BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

Sản xuất rượu nho dựa trên cơ sở về hoá sinh xảy ra trong quá trình lên men nước quả nho dưới tác dụng của enzyme nấm men Saccharomyces cerevisiae.. Trong nước nho có chứa glucose, fruc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP

MSSV: B1203178 LỚP: VI SINH VẬT K38

Cần Thơ, Tháng 4/2014

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH ii

DANH SÁCH BẢNG ii

BÀI 1: LÊN MEN RƯỢU NHO 1

I GIỚI THIỆU 1

II PHƯƠNG TIỆN 1

III PHƯƠNG PHÁP 2

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2

1 Kết quả: 3

2 Thảo luận: 4

V KẾT LUẬN 6

BÀI 2: SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN 7

I GIỚI THIỆU 7

II PHƯƠNG TIỆN 7

III PHƯƠNG PHÁP 8

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

1 Kết quả: 8

2 Thảo luận: 9

V KẾT LUẬN 9

BÀI 3: SẢN XUẤT BÀO TỬ MỐC TƯƠNG 11

I GIỚI THIỆU 11

II PHƯƠNG TIỆN 12

III PHƯƠNG PHÁP 12

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

1 Kết quả: 13

2 Thảo luận: 14

V KẾT LUẬN 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Rượu vang đỏ 1

Hình 2: Khuẩn lạc S cerevisiae 7

Hình 3: Tế bào S cerevisiae 7

Hình 4: Aspergillus oryzae phát triển 11

Hình 5: Aspergillus oryzae 12

Hình 7: Mặt trước túi nilon nuôi cấy 13

Hình 6: Mặt sau túi nilon nuôi cấy 13

DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Sự thay đổi pH qua các giai đoạn 3

Bảng 2: Sự thay đổi độ Brix qua các giai đoạn 3

Bảng 3: Sự lên men của nấm men 3

Bảng 4: Nồng độ rượu sau lên men 4

Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan 4

Bảng 6: Sinh khối nấm men sau lên men thu được 9

1

Bài 1:

LÊN MEN RƯỢU NHO

I GIỚI THIỆU

Rượu nho (tên gọi khác là rượu vang hay

rượu chát) là một loại thức uống có cồn được lên

men từ nước nho Rượu vang đỏ thường được lên

men từ nước ép và vỏ quả nho, còn rượu vang

trắng được lên men chỉ từ nước nho Đã xuất hiện

từ lâu trên thế giới Ở Việt Nam, nho được trồng

nhiều ở các tỉnh phía nam Miền trung như tỉnh

Ninh Thuận và rượu nho mang nhãn hiệu rượu

vang Đà Lạt, rượu vang Biên Hòa, rượu vang Hà

Nội… đã xuất hiện trên thị trường

Sản xuất rượu nho dựa trên cơ sở về hoá sinh

xảy ra trong quá trình lên men nước quả nho dưới

tác dụng của enzyme nấm men (Saccharomyces

cerevisiae) Hiện nay có hai phương pháp lên men

cơ bản: lên men tự nhiên và lên men nhờ vào chủng nấm men thuần khiết Khác với các loại thức uống lên men khác, rượu nho có thời gian lên men khá dài (vài tháng đến vài năm)

Phân loại:

Theo màu sắc: có vang đỏ và vang trắng

Theo lượng đường trong rượu: có vang chat và vang ngọt

Trong nước nho có chứa glucose, fructose (khoảng 40%), các chất pectin, các acid hữu cơ, các chất màu, hợp chất chứa nitơ (protein, acid amine), vitamin, muối khoáng,…Trong quá trình lên men, nấm men sử dụng lượng đường trong dịch quả để tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm (rượu, CO2, acid acetic, acid lactic, este…) Các chất pectin thuỷ phân kéo theo sự tạo thành một lượng nhỏ methanol

Nấm men Saccharomyces cerevisiae phổ biến trong quá trình lên men và chiếm 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men Đa số các tế bào hình ovan sinh sản theo lối nảy chồi và tạo bào tử Saccharomyces cerevisiae có khả

năng sinh enzyme invertase xúc tác phản ứng thuỷ phân saccharose thành glucose và fructose (tỉ lệ mol 1:1) Vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung đường saccharose với hàm lượng được tính toán để tạo độ Brix cần đạt, giúp quá trình lên men hiệu quả

II PHƯƠNG TIỆN

 Nho chính

Hình 1: Rượu vang đỏ

 Đường cát

 Nấm men khô Saccharomyces cerevisiae

 Bộ dụng cụ ép nước trái cây

 Bình tam giác 500 ml

 Waterlock

 Tủ ủ

 Máy li tâm

 Hệ thống chưng cất cồn

 Cồn kế

 pH kế

 Khúc xạ kế cầm tay (Brix kế)

III PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp nhằm xem xét khả năng lên men rượu của nấm men

Saccharomyces cerevisiae và khả năng lên men rượu tự nhiên, xem xét các yếu tố ảnh

hưởng tới quá trình lên men nhằm tạo ra điều kiện tối ưu cho việc lên men rượu nho

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Nho chính (khoảng 600g)

Bỏ cuốn, rửa sạch và nghiền

Chia ra 2 phần bằng nhau (khoảng 300g dịch và vỏ)

Bình tam giác 500ml (bình 1)

Bình tam giác 500ml (bình 2)

Saccharomyces

cerevisiae

Để yên, lên men 7 ngày, đếm bọt khí trên waterlock mỗi ngày 2 phút

Đo độ Brix và pH

Bổ sung lượng đường để đạt độ Brix yêu cầu

Chưng cất 100ml dịch lên men

Li tâm phần còn lại

Chưng cất 100ml dịch lên men

Li tâm phần còn lại

Đo độ rượu

Đo độ Brix; pH; Đánh giá cảm quan

Đo độ Brix; pH; Đánh giá cảm quan

Đo độ rượu

1 Kết quả:

Bảng 1: Sự thay đổi pH qua các giai đoạn

0

3,81

4,06

0

3,96

4,12

0

3,91

4,06

Bảng 2: Sự thay đổi độ Brix qua các giai đoạn

Bảng 3: Sự lên men của nấm men

Nhóm Độ Brix

ban đầu

Nấm men (%)

Số bọt khí sinh ra trong 2 phút Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7

0,1 30 16 8 4 3 1 0

Bảng 4: Nồng độ rượu sau lên men

C)

Bảng 5: Kết quả đánh giá cảm quan

ban đầu

Nấm men (%)

Độ trong

và màu sắc

chất lượng

2 Thảo luận:

Cơ chế lên men rượu:

Rượu được tạo ra chủ yếu nhờ các tế bào nấm men phân giải glucose thông qua con đường EM (Embden-Meyerhoff) Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp Đầu tiên, đường thẩm thấu vào tế bào nấm men Ở đó, đường được chuyển hóa qua hàng loạt sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic dưới tác

dụng của enzym Pyruvat-decacboxylase sẽ bi mất CO2 và tạo thành Acetaldehit Enzym này có coenzym là Thiaminpyrophosphat và cần có ion Mg++ làm chất hoạt hóa Sau đó, acetaldehit bị khử thành cồn etylic và CO2 do enzym Acoldehdrogenase xúc tác

Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu

C6H12O6 Lên men 2C2H5OH + 2CO2 + 113,4 KJ

Về nhiệt độ:

Nấm men hoạt động tốt nhất ở 20-300C, dưới 160C lên men rất chậm, trên 350

C các hệ enzym trong cơ thể nấm men bị giảm hoạt lực đến mức tối thiểu, hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ Nếu nhiệt độ trên 400C nấm men do không tổng hợp được năng lượng dự trữ cần thiết nên sẽ chết Trong thực nghiệm ta lên men ở nhiệt độ phòng không quá 300C thuộc trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho lên men

Về độ pH:

Nhìn chung, nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH = 2 - 8, nhưng thích hợp nhất là từ 4 - 4,5 Mặt khác, vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn Vì vậy trong lên men rượu để ngăn ngừa hiện tượng nhiễm khuẩn, người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 - 4,0 Độ pH còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng, nấm men, thành phần của môi trường lên men, điều kiện lên men Thực tế pH đo được

từ dịch nước nho của ba nhóm trình bày ở bảng 1 giao động cao nhất là 3,96 và thấp nhất là 3,81 thuộc trong khoảng pH giới hạn Độ pH phụ thuộc vào chủng loại nho nguyên liệu dùng để lên men, góp phần vào hương vị của từng loại rượu nho bên cạnh chủng loại nấm men được dùng

Về nồng độ đường trong dịch lên men:

Ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men Saccharomyces cerevisiae có

khả năng sinh enzyme invertase xúc tác phản ứng thuỷ phân saccharose thành glucose

và fructose (tỉ lệ mol 1:1) Vì thế nấm men có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng phù hợp từ 22 - 250 Brix Trong giới hạn này, nếu nồng độ đường cao, rượu càng mạnh do hàm lượng etylic cao, nên thêm đường vào dịch lên men là biện pháp phổ biến nâng cao độ cồn Tuy nhiên việc bổ sung vượt quá lượng trong khoảng phù hợp sẽ dẫn đến hiện tượng co nguyên sinh ở tế bào nấm men, làm giảm khả năng lên men, hiệu suất không cao Lưu ý trong khi tính toán độ Brix bằng Brix kế ta cần phải tính lượng đường hoà tan vào đúng lượng dung dịch nước nho và trừ ra phần vỏ không hoà tan đường, vì nếu không trừ phần vỏ ra thì độ Brix sẽ vượt khỏi độ Brix tính toán (quá trình lên men rượu vang đỏ)

Công thức tính lượng đường bổ sung :

Trong đó:

Tổng lượng đường cần bổ sung là:

x

x a b





 100 100

md x 10 (kg)

(md: Khối lượng dịch quả ban đầu)

Bảng 2 cho thấy chủng nấm men sử dụng lượng đường hiệu quả nhất với độ Brix

27 của nhóm 2 (có và không bổ sung nấm men); Với độ Brix 32 ở nhóm 3 ở bình không bổ sung nấm men, dựa vào bảng 3 thì quá trình lên men diễn ra khá chậm đến ngày 3 mới xuất hiện bọt khí đếm được trong 2 phút và đến ngày thứ 7 vẫn còn tiếp tục lên men ở hai bình, trong khi bình có bổ sung nấm men ở nhóm 1 và 2 sinh bọt khí rất ít không đếm được bọt khí nào trong 2 phút, dấu hiệu lên men yếu dần

Về thời gian lên men:

Phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhiệt độ, nồng độ đường, chủng nấm men Trong bài thực hành thì do khoảng thời gian giới hạn nên chỉ lên men 7 ngày, hiệu suất chưa thật

sự cao so với khoảng trung bình từ 15 – 20 ngày Để tăng giá trị cảm quan cần trữ rượu 3 tháng trở lên

Về nồng độ rượu etylic:

Lượng rượu tạo ra là hỗn hợp không thuần khiết etylic, có thể có methanol, ester, aldehyde,… như chủ yếu là rượu etylic an toàn cho người sử dụng Bảng 4 nồng độ rượu cao nhất là bình lên men tự nhiên ở nhóm 2 với độ rượu cao nhất là 12,21 ở 200C Nhìn chung việc bổ sung nấm men ở 3 nhóm giúp tăng hiệu suất lên men, tăng nồng

độ rượu cho thành phẩm Việc nồng độ rượu tăng trong quá trình lên men cũng làm ức chế nấm men hoạt động, khi độ rượu đạt 7 - 8% thể tích, sự trao đổi chất trong nấm men bị ngừng trệ hầu như toàn phần, quá trình lên men chuyển sang thời kỳ lên men thầm lặng

Về đánh giá cảm quan:

Dựa vào bảng 5 nhìn chung tất cả các thành phẩm rượu đều đạt các tiêu chí về độ trong, màu, mùi, vị, ý thích Nhưng nếu được lên men thời gian dài hơn thì thành phẩm

sẽ ngon hơn

V KẾT LUẬN

Trong quá trình lên men rượu nho cần chú ý đặc biệt đến các yếu tố ảnh hưởng đến suốt quá trình lên men và đến nấm men Lên men trong khoảng nhiệt độ 20 –

300C, khoảng pH thích hợp từ 3,8 – 4,0, độ Brix từ 22 - 250 Brix, và khoảng thời gian

đủ dài để tạo hương vị tốt cho thành phẩm, cần chú ý đến nồng độ cồn thành phẩm đối với việc lên men với số lượng lớn thương mại

Bài 2:

SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN

I GIỚI THIỆU

Nấm men là loài nấm đơn bào, thường sinh sôi nẩy nở bằng cách nảy chồi, với một số ít loài thường được sử dụng để lên men bánh mì hay sản xuất đồ uống có cồn

Phần lớn các loài nấm men thuộc về ngành Ascomycota, mặc dù một số loài thuộc về ngành Basidiomycota Chúng phân bố rộng trong tự nhiên, từ xa xưa con người đã biết

sử dụng nấm men để sản xuất thực phẩm lên men Hàm lượng protein trong tế bào rất cao từ 40 – 50% trọng lượng khô, chất lượng protein cao, có đầy đủ các acid amine thành phần và đặc biệt là các acid amine không thay thế có giá trị dinh dưỡng cao, thành phần vitamin, khoáng, glucid, lipid…nên nấm men được sử dụng trong việc sản xuất protein đạm đơn bào Tuy nhiên vẫn có nhiều loài gây hại cho người và động vật, làm hỏng thực phẩm

Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực

phẩm như làm bánh mì, sản xuất rượu bia cồn thương mại Saccharomyces được sản

xuất với quy mô lớn trên thế giới, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng qua màng tế bào trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hòa tan, các hợp chất nitơ (các acid amin, peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng trong môi trường… Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hóa các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và lên men của nấm men được tiến hành Quá trình nuôi tăng sinh khối nấm men

Saccharomyce cần phải cung cấp lượng khí cần thiết trong quá trình nuôi tăng sinh

khối

II PHƯƠNG TIỆN

Hình 2: Khuẩn lạc S cerevisiae Hình 3: Tế bào S cerevisiae

 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

 Dung dịch đường mía 10%

 (NH4)2SO4 0,1%, KH2PO4 0,1%

 Bình tam giác 250ml

 Tủ ủ

 Máy li tâm

 pH kế

 Đĩa petri

III PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp xem xét khả năng phát triển, các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng

của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với nghiệm thức 2 lần lặp lại Thu

hoạch sinh khối, so sánh số liệu thu được

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Kết quả:

Dung dịch đường mía 10% KH2PO4 0,1%

(NH4)2SO4 0,1%

Bình tam giác (2)

1ml men giống

Bình tam giác (1)

Khử trùng 115o

C,

15 phút 1ml men giống

Chuyển vào tủ ủ có chế độ lắc

Li tâm 5000 vòng/ phút, 250C, 10 phút

Sấy 1050

C, 48h

Cân, tính kết quả Bình 1

Cân, tính kết quả Bình 1

Kết quả số liệu sinh khối nấm men được thống kê trong bảng sau:

Bảng 6: Sinh khối nấm men sau lên men thu được

1

A: 0,9473 B: 0,6994

2

A: 0,7241 B: 0,6862

3

A: 0,6096 B: 0,6030

2 Thảo luận:

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được coi là vi sinh vật sống hiếu khí tuỳ

nghi Trong quá trình nuôi tăng sinh khối cần cung cấp nhiều oxy để quá trình sinh sản diễn ra mạnh mẽ hơn, vì vậy lượng sinh khối tăng lên nhanh và trở thành sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men Ngược lại, trong điều kiện thiếu hoặc không có mặt

O2, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí, khi đó sản phẩm trong môi trường là etanol sẽ trở thành chủ yếu Tuy nhiên, hai kiểu hô hấp trên đều có mối quan hệ chung với nguồn đường có trong môi trường Qua thực tế sản xuất rượu vang cho thấy: lượng đường tiêu hao cho hô hấp hiếu khí chiếm khoảng 1/5, tiêu hao cho hô hấp kỵ khí là 4/5 (thực chất là lên men để tạo etanol)

Đường mía cung cấp ngoài lượng sucrose chính còn có nhiều khoáng vi lượng cần thiết cho nấm men phát triển Ngoài ra còn bổ sung lượng (NH4)2SO4 0,1%,

KH2PO4 0,1% vào môi trường dung dịch đường mía 10% nhằm cung cấp nguồn nitơ

và photpho vô cơ cho nấm men Trong môi trường nuôi cấy cần chú ý nguyên tố đa lượng khác Ngoài ra các yếu tố ảnh hưởng đến chủng như nhiệt độ, pH, nồng độ đường cũng đã trình bày ở bài 1

Kết quả sinh khối nấm men thu được cho thấy sinh khối nấm men thu được đều quanh mức 0,6 gram, cá biệt bình A của nhóm 1 lên đến 0,9473 gram Xét thấy nấm men phát triển tăng sinh khối khá đồng đều giữa các bình trong đều kiện nuôi cấy giống nhau Trường hợp bình nuôi cấy A của nhóm 1 và bình nuôi cấy A của nhóm 2 khối lượng sinh khối thu được cao hơn các bình con lại, có thể là do một phần sự tăng sinh trong môi trường tối ưu hơn, nấm men có sức sống cao hoặc một phần do sai sót thao tác lấy men giống, chuẩn bị môi trường, sai sót trong quá trình chuyển sinh khối li tâm

V KẾT LUẬN

Để thu được sinh khối nấm men cao cần cung cấp đầy đủ oxy, chất dinh dưỡng, điều kiện cần thiết, hạn chế quá trình lên men kỵ khí Ngoài ra chủng men giống phải

có sức sống tốt, tăng trưởng nhanh Cần tìm hiểu thêm về các điều kiện tối ưu, quy trình nuôi cấy liên tục ở quy mô thương mại

Bài 3:

SẢN XUẤT BÀO TỬ MỐC TƯƠNG

(Aspergillus oryzae)

I GIỚI THIỆU

Aspergillus oryzae là một loại nấm

vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp

Ascomycetes (nang khuẩn) Cơ thể sinh

trưởng của chủng là một hệ sợi bao gồm

những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7

µm, phân nhánh rất nhiều và có vách

ngang, chia sợi thành nhiều bao tế bào

Sinh sản vô tính Đính bào tử của Asp

oryzae có màu vàng lục hay màu vàng

hoa cau

Nấm mốc Aspergillus oryzae giàu

các enzyme thuỷ phân nội bào và ngoại

invertase,…phân giải tinh bột thành đường, protein thành acid amine, phân giải

sucrose thành glucose và fructose Asp oryzae được ứng dụng trong sản xuất nước

tương bằng phương pháp vi sinh vật và là tác nhân lên men chủ yếu Chủng được sử dụng chủ yếu trong ẩm thực truyền thống của Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản để lên men đậu nành

Aspergillus oryzae, khuẩn lạc trên môi trường Czapek (nhiệt độ nuôi cấy 270C,

10 ngày tuổi) có đường kính 5 – 6 cm, màu lục, vàng lục, lục nâu sau chuyển thành nâu lục, nâu Khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia toả tròn, phần lớn 150 – 300 đến 400 – 500 m đường kính Giá bào tử trần nhẵn hoặc ráp, thường dài 1,0 – 2,5 cm, có thể tới 4 – 5 cm Bọng đỉnh giá hình gần cầu, đường kính 40 – 50m, hoặc mang cuống thể bình và thể bình hoặc chỉ mang thể bình Cuống thể bình 4 – 5 x 8 – 12 m Thể bình mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá 3 – 5 x 12 – 15 m, thể bình mọc trên cuống thể bình 3,0 – 3,5 x 8 – 10m Bào tử trần phần lớn hình cầu, đôi khi hình elip có đường kính 4,5 –7,0 m hoặc 8-10 m trục lớn, nhẵn hoặc ráp, có gai mịn

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%, độ ẩm môi trường tối

ưu cho sự hình thành enzyme: 55 – 58%, độ ẩm không khí: 85 – 95%, pH môi trường: 5,5 – 6,5 Chúng hiện diện dễ thấy ở các kho nguyên liệu, trong các dụng cụ chứa bột, gạo…đã hết nhưng chưa được rửa sạch, ở bã bia, bã rượu, bã sắn,… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng, xanh,… Màu do các bào tử già

có màu sắc Các bào tử này dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới Có rất nhiều ứng dụng Aspergillus oryzae để sản xuất ra các loại enzyme trên môi trường lên men bán rắn hay lên men chìm Tuy nhiên,

Aspergillus oryzae sẽ sinh ra nhiều enzyme hơn trong lên men bán rắn

Hình 4: Aspergillus oryzae phát triển