báo cáo thực tập vi sinh lâm sàng

 Nắm được các công việc xét nghiệm trong khoa các loại XN, chủng loại XN, số lượng bệnh phẩm từng loại/ ngày và chung cả đợt  Một số căn nguyên vi sinh vật thường gặp  Quy trình một s

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Sinh viên thực tập: Nguyễn Văn Thành

Tổ 35 – Lớp Y4K

Hà Nội, Tháng 12 năm 2014

ĐẶT VẤN ĐỀ

Được sự phân công của bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Hà Nội, em đã vinh

dự được thực hành học phần Vi sinh lâm sàng năm 4 tại khoa xét nghiệm bệnh viện Nhiệt Đới Trung ương Sau 4 tuần thực hành (thời gian từ 17/11/2014 đến 12/12/2014) em đã được các cô, anh chị trong khoa xét nghiệm cung cấp cho em những kiến thức cơ bản về vi sinh lâm sàng Sau đây em xin trình bày báo cáo về những gì em đã học được tại khoa

MỤC TIÊU:

 Nắm được cách thức tổ chức quản lý một phòng XN vi sinh bệnh viện

 Nắm được các công việc xét nghiệm trong khoa (các loại XN, chủng loại

XN, số lượng bệnh phẩm từng loại/ ngày và chung cả đợt)

 Một số căn nguyên vi sinh vật thường gặp

 Quy trình một số XN thông thường trên vi sinh lâm sàng

 Tham gia 1 số công việc của phòng xét nghiệm, tự đánh giá khả năng của mình và chất lượng sau khi hoàn thiện công việc

 Viết báo cáo thu hoạch sau khi đi thực hành bệnh viện

PHƯƠNG PHÁP HOC TẬP

Kiến tập, thực tập tại khoa xét nghiệm bệnh viện Nhiệt Đới Trung Ương

Ths Nguyễn Thị Như

Hà KTV Nguyễn Thị Hà KTV.Vương khánh Hoan

CN Nguyễn Thị Hòa Ths.Ngô Mai Khanh KTV Phạm Đức Quý

BS Nguyễn Thị Xuân KTV.Nguyễn Hoàng Phương

CN Dương Thị Thu Thủy, KTV Nguyễn Thị Luyên

Phòng sinh học phân

tử

TS.Lê Văn Duyệt Ths.Nguyễn Thị Mỹ Hạnh

CN.Vũ Thị Liên

CN Vũ Thị Ngọc KTV.Phạm Thị Phượng ,

Ts Lê Thị Hội,

CN Vũ Ngọc Liên

CN Trần Thị Mai Hoa

Phòng Vi khuẩn- Lao- Môi trường- Hấp rửa

Ths Đào Tuyết Trinh, Ths Văn Đinh Tráng,

CN Trần Thị Vân Dung, Ktv Nguyễn Thị Hà, CN Nguyễn Thị Tho, Ths Nguyễn Thị Hằng, Ktv Lê Trung Toàn, Yc Đặng Hồng Yến, Yc Đoàn

Phó trưởng khoa 2:

Ths,bs Nguyễn Thanh Bình

 Khoa Xét nghiệm là khoa cận lâm sàng, có chức năng: Thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm về huyết học, sinh hóa, vi sinh, ký sinh trùng, sinh học phân

tử, miễn dịch phục vụ cho việc chẩn đoán, xác định nguyên nhân gây bệnh, theo dõi diễn tiến của bệnh nhân trong quá trình điều trị

 Khoa xét nghiệm hoạt động dưới sự lãnh đạo của trưởng khoa, người giám sát toàn bộ hoạt động của khoa cùng với một đội ngũ cán bộ có chuyên môn, với sự trợ giúp của phó trưởng khoa Khoa xét nghiệm đã bổ sung hai nhân viên Quản lý chất lượng(QLCL) Quản lý kỹ thuật(QLKT) có trách nhiệm đảm bảo mọi hoạt động của khoa

 Khoa xét nghiệm thực hiện nhiệm vụ trong Quy chế khoa cận lâm sàng do

Bộ Y tế ban hành Cán bộ, viên chức của khoa phải có đủ tiêu chuẩn về trình

độ chuyên môn, năng lực, phẩm chất của người cán bộ y tế

2 Trang thiết bị, dụng cụ, vật tư tiêu hao:

Khoa xét nghiệm đã xây dựng và duy trì các quy trình thích hợp cho việc lựa chọn,

sử dụng và bảo quản các thiết bị thuộc xét nghiệm bao gồm các dụng cụ, vật tư tiêu hao, hệ thống phân tích gồm cả phần cứng và phần mềm của máy vi tính

Phòng vi khuẩn Phòng ký sinh

trùng

Phòng miễn dịch

Phòng sinh học phân tử Trang

-dàn ELISA -Máy facscount -máy cobas

6000 -máy ly tâm, tủ lạnh, tủ âm sâu, máy lắc, nhiệt kế…

bốc vô trùng, máy PCR, -thiết bị điện di -RT PCR -tủ lạnh, tủ âm sâu

máy vortex, spindown -máy ly tâm

vô trùng, hộp nhựa vô trùng…), dụng cụ giữ chủng, chai cấý

máu,

-thùng đựng kim, ống lấy máu, pipet,…

-pipet, tip, tube, giá đựng mẫu, dụng cụ thủy tinh

-thang định danh nấm, KSĐ nấm

-hóa chất đếm CD4, dụng dịch đệm, dd rửa, hóa chất đối chứng,

-nước cất, cồn, buffer làm test

-nước cất, master mix, buffer, hóa chất PCR, Hóa chất điện di…

3 Chú ý về cách bố trí, sắp xếp:

- Khoa XN được bố trí ở tầng 5, tách biệt với khu khám bệnh, bệnh phòng

- Cửa ra vào: được lắp kính và có chốt/khóa an toàn

- Bố trí thiết bị: các thiết bị được đặt ở vị trí vững chắc, máy ly tâm nên đặt ở vị trí tách biệt tránh ảnh hưởng đến năng lực hoạt động của các thiết bị khác (cân, máy đọc…)

-Bố trí khu vực xét nghiệm: phòng SHPT có các khu vực riêng cho thao tác phân tách DNA, chạy máy luân nhiệt , điện di ;đảm bảo khu vực nhuộm, lấy mẫu BP luôn thông và thoáng gió; phòng ăn nghỉ tách biệt, điều hành tách biệt với khu xét nghiệm…

PHẦN B:

Công việc xét nghiệm của khoa

1 Tiếp nhận mẫu bệnh phẩm -Kiểm tra thông tin bệnh phẩm và phiếu yêu cầu xét nghiệm

-Ghi vào sổ nhận bệnh phẩm các thông tin về mẫu bệnh phẩm và các yêu cầu xét nghiệm

-Ghi ngày, giờ nhận nhận bệnh phẩm và kí giao nhận

2 Chuyển bệnh phẩm tới phòng xét nghiệm -Mẫu bệnh phẩm sẽ được chuyển kèm theo các phiếu yêu cầu tới phòng xét nghiệm

3 Soát xét các mẫu bệnh phẩm

- Cán bộ kỹ thuật kiểm tra lại các thông tin trên phiếu yêu cầu và số lượng, chất lượng các mẫu bệnh phẩm trước khi thực hiện xét nghiệm -Nếu phát hiện sai sót phải phản hồi lại cho cán bộ tiếp nhận hoặc người gửi mẫu dể giải quyết kịp thời

4.Xử lý bệnh phẩm

- Tiến hành xử lý các mẫu bệnh phẩm theo yêu cầu của từng loại bệnh phẩm (ly tâm,bảo quản, lưu trữ )

5 Tiến hành kỹ thuật xét nghiệm

- Tùy theo yêu cầu xét nghiệm phân công cán bộ thực hiện quy trình xét nghiệm theo đúng quy trình

6 Đọc kết quả

- Đọc và phiên giải kết quả theo các chỉ tiêu kỹ thuật

- Xác nhận kết quả, ký trước khi trình lãnh đạo khoa ký xác nhận

- Nếu kết quả bất thường hoặc có lỗi phải tiến hành lại xét nghiệm và

có thông báo lại lịch trả kết quả cho người gửi yêu cầu xét nghiệm

7.Xác nhận kết quả của lãnh đạo khoa

-Lãnh đạo khoa hoặc người được uỷ quyền xem xét và ký xác nhận kết quả

-Chuyển kết quả xét nghiệm tới bộ phận trả kết quả

8.Trả kết quả xét nghiệm -Sau khi được lãnh đạo khoa xác nhận, bộ phận trả kết quả tiến hành phân loại theo đơn vị gửi yêu cầu xét nghiệm

-Vào sổ trả kết quả

-Chuyển tới nơi yêu cầu xét nghiệm và giao nhận kết quả xét nghiệm

9 Tiếp thu phản hồi -Lãnh đạo khoa và các bộ phận chuyên môn sẽ tiếp thu các phản hồi từ phía yêu cầu xét nghiệm về cá kết quả xét nghiệm

10 Xử lý thông tin phản hồi -Lãnh đạo khoa và các bộ phận chuyên môn sẽ có ý kiến phản hồi về các kết quả xét nghiệm

-Lãnh đạo khoa xét nghiệm giao các bộ phận chuyên môn xem xét và

có hành động khắc phục các kết quả sai sót

Bảng tổng kết về công việc xét nghiệm của khoa:

2 Nuôi cấy, phân lập các VK từ máu

3 Nuôi cấy lao từ máu

4 Nuôi cấy, phân lập các VK từ đường

7 Nuôi cấy MGIT từ các loại BP

8 Nuôi cấy, phân lâp VK từ các BP khác

9 Định danh VK bằng kỹ thuật thông

12 Nghiên cứu các tác dụng ức chế, diệt

khuẩn của hóa chất, đông y

- Bệnh phòng lấy mẫu trong

ống vô trùng

- Nhân viên phòng xét ngiệm lấy máu tại giường

-Bệnh phòng lấy mẫu để trong ống vô trùng có nắp đậy

-Dựa vào chỉ định vủa BS, KTV lấy đúng vị trí

-Bệnh phòng lấy mẫu

-Bệnh phòng lấy mẫu

-Tùy loại bệnh phẩm

-Chủng thuần, phân lập từ bệnh nhân

-Bệnh phòng lấy mẫu để trong ống MTVC có nắp

-Đủ 3ml máu không chống đông

-2 ống chống đông EDTA, 2ml/ống

-Đủ 3ml máu không đông -Dịch não tủy, màng phổi, màng bụng, màng tim: 3-5ml (vô trùng, có nắp đậy)

-Dịch rửa phế quản, dịch khớp, đờm: tối thiểu 3ml (vô trùng, có nắp)

-4ml máu chống đông

-2-3ml dịch não tủy

10 PCR-EV và EV 71

11 PCR cúm A,B và subtype A

12 Định type HCV

-Bệnh phẩm dịch họng, hầu họng (lấy ở bệnh phòng)

-Bp lấy mẫu -Bp lấy mẫu -Lấy máu tĩnh mạch 2ml máu chống đông EDTA

-Bệnh phẩm cấy nấm dương tính

Phòng

miễn

dịch

1 HIV 3 phương pháp, HbsAg, A-HBs,

Hbe/Hbe, HBc total/HBc IgM,

A-HAV/A-HAV IgM, A-HCV, Rubella

định lượng, giang mai

2 VNNB, EV-71, HIV test nhanh,

Leptospira IgM, Dengue, Chikungunia,

Rubella định tính, Rickttsia, sởi, EBV,

HEV, Sán lá gan lớn

3 CD4

-3ml máu không chống đông

-3ml máu không chống đông

-2ml máu chống đông bằng EDTA

Bảng tổng kết về số lượng bênh phẩm trong đợt thực tập:

Làm BK 9 94 319 Dịch khác 2 12 39

PHẦN C:

Quy trình của 1 số xét nghiệm thông thường trên vi sinh

lâm sàng

I Một số quy trình phân lập, xác định vi khuẩn gây bệnh:

1 Ria cấy vi khuẩn trên đĩa thạch:

 Cấy đếm:

- Mục đích: Định lượng số vi khuẩn có trong 1 đơn vị thể tích nhất định dựa vào

số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 thể tích bệnh phẩm nuôi cấy

- Kỹ thuật: Dùng ăng cấy chuẩn vô trùng (tức là thể tích mỗi lần lấy được từ ăng theo đúng nguyên tắc là ổn định) (VD: Nếu bệnh phẩm là nước tiểu giữa dòng ta dùng ăng cấy chuẩn 1μl Sau khi lấy được thể tích nước tiểu như mong muốn, ta ria cấy hình chữ thập, theo đường kính của đĩa thạch Sau đó, ta ria theo đường zíc zắc cắt hình chữ thập vừa ria, các đường cấy sát nhau và ria hết mặt thạch

Chú ý: - Trong quá trình ria cấy thì ta vừa ria vừa xoay ăng cấy để vi khuẩn được dàn đều ra môi trường

- Vì đây là kĩ thuật cấy đếm, có liên quan đến kết luận có nhiễm trùng tiết niệu hay không nên đòi hỏi thể tích bệnh phẩm cấy phải chính xác

Vì vậy thao tác tiến hành phải chuẩn

 Cấy phân vùng: Là kĩ thuật được áp dụng rộng rãi nhất, mục đích tạo khuẩn

lạc riêng rẽ, từ đó quan sát màu sắc, hình thái và có thể đánh giá 1 số tính chất sinh vật hóa học Bệnh phẩm là nước tiểu, dịch não tủy, mủ, …

- Dùng que cấy vô trùng, tạo vùng nguyên ủy, là vùng đầu tiên, diện tích ria cấy vào khoảng ¼ đĩa thạch

- Đổi mặt que cấy, ria tiếp vùng thứ 2, các đường cấy vùng 2 cắt 3, 4 đường cấy cuối của vùng nguyên ủy, diện tích ria cấy của vùng 2 khoảng 1/3 đĩa thạch

- Lấy que cấy mới ria cấy vùng thứ 3, các đường cấy của vùng thứ 3 cắt 3, 4 đường cấy cuối cùng của vùng thứ 2 Diện tích ria cấy của vùng 3 khoảng ¼ đĩa thach

- Nếu cấy 4 vùng thì đổi mặt que cấy, cấy tiếp vùng thứ 4 cho đến hết bề mặt thạch, các đường cấy của vùng thứ 4 cũng cắt 3, 4 đường cấy cuối của vùng thứ 3

 Chú ý:

- Các đường cấy càng sát nhau càng tốt

- Diện tích ria cấy của vùng 2 là lớn nhất vì thường khuẩn lạc mọc riêng

rẽ bắt đầu từ vùng thứ 2, đến vùng thứ 3, thứ 4 có những bệnh phẩm không bắt được khuẩn lạc riêng rẽ nữa

- Khi cấy hết vùng 1 chú ý đổi mặt que cấy hoặc đổi que cấy khác hoặc tiệt trùng que cấy rồi mới tiếp tục cấy tiếp Đây là yêu cầu bắt buộc và phải thực hiện đúng, vì thực hiện sai thì ý nghĩa của kĩ thuật là phân vùng

sẽ không được đảm bảo

2 Nhuộm Gram:

- Đánh số tiêu bản: Đánh số xét nghiệm vào đầu mờ của lam kính,sô thứ tự này trùng khớp với nhau trong giấy yêu cầu xét nghiệm, dụng cụ chứa bệnh phẩm và trên lam kính

- Lấy bệnh phẩm và dàn đồ phiến: dàn bệnh phẩm ra lam kính sạch, hình ô van, chiều dài 2cm và chiều rộng 1 cm

- Để khô tự nhiên

- Cố định bệnh phẩm: Hơ tiêu bản đã dàn đồ phiến trên ngọn lửa đèn cồn, 2 đến 3 lần cho nóng, mục đích cố định là giết chết vi sinh vật gây bệnh và chuẩn bị tốt cho bước nhuộm màu tiếp theo

- Phủ thuốc nhuộm tím geltian lên tiêu bản, để 30s

- Đổ đi, rửa nước

- Nhỏ lugol, rửa nước

- Tẩy màu bằng cồn tuyệt đối cho đến khi tiêu bản hết màu tím, thời gian khoảng 2, 3s

- Rửa nước

- Phủ thuốc nhuộm đỏ fuchsin lên tiêu bản, để 30s

- Đỏ đi, rửa nước

- Để khô, soi vật kính dầu

 Đánh giá tiêu bản nhuộm:

Tiêu bản đạt yêu cầu

- Mật độ vi khuẩn vừa phải, đều

- Vi khuẩn bắt màu đúng

- Tiêu bản không có cặn bẩn, sáng, dễ xem

2 Quy trình cấy phân:

2.1 Cách lấy bệnh phẩm:

-Lấy phân từ trực tràng: Dùng tăm bông vô trùng dã tẩm ướt bằng nước muối sinh

lý, xoay tăm bông lấy được một lượng phân nhỏ dính vào sau đó gửi ngay tới

phòng xét nghiệm vi sinh

-Lấy phân đã đi ra ra ngoài dụng cụ sạch: Dùng một chiếc bô sạch, khô, cho bệnh

nhân đi ra ngoài vào rồi dung tăm bông lấy phân ở những vùng có biểu hiện bệnh

lý, sau cho vào ống nghiệm vô trùng gửi tới phòng xét nghiệm

-Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán,giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy phân

2.2 Quy trình:

2.3 Một số vi khuẩn thường gặp:

-Trực khuẩn đường ruột: E.coli, salmonella, Shighella

-Vi khuẩn phẩy tả

Vi khuẩn di động, TCBS khuẩn lạc nhỏ, trong,vàng

Dương tính

Nhuộm soi tìm bạch cầu, tính di động,vi

khuẩn

Macconkey, 37ºC, 24h

Dựa vào màu sắc hình dạng khuẩn lạc→ bắt khuẩn lạc nghi ngờ

Xđ tính chất sinh vật hóa hóc, định danh

KSĐ+ thạch thường, lưu giữ chủng

- Thông báo ngay cho nhân viên trực cấy máu trong ngày, phải lấy máu trong vòng 15 phút sau khi có giấy xét nghiệm tới;

- Lấy máu để cấy

+Đảm bảo nguyên tắc vô trùng

+Đảm bảo đúng thể tích (máu:canh thang=1:10)

- Ghi tên, tuổi, khoa phòng, số giường, chẩn đoán, mã bệnh phẩm, ngày cấy vào sổ cấy máu

- Quét mã vạch, cho chai máu vào đúng vị trí máy đã báo

3.3 Quy trình cấy máu:

4 Quy trình xác định, phân lập từ bệnh phẩm đờm:

4.1 Kỹ thuật lấy đờm:

Buổi sáng: sau khi Bn đã vệ sinh răng miệng, khạc đờm vào cốc vô trùng, đưa về phòng Đối với trẻ em, do không khạc được, nên lấy chất hút từ dạ dày bằng ống nhựa mềm (Chú ý: nên nhuộm và cấy ngay vào môi trường

thích hợp, chậm nhất là 3h Nếu lâu hơn thì phải có môi trường bảo quản)

Thạch máu Uri select

Trực khuẩn gram âm Cầu khuẩn gram dương

xếp đám

- đặt opt

- chạy giá đường strep

xếp chuỗi

- Đông huyết tương Bình báo dương

Nhuộm soi

Thạch thường

Catalase Đặt opt

Thạch mềm Uri

Cấy: thạch máu và soco(37ºC, 5% CO2)

nhuộm soi: tìm bạch cầu và vi khuẩn

Kháng sinh đồ + Thạch thường bệnh phẩm đã

được xử lý

- Đảm bảo vô trùng

- Lấy đủ số lượng

- Điền đầy đủ thông tin vào ống đựng bệnh phẩm

- Cần gửi sớm đến phòng xét nghiệm vi sinà

5.2 Quy trình kỹ thuật:

Bệnh phẩm

Nhuộm soi: tìm bạch cầu, vi khuẩn

Thạch máu, soco(37ºC,24h)

Hình dạng khuẩn lạc, tính chất tan máu→chọn khuẩn lạc nghi ngờ Nhuộm soi

Cầu khuẩn gram dương trực khuẩn gram âm cầu trực khuẩn

gram âm

xếp

chuỗi

xếp đám

Oxidase Uri select Thạch mềm Vitek2

KSĐ+ Thạch thường + lưu và giư chủng

Thạch soco+Test

X,V

5.3 Một số vi khuẩn thường gặp:

-K.pneumonia -S.Suis

lý, rồi hút dịch bỏ vào ống nghiệm mang về phòng xét nghiệm

+ Ổ mủ hở: dùng tăm bông vô trùng quệt, xoay tròn một vòng Lấy xong cho vào ống nghiệm vô trùng mang đến phòng xét nghiệm

- Ghi tên, tuổi, phòng, chẩn đoán, giờ nhận bệnh phẩm vào sổ cấy mủ

6.2 Các vi khuẩn thường gặp

-S.aureus -P.Aeroginosa -Streptococcus -A.Baumanii -Vi khuẩn đường ruột: E.coli… -Lậu cầu 6.3 Quy trình nuôi cấy:

- Thạch máu+ soco(37ºC,5% CO2,

24h) Hình dạng khuẩn lạc,

tính chất tan máu→ bắt

c Tiến hành kĩ thuật

 Pha huyền dịch vi khuẩn

- Pha huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý trực tiếp từ các khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên mặt thạch nuôi cấy đã ủ 18 đến 24 giờ Điều chỉnh huyền dịch

vi khuẩn đạt độ đục chuẩn McFaland 0.5 bằng máy đo độ đục

 Trải huyền dịch vi khuẩn trên mặt thạch

- Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que tăm bông

vô khuẩn vào huyền dịch rồi ép và xoay nhẹ que tăm bông lên thành ống nghiệm Động tác này sẽ bớt được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que tăm bông

Nhuộm soi

Xác định tính chất sinh vật hóa học Định danh, kháng sinh

đồ

- Ria vi khuẩn từ que tăm bông lên mặt thạch Mueller- Hinton đã để tủ ấm trước

đó 30 phút bằng máy tự tạo: Đặt ngửa đĩa thạch vào vị trí để đĩa trên máy, đặt tăm bông từ tâm đĩa thạch, bật máy, kéo từ từ tăm bông từ tâm ra ngoài rìa đĩa thạch, vừa kéo vừa xoay đều tăm bông

- Tuỳ theo chủng vi khuẩn làm kháng sinh đồ, chọn bộ kháng sinh thích hợp để đặt lên mặt thạch Khi đặt phải ép nhẹ mỗi khoanh giấy để đảm bảo chúng tiếp xúc

với mặt thạch

- Trong 15 phút sau khi đặt khoanh giấy kháng sinh phải để sấp hộp thạch trong

tủ ấm 35ºC

► Chú ý: Không ủ hộp thạch ở khí trường quá 5% CO2.(thay đổi pH MT)

7.2 Kĩ thuật làm kháng sinh đồ xác định MIC bằng E- test

a Bệnh phẩm

- Chủng vi khuẩn tươi đã được định danh, nuôi cấy qua đêm (18-24 giờ)

b Nguyên lý

- Kháng sinh tẩm trong thanh E- test sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch

và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Do nồng độ kháng sinh giảm dần từ đầu đến cuối thanh E- test nên vùng càng xa phía đầu thanh E- test khả năng ức chế

vi khuẩn cũng giảm Tới một vị trí nào đó trên thanh E- test mà nồng độ kháng sinh quá thấp không thể ức chế vi khuẩn thì đó chính là MIC

c Quy trình tiến hành

 Pha huyền dịch vi khuẩn

- Pha huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý trực tiếp từ các khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên mặt thạch nuôi cấy đã ủ 18 đến 24 giờ Điều chỉnh huyền dịch

vi khuẩn đạt độ đục chuẩn McFaland 0.5 bằng máy đo độ đục