BÀI 1: KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Kỹ thuật vô trùng: Vô trùng vòng thí nghiệm và box cấy: phòng và box cấy được vệ sinh thường xuyên. • Cá nhân: Cần rửa tay xà phòng trước khi vào phòng, đeo găng tay (trường hợp tiếp xúc HgCl2 thì cần phải đeo 2 găng, bên trong là găng nilon), đeo khẩu trang, áo blue cần được khử trùng trước, thay dép khi vào phòng. • Vệ sinh box cấy trước sử dụng: Bật box cấy. Sử dụng ethanol 96% để xịt và lau (sử dụng bông, lau 1 chiều) toàn bộ bề mặt trong của box cấy. Lau ít nhất 2 lần. Sau đó lau đèn UV bằng ethanol 96% (chú ý lau sạch đáy), đặt đèn trong box cấy (bên ngoài, hướng lên), phủ vải đen, bật đèn UV khoàng 3060 phút trước khi sử dụng buồng. BÀI 2: NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CÂY LAN KIM TUYẾN IN VITRO 1. Tiến hành Khử trùng buồng cấy và các dụng cụ. Tiệt trùng găng tay với ethanol 96. Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ. Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu cây con ra ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh). Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt. Dùng kẹp và dao cắt các đoạn thân mang lá thành từng đoạn 12 đốt. Tách và để riêng 1 bên sạch. Loại các lá úa vàng khi cắt. Mở bình môi trường cây và khử trùng miệng bình cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Tiệt trùng kẹp. Dùng kẹp chuyển các đoạn thân cây đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát, khoảng 15mm thân dưới ngập dưới môi trường. Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy. Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (L)). Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ. Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ MÔN THỰC VẬT (Họ tên) (Mã sinh viên) BÁO CÁO THỰC TẬP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LỚP CAO HỌC 22 HÀ NỘI, 2018 BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN: NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Thời gian thực tập: 19/9/2018 Lớp: Cao học 22 Nơi thực tập: Phòng ni cấy mơ, Bộ mơn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội BÀI 1: KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Kỹ thuật vơ trùng: - Vơ trùng vòng thí nghiệm box cấy: phòng box cấy vệ sinh thường xuyên Cá nhân: Cần rửa tay xà phòng trước vào phòng, đeo găng tay (trường hợp tiếp xúc HgCl2 cần phải đeo găng, bên găng nilon), đeo trang, áo blue cần khử trùng trước, thay dép vào phòng Vệ sinh box cấy trước sử dụng: Bật box cấy Sử dụng ethanol 96% để xịt lau (sử dụng bông, lau chiều) toàn bề mặt box cấy Lau lần Sau lau đèn UV ethanol 96% (chú ý lau đáy), đặt đèn box cấy (bên ngoài, hướng lên), phủ vải đen, bật đèn UV khoàng 30-60 phút trước sử dụng buồng Sau sử dụng, vệ sinh lại box cấy tương tự Kiểm tra cồn đèn cồn, đổ đầy Bộ dụng cụ cấy: Thay dao Thêm cồn vào khay đựng dụng cụ, đốt ethanol Đốt đèn cồn Chuẩn bị ống cồn Sau thao tác, nhúng dụng cụ cấy vào ống cồn, đốt lửa đèn cồn Các ống/lọ/thớt cắt hơ lửa đèn cồn để khử trùng (có thể xịt ngồi lau với cồn trước) Bất phần tiếp xúc với da người/tay cầm/nền box cấy coi nhiễm bẩn Pha chế tiệt trùng môi trường cấy: + Công thức pha chế môi trường thực tế sử dụng: Công thức MS1 STT 10 11 Thành phần Stock đa lượng Stock vi lượng Stock Vitamin Stock Sắt Mio inositol Đường Thạch BAP 1mg/ml NAA 1mg/ml Kinetin 1mg/ml Nước cất vừa đủ pH Thể tích/khối lượng 200 ml 10 ml 10 ml ml 200 g 60 g 11 g ml 0,2 ml ml 2.000 ml 5,7 Cách thức pha chế: Cách thức pha chế: - Đong 200ml Stock đa lượng vào ống đong 1.000ml - Thêm 10ml Stock vi lượng 10ml Stock Vitamin, 4ml Stock Sắt (sử dụng ống đong 25ml) vào lượng 200ml Stock đa lượng ống đong 1.000ml - Cân Mio inositol cốc có mỏ, hòa tan nước cất (khoảng 100ml), khuấy, thêm vào ống đong 1.000 Sau tráng lại cốc lần, lần 50ml - Cân 60g đường cốc có mỏ dùng trên, hòa tan nước cất (khoảng 100ml), khuấy, thêm vào ống đong 1.000 Sau tráng lại cốc lần, lần 50ml - Dùng pipet hút BAP, NAA, Kinetin vào ống đong 1.000ml - Thêm nước cất đến vạch 1.000ml - Đổ toàn vào nồi, đun bếp hồng ngoại (đặt mức nhiệt 1500W) - Cân thạch vào cốc cỏ mỏ dùng trước Thêm 400ml nước cất vào cốc trên., khuấy - Đổ toàn vào bếp đun hồng ngoại, khuấy nhanh, mạnh, chiều - Rửa lại cốc lần, lần với 200ml nước cất để lấy hết thạch Mỗi lần rửa làm lại thao tác khuấy nhanh, mạnh, chiều - Rửa cốc vào nồi để đảm bảo lấy hết thạch - Sau hỗn hợp đồng (khoảng 60-70 độ), để cho nguội bớt (khoảng 50 độ), tiến hành đo pH (hiệu chỉnh HCl loãng, sử dụng máy đo pH hiệu chỉnh dung dịch 7pH7,0; 4,1; 10,8 trước đo) Chỉnh đến pH 5,7 - Đun nóng lại hỗn hợp, đổ vào lọ (độ cao khoảng 1-2cm), đóng nắp - Ghi nhãn: MS1, 19/9/2018 - Tiệt trùng nhiệt độ 121 độ C 15 phút (cài máy) - Cất bình mơi trường vào buồng ni mẫu (ngăn cùng) - Dọn, rửa dụng cụ BÀI 2: NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CÂY LAN KIM TUYẾN IN VITRO Tiến hành - Khử trùng buồng cấy dụng cụ - Tiệt trùng găng tay với ethanol 96 - Lấy bình ni cấy, tiệt trùng nắp cổ lọ Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng mẫu ngồi thớt cắt (chú ý khơng kẹp q mạnh) - Tiệt trùng lại kẹp dao trước cắt - Dùng kẹp dao cắt đoạn thân mang thành đoạn 1-2 đốt Tách để riêng bên Loại úa vàng cắt - Mở bình mơi trường khử trùng miệng bình cấy lửa đèn cồn - Tiệt trùng kẹp - Dùng kẹp chuyển đoạn thân cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khốt, khoảng 1-5mm thân ngập môi trường - Tiệt trùng lại nắp miệng bình cấy - Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (L)) - Tiệt trùng lại dụng cụ vệ sinh chỗ - Chụp ảnh đưa bình cấy vào buồng ni cấy Kết (ảnh) Hình 2.1 Tiến hành ni cấy mơ vào mơi trường MS1 (ảnh) Hình 2.2 Mẫu sau cấy – Ngày 19/9 (ảnh) Hình 2.3 Mẫu sau cấy vào ngày 21/9 Nhận xét: - Sau cấy mơ ngày có tượng bị nấm mốc (dạng nấm màu trắng, lốm đốm), bề mặt thạch - Nguyên nhân: Có thể khâu khử trùng chưa tốt, thao tác chưa quen tay nên chưa chuẩn Phần tay mặc áo ngắn, đeo găng tay khơng che hết được, nên q trình thao tác, vi khuẩn nấm, chí các vảy sừng da tay (phần áo không che kín khơng có găng tay) rơi vào thới (miếng nhôm) thao tác qua lại, di chuyển tay bên bề mặt => Khắc phục: + Cần chuẩn lại thao tác Phải tiệt trùng phần cánh tay có áo che lại tiến hành làm tủ cấy Thứ cần phải để tay khuỳnh ra, mở rộng ra, để khơng có vật di chuyển qua lại phía thớt cắt trình thao tác + Tiệt trùng áo blouse trước vào phong nuôi cấy, tiến hành khử trùng dụng cụ, găng tay cẩn thận, theo hướng dẫn BÀI 3: NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ Thao tác chuẩn bị: - Tại vườn thực vật, chọn mẫu tươi sạch, không bị dính bùn đất, sâu bệnh mẹ, cắt kéo cắt, chuyển đến phòng ni cấy mơ - Rửa qua mẫu nước Sau dùng kéo cắt đoạn khoảng 5cm, đoạn có nách lá, cắt (chỉ để lại 1cm cuống) - Rửa đoạn nước chảy phút - Cho mẫu vào dung dịch xà phòng lỗng, lắc tròn 10 phút - Rửa nước xà phòng nước chảy 10 phút - Rửa nước cất - Chuyển mẫu vào cốc cỏ mỏ, đưa vào box cấy - Vệ sinh box cấy, chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, cốc hứng nước thải - Ngâm ngập mẫu với ethanol 70o , đóng chặt nắp, lắc tay phút - Đổ cồn (sử dụng kẹp tiệt trùng để giữ mẫu không trôi) Tráng lại lượt nước cất (lắc tay 50 vòng) - Ngâm ngập mẫu với nước oxi già, thêm giọt Tween (để tăng khả thấm, tăng hiệu làm mẫu), đóng chặt nắp, lắc tay 10 phút - Rửa với nước cất lần (lắc tay 50 vòng) cho đỡ bọt - Ngâm ngập mẫu lần với nước oxi già, đóng chặt nắp, lắc tay 10 phút - Rửa với nước cất lần (lắc tay 50 vòng) - Chắt bình chữa mẫu trên, đóng nắp, ý khử trùng cổ nắp bình trước đóng nắp Thao tác cấy: - Tiệt trùng găng tay với ethanol 96 - Lấy bình ni cấy, tiệt trùng nắp cổ lọ Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng mẫu đoạn thân HTO thớt cắt (chú ý không kẹp mạnh) - Tiệt trùng lại kẹp dao trước cắt - Dùng kẹp dao cắt tỉa lại đoạn thân (chú ý phần dài khoảng 2cm, phần có chứa bẹ chìa khoảng 1cm, cắt ngắn phần cuống khoảng 5mm) Tách để riêng bên Loại đoạn cành úa vàng cắt Mỗi sinh viên làm 3-4 đoạn cành - Mở bình mơi trường khử trùng miệng bình cấy lửa đèn cồn - Tiệt trùng kẹp - Dùng kẹp chuyển đoạn cành cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khốt, khoảng 0,5-1cm cành ngập môi trường - Tiệt trùng lại nắp miệng bình cấy - Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (HTO)) - Tiệt trùng lại dụng cụ vệ sinh chỗ - Chụp ảnh đưa bình cấy vào buồng ni cấy - Vệ sinh tồn phòng thực tập (ảnh) Hình 3.1 Cắt thân Hà thủ ô thành đoạn mang mấu thân (ảnh) Hình 3.2 Tiến hành rửa sạch, vô trùng sơ mẫu (ảnh) Hình 3.3 Mẫu sau cấy – Ngày 19/9 Hằng ngày tiến hành theo dõi mẫu Mẫu bị nấm phải bị loại (ảnh) Hình 3.4 Các mẫu bảo quản phòng ni (ảnh) Hình 3.5 Mẫu sau cấy vào ngày 24/9/18 Nhận xét: - Sau cấy ngày cấy, xuất dấu hiệu nấm màu vàng, bắt đầu nấm từ phần thân mẫu, phát triển xung quanh chỗ cấy mẫu Lý nhiễm nấm rửa mẫu bên chưa đạt, thao tác tẩy với nước oxy già chưa (có thể lắc tay theo vòng tròn chưa tốt, thời gian lắc chưa đủ lâu), vi khuẩn vi nấm có mô bên mẫu chưa bị tiêu diệt hết Cũng dụng cụ tiếp xúc với mẫu (dao, kẹp, thớt cắt) bị dính khuẩn => Khắc phục: tiệt trùng mẫu lâu Hủy lọ bị nấm, ...BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN: NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Thời gian thực tập: 19/9/2018 Lớp: Cao học 22 Nơi thực tập: Phòng ni cấy mơ, Bộ mơn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội BÀI 1: KỸ... môi trường, ký hiệu mẫu (L)) - Tiệt trùng lại dụng cụ vệ sinh chỗ - Chụp ảnh đưa bình cấy vào buồng ni cấy Kết (ảnh) Hình 2.1 Tiến hành nuôi cấy mô vào môi trường MS1 (ảnh) Hình 2.2 Mẫu sau cấy. .. trước) Bất phần tiếp xúc với da người/tay cầm/nền box cấy coi nhiễm bẩn Pha chế tiệt trùng môi trường cấy: + Công thức pha chế môi trường thực tế sử dụng: Công thức MS1 STT 10 11 Thành phần Stock