ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP
Báo cáo thực tập
1. Nguyên tắc và cách tiến hành của phương pháp định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp
a. Nguyên tắc
Dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào VSV bằng kính hiển vi và buồng đếm. Phương pháp này dùng để xác định số lượng các loại VSV đơn bào có kích thước lớn như: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát trên kính hiển vi. Quy trình đếm đơn giản, cho phép xác định nhanh chóng số lượng VSV. Tuy nhiên, do quan sát và đếm bằng mắt trên kính hiển vi nên có một số trở ngại
- Không phân biệt các tế bào VSV sống và chết trong mẫu. - Không phân biệt các tế bào VSV và hạt vật thể.
- Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp do lượng dd đem đếm nhỏ
Tùy mức độ có mặt của VSV trong mẫu ban đầu, dd đem đếm cần được pha loãng đến mức phù hợp ( số tb trong một ô nhỏ khơng q 10 tb). Ngun tắc pha lỗng:
- Mẫu phải được pha loãng. Tùy theo mức độ nhiễm khuẩn của mẫu ta có sự ước lượng pha lỗng 1/5, 1/10, 1/20 hay 1/10, 1/100, 1/1000…
- Dung dịch pha loãng mẫu thường là NaCl 9% hay phosphat đệm đã được vô trùng.
- Cách pha:
+ Mẫu 1/5: 1ml mẫu+4ml NaCl 9% + Mẫu 1/10: 1ml mẫu+9ml NaCl 9%\
- Từ mẫu 1/10 lấy 1ml +9ml NaCl 9% ta có độ pha lỗng 10-2, cứ như vậy ta có các độ pha lỗng tiếp theo 10-3, 10-4,…
b. Cách tiến hành
- Đặt lamelle sạch phủ lên khung đếm.
- Dùng ống nhỏ giọt hút dd nấm men đã pha loãng, bơm nhẹ và rãnh buồng đếm, dd thấm vào kẽ buồng đếm và lamelle.
- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lấp đầy khắp lamelle. Nếu bị bọt mắc lại trong lamelle thì phải làm lại.
Tăng sinh ( chọn 3 nồng độ liện tiếp thích hợp cấy 1 ml mẫu vào 10ml BGBL, mỗi nồng độ cấy 3 ống, ủ 370C/48h) Mẫu
Đồng nhất mẫu ( hút 1ml mẫu trong 9 ml nước muối sinh lý)
Pha loãng mẫu ( pha loãng thành 10-2, 10-3, 10-4…)
Ghi nhận số ống dương ởmỗi nồng độ pha loãng
Tra bảng MPN Chọn ống (+) cấy sang môi trường nước tryptone ủ 440C/24h
Thử phản ứng Indole bằng thuốc thử Kowac’s - Thao tác kính hiển vi, dùng vật kình x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó
dùng vật kính x40 để đếm.
- Đếm số TB trong 5 ô lớn (4 ô góc, 1 ơ giữa), đếm lần lượt từng ơ nhỏ trong 1 ô lớn.
- Trường hợp 1 ơ lớn có 16 ơ nhỏ: đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớn. - Trường hợp 1 ơ lớn có 25 ơ nhỏ: đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớn.
2. Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách đếm trực tiếp thường áp dụng cho những đối tượng vi sinh vật nào? Giải thích
Đối tượng: những vi sinh vật có kích thước lớn nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát trên kính hiển vi.
Do quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40, nghĩa là độ phóng đại lên 400 lần nên chỉ có thể đếm được những vi sinh vật có kích thước lớn.
BÀI 14: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
Nguyên tắc
Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong mơi trường. Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định được lượng vi sinh vật cịn có khả năng sinh trưởng trong mơi trường trong mẫu ban đầu
Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc. Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha lỗng và chọn những độ pha lỗng lớn hơn.
Báo cáo thực tập
1. Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Có 2 phương pháp là đếm trực tiếp và đếm gián tiếp
- Cách đếm trực tiếp: đối với những vi sinh vật có kích thước lớn tảo, nấm men… thì ta có thể đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Phương pháp này nhanh, tuy nhiên khơng chính xác vì ta khơng thể phân biệt số lượng tế bào chết với tế bào sống, ngoài ra cịn có sự nhầm lẫn do các vật thể khác trong mẫu.
- Cách đếm gián tiếp bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch: phương pháp này đã được trình bày trong quá trình tiến hành ở trên.
2. So sánh ưu nhược điểm của phương pháp tạo hộp đổ và phương pháp cấy trải
Phương pháp cấy trải:
• Ưu điểm: độ đồng đều cao (khuẩn lạc mọc đều) nên dễ nhận dạng các khuẩn lạc đặc trưng
• Nhược điểm:
oThời gian trải lâu
Phương pháp tạo hộp đổ:
• Ưu điểm: thể tích mẫu cấy lớn, mật độ vi sinh vật cao
• Nhược điểm: Dễ làm vi sinh vật chết nếu môi trường chưa hạ xuống nhiệt độ 450C. Khơng xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định
BÀI 15: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
Báo cáo thực tập
1. Đặc điểm của nhóm vi khuẩn Coliform và tác hại của chúng
Coliform là những trực khuẩn, Gram (-), khơng sinh bào tử, kỵ khí tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24-48h. Phát triển ở pH từ 4,4-9,0, nhiệt độ rất rộng -2:500C,
Nhóm Coliform hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Số lượng coliform trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng của các vi sinh vật gây bệnh khác, chỉ thị cho mức độ vệ sinh của mơi trường hay một sản phẩm. Nhóm coliform gồm 4 giống là : E.coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobactor
Tác hại: vi khuẩn được đưa vào thực phẩm từ nước có nhiễm phân hay từ nguyên liệu thực phẩm nhiễm phân.
Triệu chứng ngộ độc: thời gian ủ bệnh từ 2-20h. Bệnh phát đột ngột, đau bụng dữ dội, ít nơn mửa, đi phân lỏng, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ, có trường hợp sốt cao, chân co quắp. Bình thường sau 2-3 ngày sẽ khỏi, bị nặng sẽ lâu hơn.
2. Trình bày nguyên tắc và phương pháp định lượng coliform trong thực phẩm theo phương pháp MPN.
a. Nguyên tắc
Dùng phương pháp MPN để xác định copliform trong thực phẩm.
Phương pháp MPN( phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng VSV theo số lượng VSV có xác suất lớn nhất có mặt trong 1 đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của 1 loạt các thí nghiệm được lặp lại ở 1 số độ pha loãng khác nhau. Thông thường việc định lượng này được lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 9 ống nghiệm. các độ pha loãng được lựa chọn sao cho các lần lặp lại có 1 lần dương tính và 1 âm tính.
Tăng sinh ( chọn 3 nồng độ liện tiếp thích hợp cấy 1 ml mẫu vào 10ml BGBL, mỗi nồng độ cấy 3 ống, ủ 370C/48h) Mẫu
Đồng nhất mẫu ( hút 1ml mẫu trong 9 ml nước muối sinh lý) Pha loãng mẫu ( pha loãng thành 10-2, 10-3, 10-4…)
Ghi nhận số ống dương ởmỗi nồng độ pha lỗng
Tra bảng MPN Chọn ống (+) cấy sang mơi trường nước tryptone ủ 440C/24h
Thử phản ứng Indole bằng thuốc thử Kowac’s
Tra bảng MPN, tính mật độ E.coli
Từ các kết quả của thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy ra mật độ ước đốn số lượng VSV có trong mẫu, được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/g mẫu. Độ chính xác của phương pháo MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn
Pha loãng mẫu 10-2, 10-3,10-4….
Chuyển 1ml dung dịch 10-2, 10-3, 10-4 vào 10ml canh BGBL, nồng độ 3 ống lặp lại, ủ 370C, 36h
Chọn ống (+), cấy sang EC, ủ 440C trong 24-48h
Xác định ống (+) ở mỗi nồng độ, cấy sinh khối VSV từ các ống (+) sang đĩa môi trường EMB để phân lập E.coli Lấy 1ml mẫu nước mía cho vào 9ml nước muối sinh lý, được 10-1
BÀI 19: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM
Báo cáo thực tập
1. Trình bày đặc điểm của E.coli
Là trực khuẩn, gram(-), không tạo bào tử. Phát triển ở nhiệt độ từ 7-500C, t0opt là
370C,pHopt là 4,4.
E.coli sống trong ruột già của người và của động vật. E.coli theo phân người và phân gia súc ra thiên nhiên
2. Trình bày quy trình phân tích định lượng
a. Cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa
- Phản ứng Indol
• Trong mơi trường NB/ tryptone sẽ có Tryptophan
• Nếu trong mơi trường đó có vi khuẩn E.Coli thì sẽ sản sinh ra Emzyme Tryptophanase
• Tryptophanase sẽ khử Tryptophan thì Indol
• Để nhận biết có Indol trong mơi trường hay khơng thì chúng ta sẽ nhỏ thuốc thử kowac’s vào. Nếu sinh ra hợp chất có màu hồng cánh sen thì có mặt của Indol
- Thử nghiệm MR
• Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid hữu cơ
• Trong mơi trường có hệ đệm phosphat ( K2HPO4) nhằm ổn định pH (6,9)mơi trường. E.coli có khả năng lên men glucose tạo ra acid hữu cơ bền thì nó sẽ phá vỡ hệ đệm làm pH giảm mạnh xuống khoảng 4 – 4,3.
• Nhỏ MR nếu pH <4,3 thì mơi trường có màu đỏ thì (+) cịn màu vàng thì (-)
Kết quả MR(+)
- Thử nghiệm VP
• Nguyên tắc: cũng giống như với MR nhưng nó sẽ khơng tạo ra acid hữu cơ mà tạo thành acetoin
• Sau đó nhỏ thêm KOH 10% và napthol. Để yên đợi trong vòng 30s cho đến 10 phút
• Phản ứng (+): có màu đỏ hồng
• Phản ứng (-): mơi trường có màu vàng hoặc màu nâu đất =>E.coli khơng có khả năng sinh acetoin nên phản ứng cho kết quả âm tính.
BÀI 20: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SAMONELLA SPP TRONG THỰC PHẨM
Ngun tắc
Q trình phân tích Samonella gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập, và khẳng định. Bước tăng sinh chọn lọc thường dùng các loại môi trường chuyên biệt tùy vào nguồn mẫu thu nhận. Bước khẳng định nhằm xác nhận các khuẩn lạc đặc trưng cho Samonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên việc sử dụng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Samonella
Báo cáo thực tập
Mẫu
Phân lập
Tiền tăng sinh( đồng nhất 25ml mẫu trong 225ml canh BPW ủ 370C trong 16-24h)
h 3 ± Tăng sinh chọn lọc h 3 ± h 3 ±
2. Tại sao khi phân tích Samonella chỉ cần phân tích định tính
Chỉ tiêu Samonella là 1 trong những chỉ tiêu rất quan trọng trong kiểm định các loại hải sản như cá, mực, tôm…theo những tiêu chuẩn VN quy định về sự có mặt của Samonella trong 25gam các loại này là 0, nghĩa là khơng cho phép sự có mặt của nó trong thực phẩm này. Nên chúng ta chỉ cần phát hiện sự có mặt của Samonella khơng cần phân tích định lượng
a. Giải thích cơ chế các phản ứng sinh hóa xác định Samonella
Đối với phản ứng MR-VP đã được trình bày trong bài phân tích định lượng E.coli. Chỉ giải thích phản ứng sinh hóa LDC và MIU
• LDC
Trong mơi trường LDC cũng có glucose nên vi sinh vật sẽ phân giải glucose tạo thành các acid hữu cơ làm giảm pH mơi trường, do đó mơi trường sẽ có màu vàng
Khi nguồn glucose cạn kiệt thì vi sinh vật sẽ sử dụng Lysine
Cơ chế: vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme lysine decarboxylase phân cắt phân tử lyzine tạo thành diamine
Trong diamine có 2 nhóm amoni làm pH mơi trường tăng tạo màu tím đỏ (+)
• MIU
M: thì chúng ta sẽ dùng que cấy thẳng vào môi trường, nếu vi khuẩn mọc lan khỏi đường cấy thẳng thì VSV có tính di động
I: Indol đã được trình bày như trên bài E.coli
Ure: vi sinh vật có khả năng tạo enzyme urease phân giải ure tạo thành NH3
làm pH thay đổi, dùng thuốc thử phenol red nếu có màu hồng cánh sen thì phản ứng dương tính, màu vàng (-)
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa thạch cấy vào mơi trường thạch máu cừu
Tính kết quả Mẫu
Đồng nhất mẫu
Phân lập ( dàn đều 0,1ml dung dịch mẫu lên 2 đĩa môi trường MYP ủ 300C trong 24h
Đếm số khuẩn lạc điển hình
Khẳng định
BÀI 21: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUSTRONG THỰC PHẨM TRONG THỰC PHẨM
Nguyên tắc
Q trình phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm có thể được thực hiện theo phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc của Bacillus cereus trên môi trường phân lập MYP được xác định bằng các phản ứng sinh hóa đặc trưng
Báo cáo thực tập
Thử nghiệm MR-VP, đã được trình bày. Thử nghiệm Tyrosin và Lysozyme không được tiến hành. Trong bài này chỉ giải thích khả năng chuyển nitrat thành nitric NO3-
NO-2
• Cơ chế: vi khuẩn tạo enzyme reductase sẽ khử NO3- thành NO2-
• Khi cho thêm Gress A và Gress B, nếu tạo ra các hợp chất màu đỏ hồng là (+), hoặc khi thêm 2 chất đó vào, nếu khử NO2- thành N2 và thêm vào đó CH3COOH và Zn mà tạo ra khí H2 thì cũng là (+). Nếu khơng màu là (-)
3. Tại sao khi phân tích Bacillus aureus chỉ cần phân tích định tính
Vì trong 1 số tiêu chuẩn VN có quy định số vi khuẩn Bacillus aureus tối đa có mặt trong thực phẩm là 102. Số lượng rất nhỏ nên chỉ cần kiểm nghiệm định tính mà khơng cần kiểm tra định lượng.
Mẫu
Phân lập (Dàn đều 0,1ml dd mẫu lên 2 đĩa môi trường BP, ủ 370C, 24h-48h) Đồng nhất mẫu
Pha loãng
Đếm số khuẩn lạc điển hình
Khẳng định ( chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường)
Coagulase test( cho 0,1ml BHI vào 0,3 ml huyết tương thỏ ủ 370C/4-6h)
BÀI 22: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM
Nguyên tắc
Nguyên tắc xác định sự có mặt và định lượng số lượng của Staphylococcus Aureus
trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình ( chỉ định bởi sự khử của kali tellurite leicithin lịng đỏ trứng ) trên mơi trường phân lập Baird – Parker và phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương đỏ.
Báo cáo thực tập
1. Đặc tính và độc tố của Staphylococcus aureus
Đặc tính:
• Là tụ cầu khuẩn, gram (+), khơng di động và khơng sinh bào tử
• Phát triển ở pH mơi trường trung tính, nhiệt độ 370C
Độc tố: Chúng gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên da, trong cơ thể bằng cách tiết ra độc tố như hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoloatine, 5 độc tố ruột enterotocxine A, B, C, D, E.
2. Quy trình phân tích định lượng Sp.aureus
Trong bài thực hành này, chỉ được thực hành đến giai đoạn đếm khuẩn lạc điển hình.
BÀI 24: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENSTRONG THỰC PHẨM TRONG THỰC PHẨM
Nguyên tắc
Clostridium perfringens được phân tích bằng cách sử dụng mơi trường có chứa sắt
và sulphite. Khuẩn lạc mọc trên mơi trường có màu đen do phản ứng giữa S2- và Fe2+
Trả lời câu hỏi
1. Đặc tính sinh lý và gây bệnh của Clostridium perfringen
Vi khuẩn Clostridium perfingen là vi khuẩn tạo bào tử, gram (+), khơng chuyển động. Đa số sống kị khí, ưa nhiệt. Thủy phân mạnh protein và chuyển hóa acidmin tạo mùi khó chịu. Sinh độc tố trong thực phẩm và gây bệnh hoại tử vết thương
Triệu chứng ngộ độc: viêm ruột và dạ dày, đau bụng đi ngoài, phân lỏng hoặc tồn nước lẫn máu, thỉnh thoảng có nơn mửa. Thời gian ủ bệnh 12-24h
Motility
Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Lactose gelatine. Ủ trong điều kiện kị khí 370C/18-24h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường Motility Nitrate. Ủ trong điều kiện kị khí 370C/18-24h
Pha lỗng mẫu Mẫu
Làm đông thạch nhanh