Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm Đại Học Bách Khoa TP.HCM

6.3 Các phương pháp cấy chuyền 6.3.1 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: Mục đích: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí Sử dụng que cấy đầu tròn thao tác Ống thạch nghiêng được

MỤC LỤC

Bài 1: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

1 Mục đích bài: 1

2 Sơ lượt về lý thuyết: 1

2.1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh 1

2.1.1 Các yêu cầu về phòng về phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm vi sinh: 1

2.1.2 Sổ nhật ký thí nghiệm: 1

2.1.3 Lưu ý về quy cách an toàn thí nghiệm: 2

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị: 2

2.2 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc: 2

2.3 Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2

2.3.1 Khái niệm: 2

2.3.2 Phân loại: 3

2.3.3 Nguyên tắc tạo môi trường dinh dưỡng: 3

2.3.4 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng: 3

3 Tiến hành thí nghiệm: 4

3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Hansen dùng cho phân lập, nuôi cấy nấm men 4 3.2 Các bước tiến hành 4

4 Kết quả và nhận xét 5

5 Ứng dụng 5

Bài 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT 1 Mục tiêu: 6

2 Sơ lượt lý thuyết: 6

2.1 Gieo cấy vi sinh vật 6

2.2 Các dụng cụ 7

2.2.1 Các loại que cấy 7

2.2.2 Dụng cụ bằng thuỷ tinh: 7

2.2.3 Dụng cụ khác: 7

2.3 Các phương pháp cấy chuyền 7

2.3.1 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: 7

2.3.2 Phương pháp cấy trên thạch đứng: 8

2.4 Các thao tác cần lưu ý: 8

3 Thực hành: 8

4 Kết quả thí nghiệm và nhận xét 11

Bài 3: KỸ THUẬT PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VÂT 1 Mục đích: 12

1.1 Mục đích của phân lập: 12

1.2 Mục đích của định lượng vi sinh vật: 12

2 Sơ lượt lý thuyết: 12

2.1 Phương pháp phân lập: 12

2.1.1 Khái niệm 12

2.1.2 Phân loại 12

2.1.3 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật: 12

2.2 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch: 13

2.2.1 Khái niệm: 13

2.2.2 Phương pháp định lượng: 13

2.2.3 Một số phương pháp định lượng trực tiếp: 13

2.2.4 Một số phương pháp định lượng gián tiếp: 13

3 Thực hành: 14

3.1 Phân lập bằng phương pháp trải đĩa 14

3.2 Phương pháp cấy ria trên hộp petri: 16

3.3 Phương pháp đổ đĩa: 17

4 Kết quả và nhận xét: 19

5 Ứng dụng: 19

Bài 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT 1 Mục tiêu: 21

2 Sơ lược về lý thuyết: 21

2.1 Tiêu bản sống: 21

2.1.1 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt ép: 21

2.1.2 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt treo: 22

2.2 Tiêu bản chết: 23

2.3 Cấu tạo, chức năng từng bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi: 23

2.3.1 Kính hiển vi điện tử 23

2.3.2 Kính hiển vi quang học dùng gương: 24

3 Tiến hành thí nghiệm: 26

4 Nhận xét và bàn luận kết quả thí nghiệm: 26

5 Ứng dụng 26

Bài 5: QUAN SÁT TẾ BÀO NẤM MEN VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM 1 Mục đích: 27

2 Cơ sở lý thuyết: 27

2.1 Nấm men có hình thái thay đổi trong quá trình phát triển: 27

2.2 Nguyên tắc đếm tế bào nấm men chết: 27

3 Tiến hành thí nghiệm: 28

3.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá sơ bộ chất lượng của canh trường nấm men 28

3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát lượng nấm men nảy chồi 29

3.3 Thí nghiệm 3: Quan sát và đếm lượng tế bào nấm men chết 30

3.4 Thí nghiệm 4: Đếm số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm 31

4 Kết quả thí nghiệm và nhận xét: 33

4.1 Thí nghiệm 1: 33

4.2 Thí nghiệm 2: 33

4.3 Thí nghiệm 3: 34

4.4 Thí nghiệm 4: 34

5 Ứng dụng: 34

Bài 6: QUAN SÁT VI KHUẨN 1 Mục đích thí nghiệm: 36

2 Sơ lược lý thuyết: 36

2.1 Thuốc nhuộm: 36

2.2 Quan sát ở trạng thái sống: 37

2.3 Quan sát vi khuẩn ở trạng thái chết: 37

2.4 Cách nhuộm Gram: 37

2.5 Đặc điểm của vi khuẩn quan sát: 38

3 Tiến hành thí nghiệm: 38

3.1 Quan sát hình thái trạng thái sống 38

3.2 Quan sát ở trạng thái chết 38

4 Kết quả và nhận xét 40

4.1 Thí nghiệm 1: Quan sát tế bào vi khuẩn 40

4.2 Thí nghiệm 2: Nhuộm gram 44

5 Ứng dụng: 46

5.1 Quy trình thu thập lấy mẫu thực phẩm xét nghiệm chỉ tiêu vi sinh 46

5.2 Ứng dụng của các loại vi khuẩn trên 48

Bài 7: QUAN SÁT NẤM MỐC 1 Mục đích thí nghiệm: 49

2 Sơ lược lý thuyết: 49

2.1 Đặc điểm hình thái: 49

2.2 Đặc điểm sinh lý: 49

2.3 Phân biệt bốn loại nấm mốc điển hình: Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium: 50

2.3.1 Nhóm Mucor và Rhizopus: 50

2.3.2 Nhóm Aspergillus và Penicillium: 51

3 Tiến hành thí nghiệm 51

4 Kết quả và nhận xét 51

5 Ứng dụng 58

Bài 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DI HOÁ CARBOHYDRATE 1 Mục đích thí nghiệm: 59

2 Sơ lược lý thuyết: 59

2.1 Dị hóa: 59

2.2 Đồng hoá 60

2.3 Các loại enzyme của vi sinh vật 60

2.4 Đặc điểm môi trường nuôi cấy: 60

3 Tiến hành thí nghiệm: 60

3.1 Chuẩn bị môi trường: 60

3.2 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng lên men, hô hấp 61

3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự thủy phân tinh bột 62

4 Kết quả và nhận xét 63

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hô hấp, lên men 63

4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng hô hấp, lên men 65

4.3 Nhận xét: 66

5 Ứng dụng: 66

Bài 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN 1 Mục đích thí nghiệm: 68

2 Sơ lược lý thuyết: 68

2.1 Phân loại các loại đường: 68

2.2 Quá trình lên men: 68

2.2.1 So sánh lên men hiếu khí và yếm khí: 68

2.2.2 Nguyên lý: 69

3 Tiến hành thí nghiệm: 70

3.1 Chuẩn bị môi trường: 70

4 Kết quả thí nghiệm và nhận xét: 70

5 Ứng dụng: 73

CÁC CÂU HỎI BÀN LUẬN, MỞ RỘNG CUỐI BÀI………74

- Thực hiện được kỹ thuật chuẩn bị các loại môi trường nuôi cấy khác nhau.

- Sử dụng thành thạo các dụng cụ thiết bị trong thí nghiệm

- Các phương pháp bao gói cho từng dụng cụ cụ thể

2 Sơ lượt về lý thuyết:

2.1 Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh

2.1.1 Các yêu cầu về phòng về phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm vi sinh:

Mỗi nơi khác nhau về mức độ vệ sinh để không nhiễm chéo

Không khí, ánh sáng, gió chừng mực thông thoáng chừng mực, di chuyển không làmxáo động không khí

Phòng kiểm nghiệm thường được chia thành các khu vực riêng biệt như:

- Khu nhận thu mẫu và lưu mẫu

- Khu rửa, khử trùng dụng cụ, tủ ấm

- Khu bảo quản hoá chất

- Khu chuẩn bị môi trường

- Khu vực thao tác nuôi cấy mẫu

- Khu vực thao tác, xử lý mẫu vi sinh vật

Hạn chế hoặc không sử dụng quạt trong phòng Tránh để các hoá chất, môi trường tiếpxúc trực tiếp ánh sáng mặt trời Khu pha chế hoá chất riêng biệt sẽ tốt hơn

2.1.2 Sổ nhật ký thí nghiệm:

Ghi nhận lại sau mỗi lần kiểm nghiệm, thí nghiệm để theo dõi kết quả và theo dõi mẫuthí nghiệm:

- Ngày tháng tiến hành, ngày kết thúc

- Tên thí nghiệm, tên mẫu

- Đối tượng thí nghiệm

- Phương pháp lựa chọn tiến hành

- Kết quả thu được

- Tên loài vi sinh vật

1

- Tên người thực hiện, theo dõi.

2.1.3 Lưu ý về quy cách an toàn thí nghiệm:

Cần tuân thủ 1 số điểu như sau:

- Mặc đồ bảo hộ: áo blouse, khẩu trang, bao tay, mắt kính,… khi làm việc với vi sinhvật có hại

- Không ăn uống trong phòng thí nghiệm

- Bề mặt làm việc cần sát trùng bằng khăn giấy tẩm cồn 70o , hoặc bằng dung dịchsát khuẩn lysol 5%, amphyl 10% , chlorox 10%, để khô

- Sát khuẩn tay tương tự

- Sử dụng đèn cồn hoặc đèn Busen để tiệt trùng không khí, không gian thao tác thínghiệm và dụng cụ thí nghiệm

- Ghi thông tin cần thiết lên ống nghiệm, petri, bình nuôi cấy

- Khi bị đổ, nhiễm vi sinh vật thì thực hiện lau, sát trùng lại bề mặt làm việc

- Không dùng mũi ngửi, hít các mẫu vi sinh vật trong đĩa petri

- Đầu tóc cần gọn gàng khi thực hiện thí nghiệm

2.1.4 Dụng cụ, thiết bị:

Dụng cụ và thiết bị cần thiết: tủ sấy, nồi tiệt trùng, tủ ấm, cân, pH kế, nhiệt kế, kínhhiển vi, máy cất nước, máy đếm, máy lắc vortex, bể điều nhiệt

Tủ cấy vô trùng cần được tiệt trùng Các cách đẻ tiệt trùng tủ cấy là bằng hoá chất, đèn

tử ngoại UV, bơm khử trùng qua màng lọc

Dụng cụ: que cấy, đèn cồn hoặc đèn Busen, đĩa petri, ống nghiệm, lame kính vàlamelle, buồng đếm khuẩn lạc, máy đếm khuẩn lạc

2.2 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc:

Các phương pháp tiệt trùng :

- Nhiệt: chế độ 170oC – 2 giờ dành cho vi sinh vật ưa nhiệt, vi sinh vật ưa ấm thì chế

độ nhiệt 63oC – 30 phút hoặc 72oC – 20 phút Tiệt Trùng ở 121oC – 30 phút thì cảbào tử và tế bào sinh dưỡng đều chết

- Quang học: tia X, Gamma, tử ngoại

- Sử dụng vi lọc: chỉ dùng cho vi sinh vật kích thước <0,2µm

2.3.2 Phân loại:

- Phân loại theo trạng thái lý hóa:

 Môi trường lỏng: thường dùng để nhân giống, nghiên cứu, tổng hợp vi sinh vật,môi trường này không chứa agar hay gelatin…

 Môi trường rắn(môi trường đặc): cho một lượng agar (1.5-2%) hay 20%) vào môi trường lỏng để làm đặc môi trường, thường dùng để nghiên cứuđặc điểm hình thái, sinh lý vi sinh vật

gelatin(10- Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn (0.3-0.7%agar), thường dùng cho việc xác định khả năng chuyển động của vi sinh vật…

- Phân loại theo thành phần:

 Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần được xác định vàđịnh lượng một cách cụ thể và chính xác…

 Môi trường tự nhiên: thành phần hóa học của môi trường không được xác địnhchính xác do sự không ổn định của các sản phẩm tự nhiên Môi trường có độ lặplài tùy thuộc nhà sản xuất Một số môi trường: pepton, cao thịt…

 Môi trường hòa tan chuẩn bị sắn: môi trường do nhà sản xuất pha sẵn dưới dạngbột, chỉ cần hòa tan với một hàm lượng nước nhất định là có thể sử dụng

- Phân loại theo công dụng:

 Môi trường cơ bản

 Môi trường chọn lọc

 Môi trường kiểm định

2.3.3 Nguyên tắc tạo môi trường dinh dưỡng:

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinhdưỡng của từng loại vi sinh vật

- Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vậtnên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường

- Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinhvật

2.3.4 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng:

- Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

Cân, đong các thành phần môi trường

Tiệt trùng bằng nồi Autoclave ở 121oC – 15 (20) phút

Đặt các ống nghiệm vào bao chịu nhiệt

Đặt vào lò microwave điều chỉnh nhiệt độ thời gian 30 giây - 1 phút

Rót môi trường vào ống nghiệm có nút bông(ống nghiêng – ¼ ống, ống đứng – ½ ống)

Cho vào bình erlen có nútbông, lắc đều

Để nguội ống thạch nghiêng thì để nằm nghiêng sao chođỉnh thạch cách bông 1,5 – 2 cm, đặt ống nghiệm đứng vàogiá để định hình

- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô.

- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vôtrùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

Yêu cầu đối với làm nút bông:

- Nút có kích thước, độ chặt vừa phải

- Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm

- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

Yêu cầu đối với bao gói:

- Phần giấy bao gói phải chặt kín

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng

- Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri phải dùng giấy bao kín toàn bộ

Bài 2:

KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT

1 Mục tiêu:

- Thực hành kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Đối tượng cụ thể thực hành là nấm men

- Kỹ thuật cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác: Cấy ria từ ốnggiống sang ống môi trường thạch nghiêng

6 Sơ lượt lý thuyết:

6.1 Gieo cấy vi sinh vật

 Khái niệm:

Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mụcđích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cầnthiết cho nghiên cứu Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từmôi trường này sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửađèn cồn hay tủ cấy

 Mục đích :dùng cho việc nuôi cấy, giữ giống và phân lập giống vi sinh vật.

Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng cần khảo sát nhằmmục đích nhân giống

Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc nhằm mục đích giữ giống.Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc để giữ giống nghiên cứu đặctính vi sinh vật

 Nguyên lý:

Vi sinh vật được cấy từ môi trường này sang môi trường khác, đảm bảo trong khicấy chuyền không làm nhiễm vi sinh vật đang mong muốn với các loại vi sinh vậtkhông mong muốn từ bên ngoài

 Các dung dich gieo cấy:

Loại rắn – lỏng, rắn, lỏng hoặc bán rắn

 Dụng cụ thí nghiệm cần thiết:

Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn hoặc đèn busen

6.2 Các dụng cụ

6.2.1 Các loại que cấy

- Que cấy thẳng: có đầu nhọn, dùng để cấy điểm thường dùng cho nhóm vi sinh vậtyếm khí

- Que cấy móc: có đầu vuông góc dùng để cấy mốc (vi sinh vật có hệ khuẩn ty)

- Que cấy đầu tròn: dùng đế cấy vi sinh vật từ môi trường rắn lên môi trường rắn trênđĩa petri, thạch nghiêng

6.2.2 Dụng cụ bằng thuỷ tinh:

Que trang: dùng để trải chủng vi sinh vật từ môi trường rắn, lỏng sang môi trườngrắn trên hộp petri

6.2.3 Dụng cụ khác:

Tăm bông, pipet, micropipette

6.3 Các phương pháp cấy chuyền

6.3.1 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:

Mục đích: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí

Sử dụng que cấy đầu tròn thao tác

Ống thạch nghiêng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệt trùng

6.3.2 Phương pháp cấy trên thạch đứng:

- Mục đích: dùng để cấy các vi sinh kỵ khí

- Sử dụng que cấy đầu kim để thao tác

- Ống thạch đứng được chuẩn bị trước, có gắn bông, nút giấy, được hấp tiệttrùng

- Nút bông chỉ hơ gần ngọn lửa, không quá gần vì gây cháy bông

- Cách làm nguội đầu que cấy khi lấy sinh khối: ở cuối ống nghiệm giống sẽ có

1 ít nước do vi sinh vật thải, đưa đầu que cấy vào giọt nước đó để làm nguội

7 Thực hành:

Cấy nấm men ống thạch nghiêng theo hình chữ chi

Hình vẽ các bước thao tác cấy ống thạch nghiêng:

a Tay trái cầm 2

ống nghiệm giống và

ống môi trường

b Tay phải cầm que cấy,

nung đỏ đầu que cấy trên

ngọn lửa, sau đó hơ hết đến

phần kim loại

c Dùng ngón út và áp út lấy nútbông Có thể hơ nút bông gầnngọn lửa đèn cồn

d Hơ miệng ống nghiệm quangọn lửa đèn cồn

e Đưa đầu que cấy vào cuối ốnggiống, làm người bằng giọt nướcngưng, gạt 1 ít sinh khối nấm men

f Chuyển đầu que cấy sang ống thạchnghiêng, từ cuối đáy ống, quệt sinh khốitheo hình chữ chi trên bề mặt thạch

g Hơ miệng ống nghiệm

8 Kết quả thí nghiệm và nhận xét

Mẫu ống nghiêng cấy nấm men không bị nhiễm Trong 2 ống có 1 ống sinh khốinấm men theo hình chữ chi đều hơn, ống còn lại có 1 chút đứt đoạn

Nhận xét:

- Do thao tác cấy hình chữ chi ông thứ 2 hơi chệch hơn so với ống thứ 1

- Thao tác vô trùng không tốt nên để tạp nhiễm trong quá trình phân lập

- Cấy đều tay để thu được vết cấy đều và đẹp

- Mọi thao tác cần nhanh, gọn và phải thực hiện ngay trên ngọn lửa đèn cồn để tránhnhiễm tạp

- Tránh làm rách bề mặt thạch trong quá trình gieo cấy và phân lập

8.2 Mục đích của định lượng vi sinh vật:

- Xác định số vi sinh vật/1 đơn vị khối lượng canh trường

- Kiểm nghiệm vi sinh vật gây nhiễm, độc

- Chuẩn bị cho các quá trình trong sản xuất

- Kiểm tra các canh trường trong quá trình sản xuất

9 Sơ lượt lý thuyết:

Phương pháp gián tiếp: từ canh trường  gieo cấy môi trường mới  phân lập

đĩa petri , tạo khuẩn lạc riêng biệttạo tiêu bản  soi kính hiển vi

9.1.3 Các kỹ thuật phân lập vi sinh vật:

Phương pháp đổ đĩa:

Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng trộn đều với môi trường agarnóng chảy, đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, sẽ xuất hiệncác khuẩn lac riêng lẽ, thuần chủng

Phương pháp trải đĩa:

Nguyên lý: 1 lượng nhỏ vi sinh vật đã pha loãng được dàn trải đều trên bề mặtpetri có môi trường thích hợp

Phương pháp cấy ria:

Nguyên lý: 1 lượng sinh khối được ria nhiều lần trên bề mặt thạch hộp petri Saumỗi lần ria, các sinh khối vi sinh vật sẽ dần hình thành các khuẩn lạc riêng lẽ

9.2 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch:

- Là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu

- Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng

- Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết nên độ chính xáckém

9.2.3 Một số phương pháp định lượng trực tiếp:

- Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu

- Phương pháp Brit

- Phương pháp Vinogratxki-Sungina

Định lượng gián tiếp:

- Là phương pháp định lượng bằng cách gieo cấy một lượng nhất định mẫu lênmột môi trường dinh dưỡng thích hợp và nuôi cấy trong vòng 36-48 giờ, sau đóđếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào trong một đơn vị mẫu ban đầu

- Ưu điểm: chỉ đếm những tế bào còn sống nên kết quả chính xác hơn

- Nhược điểm: Tốn thời gian, công sức, không có loại môi trường dinh dưỡngnào cho phép đồng thời tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển, độ phaloãng chênh lệch nhau 10 lần nhưng số lương vi sinh vật không lệch nhau 10lần

9.2.4 Một số phương pháp định lượng gián tiếp:

- Đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

- Phương pháp lắng của Omelianxki

10 Thực hành:

10.1 Phân lập bằng phương pháp trải đĩa

10.2 Phương pháp cấy ria trên hộp petri:

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt

Tháo bao petri vô khuẩn,

hơ quanh hộp petri trênngọn lửa đèn cồn

Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp petri

Xoay đều

Để thạch

Dùng pipet cho

Tiệt trùng que trang

Dàn đều mẫu trên bề mặt thạch

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngược hộp petri,

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp(28-300C), trong vòng 48-72giờ

Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng hỗn hợp vsv cần phân lập

ý:

- Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn

Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy rạchđường song song ở một phần tư hộp petri

Kéo di que cấy từ phần tư thứnhất sang phần thứ hai và tiếptục rạch những đường songsong

Tiếp tục thao tác trên vớiphần tư thứ ba và thứ tư

Lật ngược, bao gói hộp petri và nuôi tủ ấm trong 48giờ

- Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tư khác nhau.

10.3 Phương pháp đổ đĩa:

Lưu ý:

- Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn

- 5 ống nghiệm chứa 9mL + bông + giấy và erlen 95mL nước cất sau đó hấp tiệttrùng 121o C vào khoảng 15-20 phút

Rã đông ống thạch ½ trong bể điều nhiệt

Tháo bao petri vô khuẩn,

hơ quanh hộp petri trênngọn lửa đèn cồn

Đổ thạch rã đông (45-50oC) vào trong hộp petri

Xoay đều

Để thạch

Dùng pipet cho

Để ổn định trong 5 phút

Lật ngược hộp petri,

Tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp(28-300C), trong vòng 48-72giờ

11 Kết quả và nhận xét:

Phần phân lập do thao tác vô trùng không tốt nên bị nhiễm Tuy nhiên khuẩn lạclên đều, đẹp, không dính vào nhau Khi cấy thực hiện đúng kỹ thuật, vô trùng tốt và tắtquạt

Phương pháp cấy nghiêng đơn giản và dễ thực hiện Tuy nhiên nó chỉ thích hợptrong thí nghiệm, nghiên cứu với quy mô nhỏ Muốn cấy với một số lượng lớn ta cóthể dùng phương pháp cấy trộn trên đĩa Petri

Trong thực hành, do mẫu với độ pha loãng 10-5 quá ít vi sinh vật nên chỉ thực hiệnphân lập với độ pha loãng 10-3 và 10-4

Định lượng số lượng vi sinh vật

Hộp petri có số khuẩn lạc nằm trong khoản 25-250 khuẩn lạc để tính kết quả theo côngthức:

Hộp có độ pha loãng 10-3: 147 khuẩn lạc

Hộp có độ pha loãng 10-4: 35 khuẩn lạc

(n 1+ 0.1n 2) d = 147+35

(1+0.1) 10−3 = 165454 (tổng số vsv/ml)Trong đó:

C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn

⅀

n1, n2, n3: số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp

d: hệ số pha loãng của độ pha loãng đầu

12 Ứng dụng:

Gieo cấy thường được sử dụng trong bảo quản và giữ giống Tiến hành nuôi cấy

một số chủng vi sinh vật hữu ích như B.thuringiensis, Rhizobium để quan sát khả năng

phát triển tốt của các loài vi sinh vật này trên môi trường bùn thải của nhà máy bia (vớinồng độ của bùn thải là 20 g MLSS/L) nhằm tận dụng nguồn môi trường từ bùn thảisinh học từ các nhà máy

Phân lập để nghiên cứu tính chất và ứng dụng của vi sinh vật Ví dụ: Phân lập và

xác định 10 chủng vi khuẩn B.subtilis sau đó khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi

cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ)

đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn B.subtilis thì xác định chế

độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn

Hay phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh acid lactic cao

từ các sản phẩm lên men

Bài 4:

QUAN SÁT VI SINH VẬT

1 Mục tiêu:

- Sử dụng kính hiển vi để quan sát tế bào vi sinh vật

- Làm tiêu bản sống để quan sát trên kính hiển vi

- Quan sát hình thái vi sinh vật

- Mô tả cấu tạo, chức năng mỗi bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi

13 Sơ lược về lý thuyết:

Có 2 loại tiêu bản dùng cho quan sát trên kính hiển vi: Tiêu bản sống và tiêu bản chết

13.1 Tiêu bản sống:

Tiêu bản sống dùng cho quan sát tế bào nấm men, vi khuẩn, nấm mốc

Ưu điểm: Quan sát được hình thái TB vi sinh vật, chất lượng, hình thái sinh sản của

loài vi sinh vật không chuyển động Phân biệt được tế bào sống chết nên chính xác hơn

về kết quả

Nhược điểm: Không phân biệt được bào tử và tế bào sinh dưỡng.

Tiêu bản sống có 2 dạng là tiêu bản sống kiểu giọt ép và kiểu giọt treo

13.1.1 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt ép:

- Lame kính đem nhúng sát trùng bằng cồn và đốt ở ngọn lửa ở cồn 70oC

- Lá kính sát trùng bằng cồn 70oC, làm nguội gần vùng nóng của đèn cồn (không đốttrực tiếp bằng lửa cồn vì sẽ gây vỡ)

- Nhỏ 1 giọt dịch canh trùng vi sinh vật lên lame kính

- Đăt lá kính xuống lame kính theo 1 góc 45o, tránh tạo bọt khí

- Sử dụng giấy thấm để hút nước làm khô phần rìa của các lá kính

 Mục đích: quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật.

 Ưu điểm: nhanh, gọn, dễ quan sát.

 Nhược điểm: không quan sát được trong thời gian lâu (<15 - 20 phút).

13.1.2 Cách tạo tiêu bản kiểu giọt treo:

lõm hình tròn ở giữa, bôi vasellin quanh phần lõm của lam kính, cho 1 giọt canhtrường lên giữa lam men, Thận trọng xoay ngược lam kính cho giọt canh trường xuống

gian lõm của phiến kính Không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy củaphần lõm của lam kính.

 Mục đích: dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động

và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các chất kích thích hóa học

 Ưu điểm: tiêu bản giữ được lâu hơn, quan sát dễ dàng hơn, nhờ đó có thể quan

sát phương thức chuyển động của vi sinh vật

 Nhược điểm: khó làm.

13.2 Tiêu bản chết:

Dùng quan sát các vi sinh gây bệnh

 Ưu điểm: Tương đối an toàn cho người thực hiện quan sát trên kính hiển vi.

 Nhược điểm: Không quan sát được hình thức sinh sản của vi sinh vật.

Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh được sử dụng tiêu bản chết để quan sát là E.coli, Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao)

13.3 Cấu tạo, chức năng từng bộ phận và các thao tác sử dụng kính hiển vi:

13.3.1 Kính hiển vi điện tử

Thao tác sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát:

1) Làm tiêu bản (lame và lamelle)

2) Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh khẩu độ để ánh sáng chiếuđều thị trường

3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúngtâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước

4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõhình ảnh mẫu vật

5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường.Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho khôngđụng lame là được Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉdùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh

6) Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại x90, x100 nên sử dụng vật kính dầu để giảm

sự tán sắc của ánh sáng khi đi qua lame và lamelle để vào vật kính Dùng vật kính

có độ phóng đại nhỏ để xác định vị trí cần tìm trên tiêu bản như phần trên Nhỏ mộtgiọt dầu cede lên tiêu bản Đổi vật kính sang độ phóng đại lớn (x90, x100) Nhúngđầu vật kính chìm vào giọt dầu Điều chỉnh ốc vi chỉnh nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnhcủa mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu

7) Độ phóng đại = thị kính (x10 = const) * vật kính (soi thô: x10, x40 hay soi dầu: x90, x100)

13.3.2 Kính hiển vi quang học dùng gương:

Hình vẽ cấu tạo của kính hiển vi quang học dùng gương

Thao tác sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát:

1) Làm tiêu bản

2) Quay gương về phía nguồn sáng mạnh nhất đã chọn (dùng mặt phẳng của gươngnếu ánh sáng mạnh, dùng mặt lõm của gương nếu ánh sáng yếu) ,mắt nhìn qua lỗtrên mâm kính nếu thấy trên hộp tụ quang có 1 chùm sánh sáng mạnh là đạt yêucầu Xoay vật kính 10, nhìn vào thị kính thấy vi trường sáng tròn đều là được Nếuchưa tròn đều thì dùng tay điều khiển gương sao cho vi trường sáng tròn đều.3) Đặt tiêu bản lên bàn kính, kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúngtâm nguồn sáng, xem mẫu vật ở kính nhỏ (x10) trước

4) Nhìn dưới lame, vặn nhẹ ốc sơ chỉnh đến khi đầu vật kính x10 sắp sửa chạm lame.Sau đó nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ống sơ chỉnh và vi chỉnh đến khi nhìn thấy rõhình ảnh mẫu vật

5) Muốn xem ở độ phóng đại lớn hơn thì đưa phần muốn xem vào giữa thị trường.Nhìn bên ngoài lame, vặn đầu xoay chuyển sang vật kính lớn (x40) sao cho khôngđụng lame là được Khoảng cách giữa vật kính lớn với lame rất nhỏ, do đó chỉdùng ốc vi chỉnh thấy rõ hình ảnh

6) Ngoài ra, kính hiển vi quang học còn có dạng dùng nguồn sáng là từ bóng đèn, vìthế kính hiển vi sẽ có thêm các bộ phận như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạchđiện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng

14 Tiến hành thí nghiệm:

Thực hiện quan sát các tế bào vi sinh vật trên kính hiển vi điện tử gồm : Nấm men, vi

khuẩn Bacillus subtilis, vi khuẩn lên men lactic dưa chua.

15 Nhận xét và bàn luận kết quả thí nghiệm:

Trong 3 mẫu vi sinh vật quan sát:

- Mẫu nấm men dễ quan sát thấy và dễ nhận biết nhất do kích thước chúng khá lớnhơn 2 mẫu vi khuẩn còn lại Đặc biệt là các chồi con mọc trên thân của tế bào nấmmen

- Mẫu vi khuẩn lên men lactic dưa chua: khá khó trong việc quan sát, nhưng có thểnhận biết được do hình dạng chúng là dạng dài

- Mẫu vi khuẩn Bacillus subtilis là khó quan sát nhất, nhỏ và di chuyển.

16 Ứng dụng

- Ví dụ về 3 loài vi sinh vật gây bệnh được sử dụng tiêu bản chết để quan sát là E.coli, Salmonella, Mycobacterium tuberculosis (Vi khuẩn lao).

Bài 5: QUAN SÁT TẾ BÀO NẤM MEN VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

1 Mục đích:

- Đánh giá chất lượng của canh trường

- Quan sát lượng tế bào nấm men nảy chồi

- Quan sát tỷ lệ nấm men sống và chết

- Thực hành đếm số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm

17 Cơ sở lý thuyết:

17.1 Nấm men có hình thái thay đổi trong quá trình phát triển:

Giai đoạn 1: Nấm men trẻ (12-16h nuôi cấy): nảy chồi ít, tế bào chất đồng nhất,màng mỏng, không bào chưa có hoặc mới xuất hiện

Giai đoạn 2: Nấm men trưởng thành (24-48h nuôi cấy): Kích thước điển hình,không bào lớn,tế bào nảy chồi nhiều

Giai đoạn 3: Nấm men già (sau 72h nuôi cấy), tế bào chết xuất hiện nhiều, tế bào

có hình dạng teo lại, màng tế bào ngoài nhăn nheo, nguyên sinh chất không đồng nhất

17.2 Nguyên tắc đếm tế bào nấm men chết:

- Tế bào nấm bào nấm men chết dễ bắt màu hơn tế bào sống

- Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn đi qua màng tế bào sống

- Dùng Methylene Blue ( đã pha loãng 10 lần) để nhuộm màu tế bào

18 Tiến hành thí nghiệm:

18.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá sơ bộ chất lượng của canh trường nấm men.

- Đánh giá mức độ nhiễm của canh trường và giai đoạn phát triển của nấm men

- Trên lame kính nhìn qua kính hiển vi theo 5 điểm như hình vẽ:

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 10 lần)

Làm tiêu bản

Quan sát 5 điểm trên lame kính và nhận xét về chất lượng canh trường

18.2 Thí nghiệm 2: Quan sát lượng nấm men nảy chồi

- Nếu có 70-80% lượng tế bào nảy chồi  phát triển mạnh

- Nếu có dưới 2% lượng tế bào nảy chồi  đang chết, già

- Quan sát 5 điểm như trên hình và đếm số lượng tế bào của mỗi điểm

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 10 lần)

18.3 Thí nghiệm 3: Quan sát và đếm lượng tế bào nấm men chết

Sơ đồ khối tiến hành

Pha loãng dung dịch nấm men gốc (loãng 100 lần)

Trộn canh trường và 1 giọt methylene blue trên lame

Làm tiêu bản

Quan sát 5 điểm ở lame kính, đếm số tế bào chết ở mỗi vị trí

và tổng số tế bào có mặt

18.4 Thí nghiệm 4: Đếm số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm

Các vị trí chọn để đếm số tế bào trên 1 ô buồng đếm

1 Gắn lamelle kính lên buồng đếm

2 Dùng ống nhỏ giọt nhỏ canh trường nấm men vào khe buồng đếm

3 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi và quan sát

Nhận xét ở thí nghiệm 2, 3: Kết quả đếm có thể không đúng do chỉ đếm theo số tương

đối, sai sót trong các vùng đếm khi mật độ nấm men khá lớn

Tính toán kết quả: Dựa từ công thức (1)

Ta có được số tế bào nấm men có trong 1mL mẫu ban đầu:

N=80.0,0002530.10 =15000số tế bào/mL

20 Ứng dụng:

Nấm men bánh mì: Saccharomices cerevisiae được sử dụng nhằm tạo ra CO2 làm

nở cấu trúc khối bột đồng thời tạo ra các cấu tử tạo hương trong quá trình trao đổi chấtcủa nó

Một ứng dụng mới là người ta sử dụng Saccharomices cerevisiae đã được thay đổi

cấu trúc di truyền để sản xuất các loại protein con người nhờ vào đó người ta có thểtìm ra nguyên tắc hoạt động của các loại thuốc chứa hoạt chất sulfasalazine (trongthuốc chữa bệnh viêm ruột, viêm đa khớp) và tượng tác phản ứng giữa protein vàsulfasalazine

Saccharomices cerevisiae kết hợp với vi khuẩn butyric tạo ra hương thơm mạnh và

đặc trưng trong sản xuất rượi Rum

Saccharomyces carlbergeois lên men bia – kiểu lên men chìm thường để sản xuất

bia có độ cồn thấp và bia vàng Sử dụng nấm men chìm để sản xuất bia sẽ tốn thời gianhơn nhưng bia thu được trong hơn đống thời nấm men dễ lọc và dễ thu hồi để sử dụnghơn

Sản xuất acid citric bằng cách lên men dung dịch được hay một số môi trường

thích hợp bằng chủng Candida spp.