Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm

Báo cáo thực hành vi sinh thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MỤC LỤC Bài 1: Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm và các phương pháp

tiệt trùng vi sinh vật 3

Bài 2: Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật 6

Bài 3: Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 10

Bài 4: phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học 16

Bài 5: Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 19

Bài 6: Phương pháp phân lập vi sinh vật 20

Bài 10: Khảo sát đặc tính sinh hóa của vi sinh vật 23

Bài 13: Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp 35

Bài 14: Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37

Bài 15: Định lượng Coliform bằng phương pháp MPN 39

Bài 19: Phương pháp định lượng E.coli trong thực phẩm 41

Bài 20: Phương pháp phân tích Salmonella spp trong thực phẩm 43

Bài 21: Phương pháp phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm 46

Bài 22: Phương pháp phân tích định lượng Staphilococcus aureus trong thực phẩm 48

Bài 24: Phương pháp phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm 50

BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ

CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

Báo cáo thực tập

1 Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi ấy vi sinh vật?

Yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật:

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng ướt

- Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ Có thểdùng hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng

2 Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật?

Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật:

a Nồi hấp ướt (autoclave):

Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao, được sử dụng để hấp khử trùng

mô trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm

- Phiến kính (lame): dùng làm tiêu bản quan sát hình thái, sinh lý tế bào vi sinhvật

- Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi trên tiêu bản cố định vi sinh vậttrong qua trình nghiên cứu

- Đĩa petri: dùng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy vàphân lập của tế bào vi sinh vật

- Que trãi: phân lập vi sinh vật theo phương pháp trãi đĩa.

- Que cấy:

+ Que cấy đầu tròn: dùng để thao tác vi sinh trên đối tượng đơn bào như vikhuẩn, nấm men

+ Que cấy nhón: dùng để cấy sâu trên môi trường rắn

+ Que cấy móc: dùng để lấy khuẩn ty hay một đoạn tơ nấm

- Micro pipette: sử dụng khi cần hút một lượng chính xác môi trường

4.Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

Phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

a Phương pháp lý học:

Nhiệt khô:

- Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng

là đốt trục tiếp trên ngọn lửa đèn cồn

- Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói và sấy ở 1600C trong 1-2 giờ hoặc 1800Ctrong 30 phút

Nhiệt ẩm:

- Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vàomẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Chỉ diệt tế bào sinhdưỡng, bào tử vẫn còn

- Phương pháp Pasteur: chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh, không diệt bào tử và vikhuẩn hoại sinh Phương pháp này thường dùng ở nhiệt độ 70-750C trong thời gian10-15 phút

- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70-800C, mỗi lần

30-60 phút và liên tiếp trong ba ngày liền

- Phương pháp hơi nước bão hòa ở áp suất cao: dùng autoclave Thường dùng ởnhiệt độ 1210C trong 15-30 phút

Diệt trùng bức xạ:

- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật

- Tia âm cực dùng trong tiệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử

Diệt trung bằng cách lọc:

- Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kíchthước lỗ lọc từ 0,2-0,45μm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùngm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùngbằng nhiệt được

- Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang

bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn

b Phương pháp hóa học.

- Chỉ sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu

- Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor…

BÀI 2: CÁCH PHA CHẾ CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG

I TRẢ LỜI CÂU HỎI

1 Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Khái niệm môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất này cónhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pHtrong môi trường trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quátrình trao đổi chất nội bào

 Phân loại môi trường dinh dưỡng

Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên,

ví dụ như: PGA, giá đậu đường

Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được

sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật

Môi trường đặc: cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar

Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar

Môi trường phân lập

Môi trường tăng sinh

Môi trường nuôi giữ giống: nghèo dinh dưỡng

Môi trường thử nghiệm sinh hóa

2 Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Bao gồm các bước sau:

 Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

 Điều chỉnh độ pH của môi trường

 Phân phối môi trường vào dụng cụ

 Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri

 Kiển tra độ vô trùng và bảo quản

3 Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch

đứng

 Làm thạch nghiêng:

Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trường chưa đôngđặc

- Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không được

để môi trường chạm vào nút bông

- Để yên cho đến khi môi trường đông đặc Yêu cầu mặt thạch phải thẳng,nhẵn và liên tục

- Đặt các ống nghiệm có môi trường là thạch đứng vào giá, để yên cho môitrường đông đặc

 Đổ môi trường vào đĩa petri:

- Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vôtrùng và gồm các thao tác sau:

o Mở bao giấy gói các đĩa petri

o Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường

o Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đền cồn

o Mở hé nắp đĩa petri Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri

o Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa

o Để yên cho môi trường đông đặc

o Lật ngược đĩa lại và bảo quản

4 Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng

Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạpchất vì vậy sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định được kết quả Có thể tránh đượchơi nước tiếp xúc vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trường

6 Ý nghĩa của việc pha chế môi trường?

Chúng ta phải pha chế môi trường cho vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa- khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường để vi sinh vật có thể sinh trưởng và phát triển một cách tối ưu nhất có thể

Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồngthời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng

7 Yêu cầu của một môi trường dinh dưỡng nuôi cấy?

Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết, có độ pHphù hợp có độ nhớt nhất định, không chứa các yếu tố độc hại, hoàn toàn vô trùng, đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật

8 Nêu ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy?

Peptone chiết xuất cao thịt bò dùng làm nguồn cacbon, năng lượng và nitơ Caothịt bò chứa các axit amin, peptit, nuclêôtit, axit hữu cơ, vitamin và một số chất

khoáng Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm B cũng như nguồn nitơ

o Từ thực vật: chiết xuất từ đậu nành,…

o Nấm men: cao nấm men, Cao nấm men là nguồn phong phú các vitamin nhóm

B cũng như nguồn nitơ và cacbon)

10 Cơ chế làm trong nước của lòng trắng trứng

Cách làm trong nước bằng lòng trắng trứng: lòng trắng trứng: nước tỉ lệ 1:1→ đánh tan nổi bọt → cho vào 1 lít môi trường → đun sôi khoảng 5 phút → để nguội

→ lắng cặn →lọc

Cơ chế: các protein trong lòng trắng trứng như albumin, ovalbumin dưới tác độngcủa sự khuấy trộn và gia nhiệt bị biến tính không thuận nghịch, các liên kết trongprotein được kéo dãn làm lộ ra nhiều nhóm chức → hình thành lực hút tĩnh điện vớicác ion, bụi bẩn có trong nước → sau khi lắng, lọc nước trong hơn

BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

PHÂN LẬP SINH VẬT

I Nguyên tắc

1 Mục đích của việc nuôi cấy

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu vật phẩm cần nghiên cứu

- Tiến hành việc phân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển từng loại của vi sinh vật

2 Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật

Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài

Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải khử trùng triệt để Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển thuận lợi

II Dụng cụ, môi trường và hóa chất

III Tiến hành thí nghiệm

1 Phương pháp cấy truyền thạch (môi trường thạch).

1.1 Cấy truyền trên thạch đĩa

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:

* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:

- Để đĩa pêtri lên bàn

- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở

phương pháp chung

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một

trong các kiểu sau:

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch (hình 3.3a)

+ Theo những đường song song (hình 3.3b)

+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc (hình 3.3c)

Hình 3.1 Các kiểu cấy trên thạch đĩa

dàn vi sinh vật lên bề mặt môi trường

A – que gạt B – dàn bằng que gạt; C: Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn đều bằng que gạt; D : Sự sinh trưởng của VSV sau khi dàn bằng que cấy

- Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp

theo:

+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu (hình 3.1)

- Hình chữ chi

- Hình vòng xoắn

- Hình vạch ngang song song

d

Hình 3.2: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng

1.3 Phương pháp cấy trên thạch đứng: cấy sinh vật kị khí

 Sử dụng que cấy hình kim

 Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ

 Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu

 Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

IV Trả lời câu hỏi.

1 Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

- Cấy truyên vi sinh vật trên môi trường lỏng: cấy truyền bằng pipette Pasteur, cấy truyền bằng que cấy vòng

- Cấy truyền trên môi trường lỏng: cấy truyền trên ống truyền thạch nghiêng, trên ống nghiệm thạch đứng, cấy truyền trên thạch đĩa

2 Các phương pháp giữ ống vi sinh vật

a Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới

Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu

Nhược điểm: tốn môi trường, công sức và thời gian Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đếnmất chủng giống gốc Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảoquản Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp cho các chủng bảo quản Giống gốc có thể bị mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp Chủng vi sinh vật đễ bị thay đổi các đặc tính sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi làn cấy truyền

b Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng

Ưu điểm: đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại Môi trường không bị mất nước vàkhô

c Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt…

Ưu điểm: dễ bảo quản các chủng bào tử tiềm sinh, thời gian bảo quản có thể kéo dài đến 1 năm

Nhược điểm: khử trùng môi trường trước

e Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Ưu điểm: thích hợp cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm men, vi khuẩn, nấm mốc, vỉut, tảo và các dòng tế bào động vật thời gian bảo quản lâu

Nhược điểm: đầu tư kinh phí cho thiết bị, điện quá cao, rủi ro cháy nổ, không thíchhợp cho các chủng vi sinh vật hay dùng đến thường xuyên.

3 Trình bày nguyên tắc và mục đích của quá trình phân lập.

- Nguyên tắc: tách rời các tế bào vi sinh vật, nuôi cấy các tế bào trong môi

trường dinh dưỡng để tạo khuẩn lạc riêng rẽ

- Mục đích: phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau

4 Muốn phân lập nấm men, nấm mốc, vi khuẩn thì nguồn mẫu cần chọn là gì?

Trả lời:

- Phân lập vi khuẩn: nguồn mẫu là cỏ khô cắt nhỏ

- Nấm mốc: nguồn mẫu là cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô

- Nấm men: nguồn mẫu là bề mặt trái cây, dịch ép như táo, lê hoặc trong rượu nếp, bia, nước mía

5 So sánh sự giống và khác nhau của cách phân lập vi sinh vật hiếu khí và kị khí.

Trả lời:

- Giống nhau: nhằm phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên

và cô lập chúng nhằm chọn lựa những giống vi sinh vật thuần khiết.Khác nhau:

Phân lập vi sinh vật hiếu khí Phân lập vi sinh vật kị khí

- Hút dịch mẫu đã pha loãng cho

vao dĩa petri có môi trường thích

hợp

- Dùng que gạt thủy tinh phân phối

dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch

- Tiếp tục dùng que gạt mẫu cho

đều khắp mặt thạch đĩa thứ 2 rồi

- Để nguội môi trường còn 45-50oC

- Hút dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm

- Rút nhanh, đậy nhanh tránh cho ống nghiệm có không khí

- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp

6 Tại sao khi đi cân hoá chất chỉ cần 2-3 người?

Do dụng cụ trong phòng hoá chất có hạn, đi cân hoá chất cần 2-3 người đã đảm bảo về thời gian,hiệu quả làm việc

BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT KÍNH HIỂN VI BẰNG KÍNH

HIỂN VI QUANG HỌC

1 Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học

a Cấu tạo

Kính hiển vi quang học gồm có hai phần:

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm có chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính,

ổ gắn và xoay vật kính, bán kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh thô sơ cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp)

- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màng chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng hoặc kính chiếu sáng) Ngoài ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng

b Nguyên tắc hoạt động

Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đạimẫu vật Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêubản có độ phóng đại lớn nhất Độ phóng đại của kính phụ thuộc vào tiêu cự, tức bánkính cong của thấu kính Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóngđại càng lớn

Có hai loại vật kính

 Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4,x10,x15,x40

 Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90,x100

Thị kính cũng có độ phóng đại phức tạp, gồm hai thấu kính, một hướng về phíamắt người xem, một hướng về vật kính Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vậtkính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn

Độ phóng đại của kính = Độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính x100, độ phóng đại của thị kính x10 Như vậy độphóng đại của kính : 100x10=1000 lần

Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính đểchọn kính hiển vi.

2 Có bao nhiêu loại kính hiển vi? Đặc điểm của từng loại?

Có 5 loại kính hiển vi

- Kính hiển vi viền đen

Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vàoxung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính.Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sángchiếu vào, giúp ta thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào Chứcnăng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khóquan sát

- Kính hiển vi đổi pha

Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quangkính, vật kính và thị kính Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiênmao, các lớp màng

- Kính hiển vi huỳnh quang

Chùm tia tử ngoại chiếu vào các tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnhquang Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau.Chức năng: quan sát và phân biệt các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật

- Kính hiển vi điện tử

Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giảicao, giúp phân biệt hai điểm rất gần nhau Chức năng: quan sát vỉut, cấu trúc phân tửcủa tế bào

- Kính hiển vi quang học

Dùng bước sóng 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suấtphân li lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên Hệ thống phóng

to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: vật kính và thị kính Mỗi bộ phận làmột hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp Chức năng của kính hiển vi quang học là dùng

để quan sát tế bào vi sinh vật, kí sinh trùng, tế bào động vật, thực vật

3 Tại sao khi quan sát ở vật kính × 100 phải cho 1 giọt dầu soi kính?

Do chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thuỷ tinh, nên tia sáng khi đi quatiêu bản thuỷ tinh sẽ bị khúc xạ một phần Phần phía ngoài cuả tia sáng do bị khúc xạnên không đi vào được vật kính Vật kính có độ phóng đại càng lớn thì đường kínhcủa thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào vật kính rất ít nên không nhìn rõ ảnh Đểhạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi kính có chiết suất ánh sáng gần bằng thuỷtinh Thuỷ tinh và dầu soi được xem là một môi trường đồng nhất ánh sáng đi quakhông bị khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh

BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT

Báo cáo thực tập

1 Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm

có màu đỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân?

Sau khi nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ có màu xanh đen hay tím, còn vikhuẩn Gram âm có màu đỏ vang (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl) Sở dĩ

có màu như vậy là do vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm có sự khác biệt vềthành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì

có nhiều peptidoglycan (phức chất protein-đường) và các peptidoglycan này được liênkết chặt chẽ với nhau từ đó có thể giúp cho tế bào kháng lại chất tẩy màu nên sau khirửa bằng cồn thì crystal violet không bị rửa trôi và vẫn giữ được màu tím, sau đónhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, nhưng không có sựthay đổi màu nhiều Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độcao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (aceton, alcohol,…) và bị rửatrôi cùng với crystal violet (màu tím), sau khi nhỏ dung dịch tẩy màu, ta nhuộm thembằng dung dịch safranin O hoặc Fuchsin Ziehl, lúc này vi khuẩn Gram âm có màu đỏvàng hay đỏ tía

2 Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm có màu gì? Tại sao?

Nếu không nhuộm bổ sung thuốc thử safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm sẽkhông có màu Bởi vì ở giai đoạn tẩy màu bằng cồn đã rửa trôi crystal violet (có màutím) nên sau giai đoạn tẩy màu vi khuẩn Gram âm đã bị mất màu của crystal violetđược nhuộm ở trước đó Hoặc trường hợp vi khuẩn Gram âm sẽ có màu tím cũng cóthể ở giai đoạn tẩy rửa, ta không tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy rakhỏi phiến kính là không màu

1 Trình bày nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết?

Nguyên tắc:

- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2%thạch hay còn gọi là agar)

- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau

- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạchnghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết

Phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết:

1.1 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí:

Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn Một số

kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T , kỹ thuật ria bốn góc ,kỹ thuật ria tia ,kỹthuật ria liên tục

Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:

a Kỹ thuật hộp ria:

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống

- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốngóc) Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khithực hiệnđường ria tiếp theo

- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

- Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri

- Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải,thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanhgạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong

- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên

1.2 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiếu khí:

- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ khôngkhí trong môi trường

- Để nguội môi trường còn 45 - 500C

- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanhtrục ống nghiệm

- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thậtnhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí

- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độthích hợp

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môitrường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp

2 Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?

Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy: trường hợp số vi khuẩn có trong mẫu ít thì

phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và các điều kiện lý hóa

3 Thế nào là chuẩn vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)?

Chuẩn vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con,cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật được thu nhận

từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể đượchình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thuđược chủng vi sinh vật thuần khiết

BÀI 10: CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

Chủng

Vi Sinh Vật Môi Trường Dương tính Âm tính

Kết quả, dương tính (màu hồng)

và âm tính (màu vàng)

ThuốcthửKovac’s

37oC24h

Chủng

Vi Sinh Vật

Môi Trường: NB và Tripton

Cơ chế phép thử: Vi sinh vật tiết enzyme tryptophannase chuyển hóa tryptophan trongmôi trường thành Indol Indol sẽ kết hợp với para-dimethylaminbenzaldehyd trongthuốc thử kovac’s tạo thành phức chất có màu hồng cánh sen.

Ý nghĩa:

 Phép thử cho biết các chủng loại vi sinh vật có khả năng tiết enzymetryptophannase, giúp ta định danh được một số chủng loại vi sinh vật

 Là phản ứng giúp phân biệt

◦ E coli (+) với Klebsiella (-)

◦ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)

◦ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)…

 Đối chứng (+) Proteus rettgeri

(-) Serratia marcescens

2 Phản ứng MR (methyl red)

 Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình

lên men glucose

Red

Cơ chế:

 Cơ sở sinh hóa:

◦ Chất chỉ thị pH: methyl red

◦ MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid

◦ MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị

chuyển hóa – môi trường dần trung tính

 Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC

Cơ chế: một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose qua quá trình đường phân tạo thành acid pyruvic, rồi từ Acid pyruvic chuyển hóa thành acetyl coenzyme

A, đi qua chu trình Kreps tạo ra các acid: acid citric, acid succinic, acid fomic, a cid malic, a cid oxalic… hoặc từ Acid pyruvic chuyển trực tiếp thành các acid lactic, acid fomic,…

Trong môi trường MR-VP có PH= 6.9±0.2 có K2HPO4 (đệm phosphat) giúp ổn định PH, khi có mặt các acid hữu cơ mạnh sẽ tấn công và phá vỡ thế PH ổn định làm cho PH giảm mạnh, PH<4.3, Với sự có mặt của thuốc thử MR (Methyl Red) sẽ làm môi trường chuyển sang màu đỏ (Phản ứng dương tính)

Ý nghĩa: Định danh một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa Glucose (thường là