báo cáo thực hành vi sinh

 Hút 0.1ml mẫu ở mỗi nồng độ nhỏ lên bề mặt môi trường nuôi cấy trong các đĩa petri..  Chọn 3 nồng độ pha loãng cuối, mỗi nồng độ hút 1ml mẫu dịch pha loãng cấy vào mỗi ống nghiệm tron

2 Môi trường- hóa chất:

Nước muối sinh lý 0,9% Mẫu nước thải Nước cất vô trùng Cồn 960

 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường cao thịt – peptone:

Thêm nước cất đủ 200ml Lắc đều, điều chỉnh pH=7,0±0,2 Nấu sôi nhẹ, phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng ở 1210C trong 30 phút

 Môi trường nuôi cấy nấm men:

Môi trường Hasen:

Glucose, maltose (hoặc đường kính):10g

MgSO4.7H2O: 0,4-1g Agar: 4g Thêm nước cất đủ: 200ml

Lắc đều, điều chỉnh pH= 6,0±0,2 Nấu sôi nhẹ, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 1210C trong

30 phút

 Môi trường nuôi cấy nấm mốc:

Môi trường czapek:

Saccarose: 6g NaNO3: 6g

pH= 6,0±0,2 khử trùng 1atm/30 phút

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:

Môi trường Gause1:

Tinh bột tan: 4g K2HPO4: 0,1g MgSO4.7H2O: 0,1g KNO3: 0,2g

Agar: 4g Thêm nước cất đủ: 200ml pH= 7,2 ÷ 7,4 khử trùng 1atm/30 phút

 Môi trường nuôi cấy tảo:

Môi trường Tamiya:

K2HPO4: 0,25g FeSO4.7H2O : 0,006g

Thêm nước cất đủ: 200ml

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Chuẩn bị một loạt các ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lí vô trùng

 Hút 1ml mẫu nước ao, hồ, tiến hành pha loãng đến nồng độ 10-6

 Lấy 3 nồng độ pha loãng cuối cùng để cấy

 Hút 0.1ml mẫu ở mỗi nồng độ nhỏ lên bề mặt môi trường nuôi cấy trong các đĩa petri cấy ria 3 đĩa ở nồng độ 10-1 để phân lập

 Dùng que trang, trải đều mẫu lên khắp bề mặt thạch

 Để khô rồi lật úp đĩa lại, gói đem ủ Riêng những đĩa Petri nuôi cấy tảo thì đem ra ngoài sáng, không cần ủ

 Sau 3-5 ngày xem kết quả

Độ sáng,độ trong

Kính hiển vi quang học Phiến kính, lá kính

2 Môi trường-hóa chất:

Nước muối sinh lý 0,9%

Mẫu nước ao, hồ Nước cất vô trùng Cồn 960

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

Đặt lamelle sạch phủ lên khung đếm

Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch mẫu đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lamelle

Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lamelle, hơi thừa một ít Nếu bị giọt mắc lại trong lamelle thì phải làm lại

Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng kính x40 để đếm

Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm cạnh phía trên và cạnh bên phải ô

Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (trường hợp: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ)

Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (trường hợp: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)

Công thức tính:

Số tế bào/1 ml mẫu = (a x 4.000 x 1.000)/H a: Số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/4.000 mm3)

=11×4000 ×103=44×106 tế bào/1ml mẫu Một số loài tảo có trong nước

Sunyra Chrysosphaerella Gloeobotrys

Peranema Euglena Chaetoceros muelleri

Tảo Chlorella Tảo Oocystis Tảo Schroederia

Một số loài tảo tiêu biểu

BÀI 3 PHÂN LẬP VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM TRONG ĐẤT

2 Môi trường,hóa chất:

Nước muối sinh lý 0,9% Mẫu đất vườn Nước cất vô trùng Cồn 960

Môi trường phân lập Azotobacter

Môi trường asby:

Agar: 3-4g Thêm nước cất đủ 200ml Điều chỉnh pH = 7 Nấu sôi nhẹ cho tan agar Phân phối môi trường vào bình tam giác Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút , để ấm (50-600C) phân phối vào các đĩa petri

III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

Phân lập Azotobacter:

Cân 10g đất, cho vào một erlen 100ml đã có chứa sẵn 90ml nước muối sinh lý

vô trùng, lắc đều 20 phút cho đất tan đều

Dùng que cấy vòng lấy dung dịch từ erlen cấy ria lên trên bề mặt môi trường Asby chứa sẵn trong đĩa petri

Các đĩa petri được lật úp và ủ ở nhiệt độ 26-28 0C trong 2-3 ngày rồi xem kết quả

II KẾT QUẢ:

Độ sáng,độ trong

Màu sắc Bề mặt mép Vẽ hình

Lồi,có màng nhầy

Không đều

trong

Trắng trong

Lồi, có màng nhầy

Đều

trong

Có màng nhầy

BÀI 6.PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐCTRONG ĐẤT

 Môi trường nuôi cấy nấm men:

Môi trường Hasen:

Glucose, maltose (hoặc đường kính):10g

MgSO4.7H2O: 0,4-1g Agar: 4g Thêm nước cất đủ: 200ml

Lắc đều, điều chỉnh pH= 6,0±0,2 Nấu sôi nhẹ, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở

1210C trong 30 phút

 Môi trường nuôi cấy nấm mốc:

Môi trường czapek:

 Để lắng 20 phút rồi pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6

 Chọn 3 nồng độ pha loãng cuối, mỗi nồng độ hút 0.1ml nhỏ lên bề mặt môi trường nuôi cấy trong các đĩa petri

 Dùng que trang, trải đều mẫu lên khắp bề mặt thạch

 Để khô rồi lật úp đĩa lại, gói đem ủ

 Ủ trong 3-5 ngày

III.KẾT QUẢ:

Vì vi sinh vật mọc quá nhiều nên đếm không được

Bài 7: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT TRONG NƯỚC THẢI

Nồi đun cách thủy Bếp đun Đĩa petri

2 Môi trường-hóa chất:

Nước muối sinh lý 0.9%

Giấy lọc thấm acetate chì Giấy quỳ

Môi trường canh thịt – peptone:

Cao thit 1.95g Peptone 6.5g NaCl 3.25g Thêm nước cất cho đủ 650ml

Đo pH =7±0.2 Chia ra làm 2 phần

Phần 1: 200ml là môi trường lỏng, phân phối vào ống nghiệm để hấp khử trùng Phần 2: 450ml cân 0.9g aga trộn vào môi trường lỏng để là môi trường thạch

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Lấy 10g đất cho vào erlen chứa sẵn 90ml nước muối sinh lí 0.9%, lắc đều được

10-1

 Để lắng 10 phút rồi pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8

 Môi trường sau khi nấu xong cho vào erlen (đối với môi trường thạch) và ống nghiệm (đối với môi trường lỏng) đem đi hấp khử trùng

 Giấy lọc thấm vào acetate chì rồi để khô

 Lấy dây đồng cột giấy lọc và giấy quỳ lại với nhau rồi đem hấp khử trùng ở

1210C trong 30 phút

 Hấp xong, đem môi trường thạch ra làm nguội bớt rồi đổ vào đĩa Petri trong điều kiện vô trùng

 Để thạch đông

 Hút 1ml mẫu dịch pha loãng vào mỗi ống nghiệm trong điều kiện vô trùng

 Dùng kẹp lấy dây đồng có giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào thành ống nghiệm nhưng không để cho giấy quỳ đụng vào thành ống

Tạo bông Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S

Định lượng vi sinh vật amon:

 Ở nồng độ pha loãng 10-5, 10-6 đều không xác định được do tất cả ống nghiệm đều có biểu hiện dương tính

 Ở nồng độ 10-7 có 2 ống nghiệm mà số ml mẫu sử dụng là 0.1ml không có hiện tượng gì hết

 Tra bảng MPN ta được a=460 nên N= 460 ×107 MPN/100ml

Để riêng FeSO4 sau khi hấp khử trùng hãy cho vào để tránh hiện tượng kết tủa môi trường

Sau khi phân phối môi trường vào ống nghiệm ta cho một hột CaCO3

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Cân 10g đất cho vào erlen chứa sẵn 90ml nước muối sinh lí 0.9% đã vô trùng, lắc đều được 10-1

 Để lắng 10 phút rồi pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6

 Môi trường sau khi pha xong cho vào ống nghiệm đem đi hấp khử trùng

 Hấp xong, đem môi trường ra làm nguội bớt rồi cấy

 Chọn 3 nồng độ pha loãng cuối, mỗi nồng độ hút 1ml mẫu dịch pha loãng cấy vào mỗi ống nghiệm trong điều kiện vô trùng Thực hiện 3 ống cho mỗi nồng

10 3 ống dương tính 3 ống dương tính 3 ống dương tính

1 3 ống dương tính 3 ống dương tính 1 ống dương tính 0.1 3 ống dương tính 2 ống dương tính 2 ống dương tính Tra bảng ta được:

Ở nồng độ 10-5: N=1100×105MPN/100ml=160×104MPN/g

Ở nồng độ 10-6:N=120×106MPN/100ml=14×105MPN/g

N: mật độ vi khuẩn phản nitrat hiện diện trong MPN/100ml mẫu

BÀI 9: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN PHẢN NITRAT TRONG ĐẤT

 Dung dịch A:

Asparagine 0.2g KNO3 0.2g Nước máy 0.05l

 Dung dịch B:

KNO3 1.7g K2HPO4 0.2g MgSO4 0.2g CaCl2 0.04g Nước máy 0.05l Hòa tan 0.05l dung dịch A và 0.05l dung dịch B, sau đó thêm nước cất cho đủ 200ml

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Cân 10g đất cho vào erlen chứa sẵn 90ml nước muối sinh lí 0.9% đã vô trùng, lắc đều được 10-1

 Để lắng 10 phút rồi pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6

 Môi trường sau khi pha xong cho vào ống nghiệm đem đi hấp khử trùng

 Hấp xong, đem môi trường ra làm nguội bớt rồi cấy

 Chọn 3 nồng độ pha loãng cuối, mỗi nồng độ hút 1ml mẫu dịch pha loãng cấy vào mỗi ống nghiệm trong điều kiện vô trùng Chú ý là phải cắm pipet xuống sâu dưới đáy ống nghiệm.Thực hiện 3 ống cho mỗi nồng độ.nhỏ vài giọt dầu lên trên dung dịch để dịch không có cơ hội tiếp xúc với môi trưởng bên ngoài

Số ml mẫu sử

dụng (ml)

Độ pha loãng

10 3 ống dương tính 3 ống dương tính 2 ống dương tính

1 3 ống dương tính 1 ống dương tính 0 ống dương tính 0.1 3 ống dương tính 3 ống dương tính 1 ống dương tính Tra bảng ta được:

BÀI 10: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI CÁC HỢP CHẤT KHÓ TAN TRONG ĐẤT

2 Môi trường, hóa chất:

Nước muối sinh lý 0.9%,

Mẫu đất

Nước cất vô trùng

Môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường kiểm tra vi sinh vật phân giải các hợp chất phospho vô cơ khó tan

II Tiến hành thí nghiệm:

 Cân 10g mẫu đất cho vào erlen đã vô trùng, thêm 90ml dịch nước muối sinh lý 0.9%

 Lắc erlen sao cho có được một dung dịch có phân bố đồng đều

 Để lắng trong khoảng 15 phút ta có độ pha loãng 10-1

 Dùng một pipet đã vô trùng lấy 1ml dịch mẫu ban đầu (độ pha loãng 10-1) cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 0.9% vô trùng đã chẩn bị sẵn ở nhiệt độ phòng Trộn kỹ bằng cách hút – thả khoảng 10 lần với 1 pipet khác có nút bông ở đầu hút đã vô trùng, để dịch pha loãng mẫu có nồng độ là 10-2

 Quá trình này được lặp lại liên tục đến nồng độ pha loãng 10-6

 Lấy 3 nồng độ cuối 10-4, 10-5, 10-6 hút 0.05ml cấy vào petri, mỗi nồng độ cấy 3 hộp trong môi trường phospho vô cơ không tan và phospho hữu cơ không tan

 Dùng que trang thủy tinh, trải đều mẫu lên khắp bề mặt môi trường

 Cấy xong, úp ngược hộp lồng petri và đưa vào tủ ấm, sau 2 đến 3 ngày xem kết quả

III KẾT QUẢ:

Vi sinh vật phân giải hợp chất phospho vô cơ khó tan

Vi sinh vật phân giải hợp chất phospho hữu cơ khó tan

Do lượng vi sinh vật quá nhiều nên không thể đếm được

BÀI 12: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM

ngày thực hành:02/08/2010

I DỤNG CỤ - MÔI TRƯỜNG – HÓA CHẤT:

1 Dụng cụ:

Hộp petri ống nghiệm Tấm petrifilm Pipet 1ml và 10 ml Đèn cồn

Bình tia

2 Hóa chất – môi trường:

Mẫu nước Nước cất vô trùng Nước muối sinh lý

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lí trong điều kiện vô trùng

 Lắc đều ống nghiệm trong 1 phút

 Đặt tấm petrifilm lên mặt bàn phẳng

 Dùng kẹp inox lật màng film nilon phủ bề mặt đĩa petrifilm

 Dùng pipet hút 1ml dung dịch mẫu và nhỏ lên giữa màng môi trường trong tấm petrifilm

 Lật cuộn màng nilon trở lại cẩn thận tránh tạo bọt khí và không để tấm màng nilon rơi xuống

 Dùng tấm nhựa chặn có mặt phẳng bên dưới dàn mỏng dung dịch đều kháp màng môi trường trong vùng cấy Dùng một lực nhẹ ấn lên tấm nhựa trải đều trên vùng cấy và lấy tấm nhựa chặn ra khỏi

 Cẩn thận cho tấm petrifilm lên đĩa petri và cho vào tủ ấm ở nhiệt độ

khoảng 350C trong 24h

 Đếm số lượng khuẩn lạc và tính kết quả

Peptone 2g Lactose 2g Nước cất đủ 200ml Nước muối sinh lý 0.9%

Mẫu nước thải

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Nấu môi trường xong, ta phân phối môi trường vào trong ống nghiệm rồi thả ống duham vào đem đi hấp

 Lấy pipet 10ml hút 2ml mẫu nước thải cho vào ống nghiệm chứa 18ml nước muối sinh lí Đảo đều ta được độ pha loãng 10-1

 Tiến hành pha loãng mẫu tiếp tục theo phương pháp pha loãng bậc 10 thành các nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5

 Dùng pipet đã vô trùng hút mẫu đã pha loãng có nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 cho vào các ống nghiệm (loạt 9 ống hoặc 15 ống được phân thành 3 nhóm cho 3 nồng độ) có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng

 Các ống nghiệm môi trường được ủ trong tủ từ 24 – 36h thì đọc kết quả

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Không

có vsv

Có vsv

Mật độ coliforms hiện diện trong 100ml mẫu :

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Có vsv

Mật độ coliforms hiện diện trong 100ml mẫu:

BÀI 16: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT TRONG KHÔNG KHÍ

 Môi trường kiểm tra vi sinh vật bề mặt (môi trường czapek):

Môi trường czapek:

pH= 6,0±0,2 khử trùng 1atm/30 phút

 Môi trường kiểm tra vi sinh vật trong không khí (môi trường PCA):

Cân 4.8g pha trong 200ml nước cất.đem nấu và hấp khử trùng

II TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM:

 Chuẩn bị 1 ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lí

 Trong điều kiện vô trùng nhúng tăm bông vào nước muối sinh lí để tẩm ướt

 Quẹt bong lên bề mặt tủ lạnh với 1 diện tích 100 cm2

 Cho bông vào ống nghiệm có sẵn nước muối sinh lí rồi khoáy đều

 Pha loãng ra nống độ 10-4

 Lấy 3 nồng độ cuối cho 0.1ml vào đĩa Petri đã có môi trường thạch rắn

 Ủ trong tủ ấm sau 3 ngày đọc kết quả

 Môi trường PCA sau khi đổ xong, để nguội rồi đem ra hành lang (có thể tích 77.76m3), dở nắp hộp petri cho khong khí vào

 Sau 10 phút đậy nắp lại đem ủ

 Sau 3 ngày đọc kết quả

Agar 1,4g Hòa tan 0.05l dung dịch A và 0.05l dung dịch B, sau đó thêm nước cất cho đủ 200ml khoáy đều rồi cho 1.4g aga vào dung dịch Giltay.đem đun

Môi trường agar:

Agar 2.55g 150ml nước

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

 Phân phối môi trường vào ống nghiệm và đem đi hấp khử trùng

 Cho 2.55 g agar vào 150ml nước cất rồi khuấy đều đun trên bếp Sau khi sôi đem cho vào erlen đem đi hấp khử trùng

 Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước muối 0.9% và lắc đều mẫu trong 20 phút, sau đó để lắng lấy phần nước trong phía trên ta được dung dịch mẫu 10-1

 Tiếp tục pha loãng mẫu đến nồng độ 10-7

 Môi trường Giltay sau khi hấp khử trùng xong để nguội khoảng 50oC

 Cấy 1ml dịch mẫu chứa vi sinh vật vào môi trường, chú ý đặt đầu pipet ở phần đáy ống nghiệm để đưa vi sinh vật vào phần đáy môi trường, rồi lắc

 Mỗi nồng độ mẫu cấy 3 ống nghiệm từ 10-2 đến 10-7

 Đem đi chưng cách thủy ở 42oC trong 10 phút, để môi trường đông đặc

 Cho 4ml môi trường agar vào mỗi ống nghiệm

 Gói kĩ cho vào tủ ấm ủ trong 2 – 3 ngày