Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 782 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
782
Dung lượng
26,78 MB
Nội dung
1
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINHỨNGDỤNG
Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương
2
- 2009 -
3
Giới thiệu môn học
Môn thựchànhvisinhứngdụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo
sát các visinh vật được ứngdụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các visinhứng
dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác
nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực
vật hay thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng
dụng.
Trong khuôn khổ bàithựchành môn visinhứngdụngsinh viên phân lập visinh vật chủ yếu từ môi
trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại visinh
vật khác nhau. Số lượng visinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt
động sống của visinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các
vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu
huỳnh.
Các bước chung của bàithựchành là
1. Phát hiện các nhóm visinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện
thuộc visinh vật phân lập được.
NỘI DUNGTHỰCHÀNH
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ
BÀI 5: VISINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
4
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
I. Lý thuyết
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo
thành amoniac. Các visinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không
sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn
và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những visinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các visinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các
amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản
phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH
3
và H
2
S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện
hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và
Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó,
vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống
Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình
amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi.
II. Thựchành
Việc phát hiện và xác định số lượng các visinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các
mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.
Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm
tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus –
giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của
khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này.
1. Môi trường - hóa chất
Môi trường canh thịt- peptone:
Cao thịt 5g
Peptone 10g
Nước 1000ml
Môi trường thạch:
Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.
5
Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
Giấy lọc loại thấm acetate chì
Giấy quỳ đỏ
Các loại thuốc nhuộm quan sát visinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử,
Thuốc thử Nessler
2. Dụng cụ
Các dụng cụ pha chế môi trường
Các dụng cụ cấy, khử trùng
Kinh hiển vi
3. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường:
Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở
1 atm, 15 min.
Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5
atm.
Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ
ở 30
O
C
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù
Ủ visinh vật trên môi trường lỏng:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
5
– 10
10
Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử
trùng ở trên
Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống
nghiệm
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
Ủ visinh vật trên môi trường thạch:
Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10
2
– 10
5
Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên
Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch
Ủ ở nhiệt độ 28-30
O
C trong 3 ngày đêm.
Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng
6
4. Quan sát và ghi nhận kết quả
Đối với môi trường lỏng, quan sát:
Sự đục môi trường
Sự tạo bông, kết cạn
Nổi váng trên bề mặt
Phản ứngsinh hóa:
Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm
một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
Màu vàng nhạt – ít ammoniac
Vàng sậm – nhiều ammoniac
Nâu – rất nhiều ammoniac
Sự sinh NH
3
làm giấy quỳ hóa xanh
Sự sinh H
2
S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen.
So sánh đối chứng và thí nghiệm.
Độ pha
loãng
Đục môi
trường
Tạo bông Tạo cặn Sinh NH
3
Sinh H
2
S
Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu
Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ visinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
Trên môi trường thạch, ghi nhận:
Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng
Số khuẩn lạc đặc trưng
Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng
Độ pha
loãng
Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc
đặc trưng
Hình thái
khuẩn lạc
Xuất hiện
bào tử
Khả năng di
động
Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi
So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch
7
BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA
I. Lý thuyết
Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH
3
thành HNO
3
, cung cấp năng lượng cho visinh vật hoạt
động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO
2
. Hầu hết các visinh vật tự
dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này.
Nitrat hóa qua 2 giai đoạn:
Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH
3
thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa:
Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất cả chúng đều giống nhau về mặt
sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào.
Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục.
Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai
pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào
không di động.
Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn:
Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.
Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt
đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có
thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ,
thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn
keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao.
Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với
việc oxi hóa cơ chất-NH
3
và nitrit
II. Thựchành
Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch
huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi
trường này là CO
2
có trong không khí và trong thành phần của CaCO
3
. Nguyên liệu năng lượng và
nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH
3
và muối amon, còn
đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit.
Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào
môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới
hạn.
8
1. Môi trường- hóa chất
Thành phần môi trường Winogradski:
(NH4)
2
SO
4
2 g/l
K
2
HPO4 1 g/l
MgSO4 0,5 g/l
FeSO4 0,4 g/l
NaCl 2 g/l
Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO
3
. Hấp khử trùng ở 1 atm
Dung dịch pha loãng mẫu
Các loại thuốc nhuộm quan sát visinh vật
Tinh thể diphenylamin
H
2
SO
4
đậm đặc
2. Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm
Xác định visinh vật trên môi trường lỏng:
Pha loãng mẫu 10
2
- 10
5
Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên
Ủ ở 28-30
O
C trong 2-3 tuần
Làm 1 ống nghiệm đối chứng
3. Quan sát và ghi nhận kết quả:
Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm
Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính.
Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H
2
SO
4
đậm đặc. Sau
đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm.
Ghi nhận kết quả vào bảng
Ống nghiệm
số
Độ pha loãng
10
2
10
3
10
4
10
5
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
NO
2-
NO
3-
9
Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Cần lưu ý chọn
được cả những hạt CaCO
3
, vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn là cao nhất. Miêu tả, so sánh hình
thái các tế bào vi khuẩn quan sát được (hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn
keo). Nhận xét loài nào chiếm ưu thế nhất.
10
BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA
I. Lý thuyết
Phản nitrat hóa là quá trình visinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng
thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO
2
và H
2
O với chất nhận điện tử
cuối cùng là NO
3
. Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được visinh vật sử dụng trong quá trình
hoạt động sống của mình.
Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh
trong điều kiện kỵ khí.
Các visinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng
thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas,
Achromobacter, Micrococcus …
II. Thựchành
Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng
phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất
khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử
dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron
nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4
+
. Vì vậy,
trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc
muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy.
Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn.
1. Môi trường- hóa chất
Môi trường Giltay:
Dung dịch A:
Asparagine: 1g
KNO
3
: 1g
Nước máy: 0.25l
Dung dịch B:
KNO
3
: 8,5g
K
2
HPO
4
: 1g
MgSO
4
: 1g
CaCl
2
: 0,2g
[...]... loài Poliovirus Virus cúm gà H5N1 Virus HIV/AIDS Trong thực tế, số loài visinh vật phải tới hàng triệu loài Bảo tàng giống chuẩn visinh vật (VTCC) thuộc TT Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà Nội hợp tác với các nhà khoa học Nhật bản và dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã bước đầu phát hiện được khá nhiều loài visinh vật mới được thế giới công nhận 2-Các đặc điểm chung của visinh vật : Visinh vật... (1822-1895) Kính hiển vi của Leeuwenhoek Bút tích miêu tả visinh vật của Leeuwenhoek Robert Koch (18431910) Thí nghiệm bình cổ cong để phản đối thuyết tự sinh (Pasteur) Vi khuẩn lao chụp qua kính hiển vi Alexander Fleming (1881-1955) Elie Metchnikoff (1845-1916) Nấm Penicillium sản sinh penicillin Bài 2 Những đặc điểm chung của ViSinh Vật 1 -Vi sinh vật thuộc giới sinh vật nào? Visinh vật không phải... dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào tử nấm mốc Khuẩn lạc loại Tế bào sinh dưỡng Vi kén Hình vẽ tế bào Hình vẽ vi kén (nếu có) Loại 1 Loại 2 17 Cùng bạn đọc Visinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Visinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên số visinh vật... củ cải, tôm, cá ) Sau vi c Leeuwenhoek phát hiện ra visinh vật và vi c Louis Pasteur phát hiện ra bản chất của các visinh vật- từ đó khai sinh ra ngành Visinh vật học (Microbiology)- thì nhân loại bắt đầu quan tâm rất nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mẻ này Visinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH) Người ta chia sự phát triển của CNSH ra thành 3 giai đoạn: *... triệu loài sinh vật có khoảng 200 000 loài visinh vật (100 000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90 000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn) Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật Virus là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể cho nên chưa được kể đến trong số 200 000 loài visinh vật nói trên Số virus đã... nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn Từ trước đến nay có rất nhiều hệ thống phân loại sinh vật Các đơn vị phân loại sinh vật nói chung và vi sinh vật nói riêng... (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút Với nhiều visinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu ( Chlorella ) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ Có thể nói không có sinh vật nào có tốc độ sinh sôi nảy nở nhanh như visinh vật Nấm men Vi kuẩn Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Nấm sợi Alternaria Vi tảo Chlorella 4) Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến dị : Trong... bảng nói trên giáo vi n cần giải thích cho sinhvi n những kiến thức cơ bản thuộc giáo trình Tế bào học và Di truyền học Phần lớn visinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh Trong giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều được coi là visinh vật Như vậy là visinh vật không có mặt trong hai giới Động vật và Thực vật Người ta... hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường ứng thành đôi và có bao nhầy Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng Hình dạng tế bào Bào tử Kích Sự sắp Bao Hình thước xếp tế nhầy vẽ tế bào bào Loại 1 Loại 2 BÀI 5 :VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 14 I Lý thuyết Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Vi c tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn vi c... nay đã đạt đến 150g/ml dịch lên men (VEDAN -Vi t Nam) Nhà máy Vedan -Vi t Nam 5) Phân bố rộng, chủng loại nhiều : Visinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật Visinh vật tham gia tích cực vào vi c thực hiện các vòng tuần hoàn sinh- địahoá học (biogeochemical cycles) như . thuộc vi sinh vật phân lập được. NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT. chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh vi n phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong. NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 2 - 2009 - 3 Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng