trấu Sơ dừa + Tro + Trấu Cam Sơ dừa Tro Trấu Sơ dừa + Trấu Sơ dừa + Trấu + Tro 1,2 - 1,3 - 1,5 - 1,4 - 1,6 - 1,5 2-0 1,5 - 1,7 - 1,9 - 2-0 1,56 - 1,4 - 1,2 - 1,3 - 1,2 - 6.8-7 2,9-3,7 3,7-4,4 2,6-3 1,1-2,4 2,8 - 3,6 - 2,9 – 5,5 3,1 – 3,3 3,4 - Chiều cao (cm) 1,7 - 1,7 – 3,5 1,2 – 1,6 – 2,5 1,9 - 1,3 - 1,5 - 1,1 - 1-0 1,3 - 0,4 - – 1,5 1-2 1,1 – 1,3 0,3 - 1,7-2 2,5-3,2 1,9-2,6 1,5-2.8 1,2-2.97 0,3 - 1,1 - 2,2 – 3,4 2,1 - 1,9 - *Nhận xét: Các mẫu dưỡng giá thể khác tương đối phát triển tốt trừ mẫu Cát tường bị chết hoàn toàn, nguyên nhân mẫu trước dưỡng chưa xử lý agar dưỡng mẫu bị héo Riêng mẫu Tử la lan, Mã đề có tỷ lệ mẫu sống 100% mẫu cam bị chết giá thể sơ dừa + trấu + tro nên cho tỷ lệ mẫu sống 80% Ở Tử la lan rễ phát triển tốt môi trường sơ dừa rễ tang chiếu dài từ 1,3 cm lên cm, chiều cao phát triển tốt giá thể tro tăng 1,8 cm sau tuần Ở Thanh long ngược lại, phát triển rễ lại tốt giá thể tro tăng 2,44 cm, chiều cao tăng nhanh giá thể sơ dừa Mã đề cho phát triển rễ tốt giá thể tro tăng 0,8 cm chiều cao thân tăng 1,77 cm hỗn hợp tro + trấu + sơ dừa Ở cam hỗn hợp sơ dừa bị rễ tăng chiều cao, phát triển rễ tốt giá thể trấu thân giá thể tro sơ dừa + trấu Hình Các phát triển giá thể Hình Mã đề sau dưỡng Hình Tử la lan sau dưỡng Khảo sát ảnh hưởng IAA – BA đến nảy mầm hạt cam, Lan Lan sau khử tách làm đôi lấy phần nhiều hạt bên đem cấy môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l + BA 1mg/l Sau tuần mẫu chưa phát triển thời gian ngắn Hạt cam bóc vỏ lớp vỏ lụa, cho vào môi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l + BA 4mg/l cho tỷ lệ nảy mầm 75% với phát triển hạt nảy mầm trình bày bảng Bảng Sự phát triên hạt cam qua tuần nuôi cấy Tuần Chiều dài rễ (cm) TB Số chồi TB 3 1,65 2,1 2,8 3 *Nhận xét: Chiều cao (cm) TB 0,5 1,75 2,05 2,75 Trong tổng số 12 hạt cam vô mẫu có hạt không nảy mầm nguyên nhân lớp vỏ lụa hạt chưa lột hết làm cho hạt chưa thể tiếp xúc với môi trường Các hạt lại nảy mầm bình thường hạt mộc lên khoảng chồi Khảo sát tạo mô sẹo Kim phát tài tác động BA 0,2mg/l Thu mẫu Kim phát tài, để vòi nước chảy khoảng 20 phút sau lắc với xà phòng khoảng 15 phút để làm bụi cát, mẫu rửa lại với nước cất khoảng lần, đem mẫu vào tủ cấy khử trùng với Clorin B (10%) phút, lại rửa mẫu với nước cất từ đến lần Mẫu cắt thành miếng nhỏ ( 0,5 x 0,5 cm ) khứa nhẹ lên bề mặt mẫu cấy để kích thích mẫu sản sinh tế bào mới, cuối mẫu đưa vào môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA Theo dõi phát triển mẫu qua tuần nhận thấy mẫu bị úng không tạo sẹo Thực thao tác vào đỉnh sinh trưởng thực vật Khóm Mía Các mẫu Khóm Mía tách thành mắt riêng biệt khử trùng tương tự mẫu Kim phát tài Qua trình theo dõi mẫu đỉnh Khóm chết tuần mẫu đỉnh Mía phát triển bình thường sinh trưởng chậm Thực thao tác nuôi cấy túi phấn mẫu Mai trắng, Điên điển trắng, Điên điển đỏ, Bắp Các nụ hoa Mai trắng, Điên điển đỏ, Điên điển trắng phát hoa bắp khử trùng qui trình Sau đó, hạt phấn tách khỏi bao phấn cấy vào môi trường MS bổ sung IAA 0,2 mg/l Sau tuần cấy mẫu không nhiễm thời gian ngắn chưa đủ để mẫu phát sinh mô sẹo ( Callus) 10