Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm ĐH Bách Khoa TP.HCM

Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm ĐH Bách Khoa TP.HCM

- Thực hiện được kỹ thuật chuẩn bị các loại môi trường nuôi cấy khác nhau

- Sử dụng thành thạo các dụng cụ thiết bị trong thí nghiệm

- Các phương pháp bao gói cho từng dụng cụ cụ thể

2 Sơ lượt về lý thuyết:

2.1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh

2.1.1 Các yêu cầu về phòng về phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm vi sinh:

Mỗi nơi khác nhau về mức độ vệ sinh để không nhiễm chéo

Không khí, ánh sáng, gió chừng mực thông thoáng chừng mực, di chuyển không làm xáo động không khí

Phòng kiểm nghiệm thường được chia thành các khu vực riêng biệt như:

- Khu nhận thu mẫu và lưu mẫu

- Khu rửa, khử trùng dụng cụ, tủ ấm

- Khu bảo quản hoá chất

- Khu chuẩn bị môi trường

- Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu

- Khu vực thao tác, xử lý mẫu vi sinh vật

Hạn chế hoặc không sử dụng quạt trong phòng Tránh để các hoá chất, môi trường tiếp xúc trực tiếp ánh sáng mặt trời Khu pha chế hoá chất riêng biệt sẽ tốt hơn

2.1.2 Sổ nhật ký thí nghiệm:

Ghi nhận lại sau mỗi lần kiểm nghiệm, thí nghiệm để theo dõi kết quả và theo dõi mẫu thí nghiệm:

- Ngày tháng tiến hành, ngày kết thúc

- Tên thí nghiệm, tên mẫu

- Tên người thực hiện, theo dõi

2.1.3 Lưu ý về quy cách an toàn thí nghiệm:

Cần tuân thủ 1 số điểu như sau:

- Mặc đồ bảo hộ: áo blouse, khẩu trang, bao tay, mắt kính,… khi làm việc với vi sinh vật có hại

- Không ăn uống trong phòng thí nghiệm

- Bề mặt làm việc cần sát trùng bằng khăn giấy tẩm cồn 70o , hoặc bằng dung dịch sát khuẩn lysol 5%, amphyl 10% , chlorox 10%, để khô

- Sát khuẩn tay tương tự

- Sử dụng đèn cồn hoặc đèn Busen để tiệt trùng không khí, không gian thao tác thí nghiệm và dụng cụ thí nghiệm

- Ghi thông tin cần thiết lên ống nghiệm, petri, bình nuôi cấy

- Khi bị đổ, nhiễm vi sinh vật thì thực hiện lau, sát trùng lại bề mặt làm việc

- Không dùng mũi ngửi, hít các mẫu vi sinh vật trong đĩa petri

- Đầu tóc cần gọn gàng khi thực hiện thí nghiệm

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị:

Dụng cụ và thiết bị cần thiết: tủ sấy, nồi tiệt trùng, tủ ấm, cân, pH kế, nhiệt kế, kính hiển vi, máy cất nước, máy đếm, máy lắc vortex, bể điều nhiệt

Tủ cấy vô trùng cần được tiệt trùng Các cách đẻ tiệt trùng tủ cấy là bằng hoá chất, đèn

tử ngoại UV, bơm khử trùng qua màng lọc

Dụng cụ: que cấy, đèn cồn hoặc đèn Busen, đĩa petri, ống nghiệm, lame kính và lamelle, buồng đếm khuẩn lạc, máy đếm khuẩn lạc

2.2 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc:

Các phương pháp tiệt trùng :

- Nhiệt: chế độ 170oC – 2 giờ dành cho vi sinh vật ưa nhiệt, vi sinh vật ưa ấm thì chế

độ nhiệt 63o

C – 30 phút hoặc 72oC – 20 phút Tiệt Trùng ở 121oC – 30 phút thì cả bào tử và tế bào sinh dưỡng đều chết

- Quang học: tia X, Gamma, tử ngoại

2.3.2 Phân loại:

- Phân loại theo trạng thái lý hóa:

 Môi trường lỏng: thường dùng để nhân giống, nghiên cứu, tổng hợp vi sinh vật, môi trường này không chứa agar hay gelatin…

 Môi trường rắn(môi trường đặc): cho một lượng agar (1.5-2%) hay 20%) vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường, thường dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý vi sinh vật

gelatin(10- Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn (0.3-0.7% agar), thường dùng cho việc xác định khả năng chuyển động của vi sinh vật…

- Phân loại theo thành phần:

 Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác…

 Môi trường tự nhiên: thành phần hóa học của môi trường không được xác định chính xác do sự không ổn định của các sản phẩm tự nhiên Môi trường có độ lặp lài tùy thuộc nhà sản xuất Một số môi trường: pepton, cao thịt…

 Môi trường hòa tan chuẩn bị sắn: môi trường do nhà sản xuất pha sẵn dưới dạng bột, chỉ cần hòa tan với một hàm lượng nước nhất định là có thể sử dụng

- Phân loại theo công dụng:

 Môi trường cơ bản

 Môi trường chọn lọc

 Môi trường kiểm định

2.3.3 Nguyên tắc tạo môi trường dinh dưỡng:

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật

- Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường

- Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật

2.3.4 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng:

- Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

Cân, đong các thành phần môi trường

Cho vào bình erlen có nút bông, lắc đều

Đặt vào lò microwave điều chỉnh nhiệt độ thời gian 30 giây - 1 phút

Rót môi trường vào ống nghiệm có nút bông (ống nghiêng – ¼ ống, ống đứng – ½ ống)

Đặt các ống nghiệm vào bao chịu nhiệt

Tiệt trùng bằng nồi Autoclave ở 121oC – 15 (20) phút

Để nguội ống thạch nghiêng thì để nằm nghiêng sao cho đỉnh thạch cách bông 1,5 – 2 cm, đặt ống nghiệm đứng vào giá để định hình

- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

Yêu cầu đối với làm nút bông:

- Nút có kích thước, độ chặt vừa phải

- Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm

- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

Yêu cầu đối với bao gói:

- Phần giấy bao gói phải chặt kín

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng

- Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri phải dùng giấy bao kín toàn bộ

Bài 2:

KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT

1 Mục tiêu:

- Thực hành kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Đối tượng cụ thể thực hành là nấm men

- Kỹ thuật cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: Cấy ria từ ống giống sang ống môi trường thạch nghiêng

2 Sơ lượt lý thuyết:

2.1 Gieo cấy vi sinh vật

 Khái niệm:

Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết cho nghiên cứu Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn hay tủ cấy

 Mục đích :dùng cho việc nuôi cấy, giữ giống và phân lập giống vi sinh vật

Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng cần khảo sát nhằm mục đích nhân giống

Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc nhằm mục đích giữ giống Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc để giữ giống nghiên cứu đặc tính vi sinh vật

 Nguyên lý:

Vi sinh vật được cấy từ môi trường này sang môi trường khác, đảm bảo trong khi cấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật đang mong muốn với các loại vi sinh vật không mong muốn từ bên ngoài

 Các dung dich gieo cấy:

Loại rắn – lỏng, rắn, lỏng hoặc bán rắn

 Dụng cụ thí nghiệm cần thiết:

Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn hoặc đèn busen

2.2 Các dụng cụ

2.2.1 Các loại que cấy

- Que cấy thẳng: có đầu nhọn, dùng để cấy điểm thường dùng cho nhóm vi sinh vật yếm khí

- Que cấy móc: có đầu vuông góc dùng để cấy mốc (vi sinh vật có hệ khuẩn ty)

- Que cấy đầu tròn: dùng đế cấy vi sinh vật từ môi trường rắn lên môi trường rắn trên đĩa petri, thạch nghiêng

2.2.2 Dụng cụ bằng thuỷ tinh:

Que trang: dùng để trải chủng vi sinh vật từ môi trường rắn, lỏng sang môi trường rắn trên hộp petri

2.2.3 Dụng cụ khác:

Tăm bông, pipet, micropipette

2.3 Các phương pháp cấy chuyền

2.3.1 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:

Mục đích: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí

Sử dụng que cấy đầu tròn thao tác

Ống thạch nghiêng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệt trùng

2.3.2 Phương pháp cấy trên thạch đứng:

- Mục đích: dùng để cấy các vi sinh kỵ khí

- Sử dụng que cấy đầu kim để thao tác

- Ống thạch đứng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệt trùng

- Nút bông chỉ hơ gần ngọn lửa, không quá gần vì gây cháy bông

- Cách làm nguội đầu que cấy khi lấy sinh khối: ở cuối ống nghiệm giống sẽ có

1 ít nước do vi sinh vật thải, đưa đầu que cấy vào giọt nước đó để làm nguội

3 Thực hành:

Cấy nấm men ống thạch nghiêng theo hình chữ chi

Hình vẽ các bước thao tác cấy ống thạch nghiêng:

a Tay trái cầm 2 ống nghiệm giống

và ống môi trường

b Tay phải cầm que cấy, nung đỏ đầu que cấy trên ngọn lửa, sau đó hơ hết đến

phần kim loại

c Dùng ngón út và áp út lấy nút bông Có thể hơ nút bông gần ngọn lửa đèn cồn

d Hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn

e Đưa đầu que cấy vào cuối ống giống, làm người bằng giọt nước ngưng, gạt 1 ít sinh khối nấm men

f Chuyển đầu que cấy sang ống thạch nghiêng, từ cuối đáy ống, quệt sinh khối theo hình chữ chi trên bề mặt thạch

g Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn

h Hơ nút bông gần ngọn lửa đèn cồn và gắn lại vào miệng 2

ống nghiệm

i Tiệt trùng lại que cấy tương tự bước b

4 Kết quả thí nghiệm và nhận xét

Mẫu ống nghiêng cấy nấm men không bị nhiễm Trong 2 ống có 1 ống sinh khối nấm men theo hình chữ chi đều hơn, ống còn lại có 1 chút đứt đoạn

Nhận xét:

- Do thao tác cấy hình chữ chi ông thứ 2 hơi chệch hơn so với ống thứ 1

- Thao tác vô trùng không tốt nên để tạp nhiễm trong quá trình phân lập

- Cấy đều tay để thu đƣợc vết cấy đều và đẹp

- Mọi thao tác cần nhanh, gọn và phải thực hiện ngay trên ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm tạp

- Tránh làm rách bề mặt thạch trong quá trình gieo cấy và phân lập

1.2 Mục đích của định lượng vi sinh vật:

- Xác định số vi sinh vật/1 đơn vị khối lượng canh trường

- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây nhiễm, độc

- Chuẩn bị cho các quá trình trong sản xuất

- Kiểm tra các canh trường trong quá trình sản xuất

2 Sơ lượt lý thuyết:

Phương pháp gián tiếp: từ canh trường  gieo cấy môi trường mới  phân lập

đĩa petri , tạo khuẩn lạc riêng biệttạo tiêu bản  soi kính hiển vi

2.1.3 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:

Phương pháp đổ đĩa:

Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng trộn đều với môi trường agar nóng chảy, đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, sẽ xuất hiện các khuẩn lac riêng lẽ, thuần chủng

Phương pháp trải đĩa:

Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng được dàn trải đều trên bề mặt petri có môi trường thích hợp

Phương pháp cấy ria:

Nguyên lý: 1 lượng sinh khối được ria nhiều lần trên bề mặt thạch hộp petri Sau mỗi lần ria, các sinh khối vi sinh vật sẽ dần hình thành các khuẩn lạc riêng lẽ

2.2 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch:

- Là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu

- Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng

- Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết nên độ chính xác kém

- Ưu điểm: chỉ đếm những tế bào còn sống nên kết quả chính xác hơn

- Nhược điểm: Tốn thời gian, công sức, không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép đồng thời tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển, độ pha loãng chênh lệch nhau 10 lần nhưng số lương vi sinh vật không lệch nhau 10 lần

2.2.4 Một số phương pháp định lượng gián tiếp:

- Đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

- Phương pháp lắng của Omelianxki

3 Thực hành:

3.1 Phân lập bằng phương pháp trải đĩa

Tháo bao petri vô khuẩn,

hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn

Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp petri

Xoay đều Để thạch đông lại

Dùng pipet cho 0,2 mL ở ống nghiệm 10-3 (10-4) vào giữa đĩa

Tiệt trùng que trang bằng cồn 70o, đốt nóng, để nguội

Dàn đều mẫu trên bề mặt thạch

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngƣợc hộp petri, bao gói

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28-300C), trong vòng 48-72 giờ

Pha loãng từng mẫu theo độ loãng: 10-1, 10-2 ,10-3 , 10-4

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt

3.2 Phương pháp cấy ria trên hộp petri:

Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng hỗn hợp vsv cần phân

Tiếp tục thao tác trên với phần tƣ thứ ba và thứ tƣ

Lật ngƣợc, bao gói hộp petri và nuôi tủ ấm trong 48 giờ

Lưu ý:

- Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn

- Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tư khác nhau

3.3 Phương pháp đổ đĩa:

Lưu ý:

- Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn

- 5 ống nghiệm chứa 9mL + bông + giấy và erlen 95mL nước cất sau đó hấp tiệt trùng 121o C vào khoảng 15-20 phút

Tháo bao petri vô khuẩn,

hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn

Đổ thạch rã đông (45-50o

C) vào trong hộp petri

Xoay đều Để thạch đông lại

Dùng pipet cho 1mL ở ống nghiệm 10-3 (10-4) vào petri

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngƣợc hộp petri, bao gói

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28-300C), trong vòng 48-72 giờ

Pha loãng từng mẫu theo độ loãng: 10-1, 10-2 ,10-3 , 10-4

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt

4 Kết quả và nhận xét:

Phần phân lập do thao tác vô trùng không tốt nên bị nhiễm Tuy nhiên khuẩn lạc lên đều, đẹp, không dính vào nhau Khi cấy thực hiện đúng kỹ thuật, vô trùng tốt và tắt quạt

Phương pháp cấy nghiêng đơn giản và dễ thực hiện Tuy nhiên nó chỉ thích hợp trong thí nghiệm, nghiên cứu với quy mô nhỏ Muốn cấy với một số lượng lớn ta có thể dùng phương pháp cấy trộn trên đĩa Petri

Trong thực hành, do mẫu với độ pha loãng 10-5 quá ít vi sinh vật nên chỉ thực hiện phân lập với độ pha loãng 10-3 và 10-4

Định lượng số lượng vi sinh vật

Hộp petri có số khuẩn lạc nằm trong khoản 25-250 khuẩn lạc để tính kết quả theo công thức:

Hộp có độ pha loãng 10-3: 147 khuẩn lạc

Hộp có độ pha loãng 10-4: 35 khuẩn lạc

( ) =

( ) = 165454 (tổng số vsv/ml) Trong đó:

⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn

n1, n2, n3: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp

d: hệ số pha loãng của độ pha loãng đầu

5 Ứng dụng:

Gieo cấy thường được sử dụng trong bảo quản và giữ giống Tiến hành nuôi cấy

một số chủng vi sinh vật hữu ích như B.thuringiensis, Rhizobium để quan sát khả năng

phát triển tốt của các loài vi sinh vật này trên môi trường bùn thải của nhà máy bia (với nồng độ của bùn thải là 20 g MLSS/L) nhằm tận dụng nguồn môi trường từ bùn thải sinh học từ các nhà máy

Phân lập để nghiên cứu tính chất và ứng dụng của vi sinh vật Ví dụ: Phân lập và

xác định 10 chủng vi khuẩn B.subtilis sau đó khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi

cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ)

đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn B.subtilis thì xác định chế

độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn

Hay phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh acid lactic cao

từ các sản phẩm lên men

Bài 4:

QUAN SÁT VI SINH VẬT

1 Mục tiêu:

- Sử dụng kính hiển vi để quan sát tế bào vi sinh vật

- Làm tiêu bản sống để quan sát trên kính hiển vi

- Quan sát hình thái vi sinh vật

- Mô tả cấu tạo, chức năng mỗi bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi

2 Sơ lược về lý thuyết:

Có 2 loại tiêu bản dùng cho quan sát trên kính hiển vi: Tiêu bản sống và tiêu bản chết

2.1 Tiêu bản sống:

Tiêu bản sống dùng cho quan sát tế bào nấm men, vi khuẩn, nấm mốc

Ưu điểm: Quan sát được hình thái TB vi sinh vật, chất lượng, hình thái sinh sản của

loài vi sinh vật không chuyển động Phân biệt được tế bào sống chết nên chính xác hơn

về kết quả

Nhược điểm: Không phân biệt được bào tử và tế bào sinh dưỡng

Tiêu bản sống có 2 dạng là tiêu bản sống kiểu giọt ép và kiểu giọt treo

2.1.1 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt ép:

- Lame kính đem nhúng sát trùng bằng cồn và đốt ở ngọn lửa ở cồn 70oC

- Lá kính sát trùng bằng cồn 70oC, làm nguội gần vùng nóng của đèn cồn (không đốt trực tiếp bằng lửa cồn vì sẽ gây vỡ)

- Nhỏ 1 giọt dịch canh trùng vi sinh vật lên lame kính

- Đăt lá kính xuống lame kính theo 1 góc 45o, tránh tạo bọt khí

- Sử dụng giấy thấm để hút nước làm khô phần rìa của các lá kính

 Mục đích: quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật

 Ưu điểm: nhanh, gọn, dễ quan sát

 Nhược điểm: không quan sát được trong thời gian lâu (<15 - 20 phút)

2.1.2 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt treo:

Dùng một phiến kính đặc biệt có lõm hình tròn ở giữa, bôi vasellin quanh phần lõm của lam kính, cho 1 giọt canh trường lên giữa lam men, Thận trọng xoay ngược lam kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lam men lên lam kính sao cho giọt canh trường “treo” trong không gian lõm của phiến kính Không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của lam kính

 Mục đích: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động

và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học

 Ưu điểm: tiêu bản giữ được lâu hơn, quan sát dễ dàng hơn, nhờ đó có thể quan

sát phương thức chuyển động của vi sinh vật

 Nhược điểm: khó làm

2.2 Tiêu bản chết:

Dùng quan sát các vi sinh gây bệnh

 Ưu điểm: Tương đối an toàn cho người thực hiện quan sát trên kính hiển vi

 Nhược điểm: Không quan sát được hình thức sinh sản của vi sinh vật

Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh được sử dụng tiêu bản chết để quan sát là E.coli, Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)

2.3 Cấu tạo, chức năng từng bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi:

2.3.1 Kính hiển vi điện tử

Thao tác sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát:

1) Làm tiêu bản (lame và lamelle)

2) Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh khẩu độ để ánh sáng chiếu đều thị trường

3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước

4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ hình ảnh mẫu vật

5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không đụng lame là được Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh

6) Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại x90, x100 nên sử dụng vật kính dầu để giảm

sự tán sắc của ánh sáng khi đi qua lame và lamelle để vào vật kính Dùng vật kính

có độ phóng đại nhỏ để xác định vị trí cần tìm trên tiêu bản như phần trên Nhỏ một giọt dầu cede lên tiêu bản Đổi vật kính sang độ phóng đại lớn (x90, x100) Nhúng đầu vật kính chìm vào giọt dầu Điều chỉnh ốc vi chỉnh nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh của mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu

7) Độ phóng đại = thị kính (x10 = const) * vật kính (soi thô: x10, x40 hay soi dầu: x90, x100)

2.3.2 Kính hiển vi quang học dùng gương:

Hình vẽ cấu tạo của kính hiển vi quang học dùng gương

Thao tác sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát:

1) Làm tiêu bản

2) Quay gương về phía nguồn sáng mạnh nhất đã chọn (dùng mặt phẳng của gương nếu ánh sáng mạnh, dùng mặt lõm của gương nếu ánh sáng yếu) ,mắt nhìn qua lỗ trên mâm kính nếu thấy trên hộp tụ quang có 1 chùm sánh sáng mạnh là đạt yêu cầu Xoay vật kính 10, nhìn vào thị kính thấy vi trường sáng tròn đều là được Nếu chưa tròn đều thì dùng tay điều khiển gương sao cho vi trường sáng tròn đều 3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước

4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõ hình ảnh mẫu vật

5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho không đụng lame là được Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉ dùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh

6) Ngoài ra, kính hiển vi quang học còn có dạng dùng nguồn sáng là từ bóng đèn, vì thế kính hiển vi sẽ có thêm các bộ phận như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng

3 Tiến hành thí nghiệm:

Thực hiện quan sát các tế bào vi sinh vật trên kính hiển vi điện tử gồm : Nấm men, vi

khuẩn Bacillus subtilis, vi khuẩn lên men lactic dưa chua

4 Nhận xét và bàn luận kết quả thí nghiệm:

Trong 3 mẫu vi sinh vật quan sát:

- Mẫu nấm men dễ quan sát thấy và dễ nhận biết nhất do kích thước chúng khá lớn hơn 2 mẫu vi khuẩn còn lại Đặc biệt là các chồi con mọc trên thân của tế bào nấm men

- Mẫu vi khuẩn lên men lactic dưa chua: khá khó trong việc quan sát, nhưng có thể nhận biết được do hình dạng chúng là dạng dài

- Mẫu vi khuẩn Bacillus subtilis là khó quan sát nhất, nhỏ và di chuyển

5 Ứng dụng

- Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh được sử dụng tiêu bản chết để quan sát là

E.coli, Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)

Bài 5: QUAN SÁT TẾ BÀO NẤM MEN VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

1 Mục đích:

- Đánh giá chất lượng của canh trường

- Quan sát lượng tế bào nấm men nảy chồi

- Quan sát tỷ lệ nấm men sống và chết

- Thực hành đếm số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm

2 Cơ sở lý thuyết:

2.1 Nấm men có hình thái thay đổi trong quá trình phát triển:

Giai đoạn 1: Nấm men trẻ (12-16h nuôi cấy): nảy chồi ít, tế bào chất đồng nhất, màng mỏng, không bào chưa có hoặc mới xuất hiện

Giai đoạn 2: Nấm men trưởng thành (24-48h nuôi cấy): Kích thước điển hình, không bào lớn,tế bào nảy chồi nhiều

Giai đoạn 3: Nấm men già (sau 72h nuôi cấy), tế bào chết xuất hiện nhiều, tế bào

có hình dạng teo lại, màng tế bào ngoài nhăn nheo, nguyên sinh chất không đồng nhất

2.2 Nguyên tắc đếm tế bào nấm men chết:

- Tế bào nấm bào nấm men chết dễ bắt màu hơn tế bào sống

- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn đi qua màng tế bào sống

- Dùng Methylene Blue ( đã pha loãng 10 lần) để nhuộm màu tế bào

3 Tiến hành thí nghiệm:

3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá sơ bộ chất lượng của canh trường nấm men

- Đánh giá mức độ nhiễm của canh trường và giai đoạn phát triển của nấm men

- Trên lame kính nhìn qua kính hiển vi theo 5 điểm như hình vẽ:

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 10 lần)

Làm tiêu bản

Quan sát 5 điểm trên lame kính và

nhận xét về chất lượng canh trường

3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát lượng nấm men nảy chồi

- Nếu có 70-80% lượng tế bào nảy chồi  phát triển mạnh

- Nếu có dưới 2% lượng tế bào nảy chồi  đang chết, già

- Quan sát 5 điểm như trên hình và đếm số lượng tế bào của mỗi điểm

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 10 lần)

3.3 Thí nghiệm 3: Quan sát và đếm lượng tế bào nấm men chết

Sơ đồ khối tiến hành

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 100 lần)

Trộn canh trường và 1 giọt methylene blue trên lame

Làm tiêu bản

Quan sát 5 điểm ở lame kính, đếm số tế bào chết ở mỗi vị trí và tổng số tế bào có mặt

3.4 Thí nghiệm 4: Đếm số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm

Các vị trí chọn để đếm số tế bào trên 1 ô buồng đếm

1 Gắn lamelle kính lên buồng đếm

2 Dùng ống nhỏ giọt nhỏ canh trường nấm men vào khe buồng đếm

3 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi và quan sát

Nhận xét ở thí nghiệm 2, 3: Kết quả đếm có thể không đúng do chỉ đếm theo số tương

đối, sai sót trong các vùng đếm khi mật độ nấm men khá lớn

Tính toán kết quả: Dựa từ công thức (1)

Ta có được số tế bào nấm men có trong 1mL mẫu ban đầu:

N=

số tế bào/mL

5 Ứng dụng:

Nấm men bánh mì: Saccharomices cerevisiae được sử dụng nhằm tạo ra CO2 làm

nở cấu trúc khối bột đồng thời tạo ra các cấu tử tạo hương trong quá trình trao đổi chất của nó

Một ứng dụng mới là người ta sử dụng Saccharomices cerevisiae đã được thay đổi

cấu trúc di truyền để sản xuất các loại protein con người nhờ vào đó người ta có thể

tìm ra nguyên tắc hoạt động của các loại thuốc chứa hoạt chất sulfasalazine (trong thuốc chữa bệnh viêm ruột, viêm đa khớp) và tượng tác phản ứng giữa protein và sulfasalazine

Saccharomices cerevisiae kết hợp với vi khuẩn butyric tạo ra hương thơm mạnh và

đặc trưng trong sản xuất rượi Rum

Saccharomyces carlbergeois lên men bia – kiểu lên men chìm thường để sản xuất

bia có độ cồn thấp và bia vàng Sử dụng nấm men chìm để sản xuất bia sẽ tốn thời gian hơn nhưng bia thu được trong hơn đống thời nấm men dễ lọc và dễ thu hồi để sử dụng hơn

Sản xuất acid citric bằng cách lên men dung dịch được hay một số môi trường

thích hợp bằng chủng Candida spp

S.boulardii là loại nấm men có lợi cho đường ruột, chúng được sử dụng để chữa trị

tiêu chảy, giúp giữ cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, thường dùng để trị rối loạn tiêu hóa

BÀI 6:

QUAN SÁT VI KHUẨN

1 Mục đích thí nghiệm:

- Quan sát, nhận xét về các đặc điểm cụ thể của từng loại vi khuẩn

- Nắm được cách nhuộm gram tiêu bản

- Rèn luyện thêm kỹ năng làm tiêu bản giọt ép

2 Sơ lược lý thuyết:

Một số loại thuốc nhuộm:

Thuốc nhuộm Fuchsin:

 Dunh dịch 1: rượu etylic 960: 10ml và Fuchsin kiềm 0.3g

 Dung dịch 1: Gentian violet 1g, rượu etylic 960 10ml

 Dung dịch 2: phenol tinh khiết 5g, nước cất 1000ml

 Dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan hết gentian violet trong rươu

 Trộn 2 dung dịch rồi lọc trong

 Để dịch lọc trong lọ màu

Dung dịch lugol

 Iod tinh thể 1g, KI 2g, nước cất 300ml

 Hòa KI vào trong 5ml nước cất cho tan hết rồi cho iod tinh thể vào

 Bổ sung đủ 300ml nước sau khi iod tan hết

Yêu cầu đối với thuốc nhuộm:

 Không độc đối với vi khuẩn

 Khi nhuộm đơn nên sử dụng thuốc thử ở nồng độ thấp để đảm bảo vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu

2.2 Quan sát ở trạng thái sống:

- Làm tiêu bản giọt ép

- Nhuộm màu (nhuộm đơn) tiêu bản, sử dụng thuốc nhuộm xanh metylen 0.001%

2.3 Quan sát vi khuẩn ở trạng thái chết:

Nhuộm màu đơn: chỉ sử dụng một màu làm thuốc nhuộm

 Gồm nhuộm màu dương bản và nhuộm màu âm bản

 Quan sát hình dạng, độ lớn, cách sắp xếp hoặc đế, tế bào dễ dàng hơn

Nhuộm phức: sử dụng từ 2 thuốc nhuộm màu trở lên

Gồm nhuộm Gram, nhuộm nha bào, nhuộm tiêm mao

Nguyên tắc:

- Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các thành phần khác nhau của một cấu trúc thướng có tính chất lý học, hóa học cũng như khả năng bắt màu khác nhau

- Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép

ta có thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn

 Loại phức chất không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử

lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật thuộc loại gram

âm

Cách nhuộm Gram sử dụng hai màu khác nhau để phân biệt tế bào vi khuẩn Gram (+)

và Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có thành tế bào dày (nhiều lớp peptidoglycan) Vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng và lớp lipopoly-saccharide

Một số chú ý trong quá trình nhuộm Gram:

 Khi cố định vi khuẩn lên phiến kính tránh hơ quá nóng vì có thể làm vỡ tế bào, biến dạng tế bào

 Lớp tế bào trên phiến kính quá dày làm cho quá trình nhuộm màu không tốt hay quá trình tẩy màu bằng ethanol không tốt

 Thời gian tẩy màu bằng ethanol là quan trọng: nếu thời gian tẩy màu quá ngắn

sẽ làm cho vi khuẩn Gram (-) sẽ thể hiện như vi khuẩn Gram (+), ngược lại nếu

thời gian tẩy màu quá dài sẽ làm cho vi khuẩn Gram (+) thể hiện như vi khuẩn Gram (-)

 Dung dịch iod có thể phân hủy nếu để lâu

 Tế bào già thường không bắt màu chính xác

2.5 Đặc điểm của vi khuẩn quan sát:

Bacillus subtilis là trực khuẩn, hai đầu tròn, gram (+), chiều rộng 0.5-0.8µm, chiều

dài 1.8-3µm, xuất hiện riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, di động Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…

E.coli là trực khuẩn gram (-), kích thước trung bình từ 2-3µm x 0.5µm, trong

những điều kiện không thích hợp (môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sơi chỉ Hầu hết chúng đều không có vỏ, có lông và có khả năng di động

Lactobacillus brevis là trực khuẩn gam (+), 2 đầu tròn, kích thước từ 0,7 - 1µm x 2

- 4 µm, tồn tại dạng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, không hoặc hiếm di động

Lactobacillus là nhóm trực khuẩn gam (+), hình que, không sinh bào tử, tồn tại thành dạng riêng lẻ hoặc thành chuỗi, hiếm khi di động

3 Tiến hành thí nghiệm:

3.1 Quan sát hình thái trạng thái sống

Tiến hành làm tiêu bản giọt ép và quan sát hình thái trên kính hiển vi

3.2 Quan sát ở trạng thái chết

Tiến hành nhuộm gram vi khuẩn E.coli

Các bước tiến hành nhuộm gram

4 Kết quả và nhận xét

4.1 Thí nghiệm 1: Quan sát tế bào vi khuẩn

 Nhận xét: Khá khó để quan sát vi khuẩn này vì khá nhỏ so với độ phân giải 40x

Chúng có khả năng di chuyển

Bacillus subtilis