báo cáo thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnn : số lượng đĩa cấy tại các độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu ml cấy vào môi trường f : độ pha loãng tương ứng Mật độ tổng vi sin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TPHCM

KHOA MT & CNSH

  

BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LUỢNG

1.2 Nguyên tắc

 Tổng số VSV hiếu khí đuợc đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí

ở 300C/72h  6h hoặc 37h hoặc 370C/ 48h  6h hoặc 37h

1.6 Thuyết minh quy trình

1.6.1 Chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu:

 Tên mẫu: Thịt heo bằm

 Thời gian lấy mẫu: 6h hoặc 37h sáng ngày 9/5/2011

 Địa điểm lấy mẫu: Chợ Bà Chiểu

 Nhận xét mẫu: mẫu thịt màu đỏ, băm nhuyễn, có nhiều mỡ trắng, mẫu để

trên bàn cao

 Cân chính xác 25 g mẫu thịt heo, bằm nhỏ rồi cho vào bao PE vô trùng, sau

đó thêm vào 225 ml BPW Tiến hành đồng nhất mẫu bằng tay trong thời

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng Sau đó

đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C

25g mẫu + 225ml BPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng

10-1

Pha loãng trong nước muối sinh lý
độ pha loãng 10 độ pha loãng 10-2,10-3,10-4

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội úp ngược đem ủ ở nhiệt độ

300C trong 72h

Đọc kết quả các kết quả từ 25-250 khuẩn lạc

Tính toán kết quả:

A=

gian 30 giây Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1..

 Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô trùng chuyển 1 ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước muối sinh lý
độ pha loãng 10 đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết là 10-3, 10-4, 10-5

1.6.2 Đỗ đĩa

 Chọn 3 độ pha loãng liên tiếp là 10-3,10-4,10-5 Dùng micropipette với các đầu típ vô trùng để chuyển 1 ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa Sau khi cấy, đỗ vào mỗi đĩa10-15 ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45- 500C Trộn đềumẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng nằm ngang cho thạch đông đặc

 Ta tiến hành chọn các đĩa có từ 25-250 khuẩn lạc để tính toán kết quả

 Có 4 đĩa được chọn tính kết quả: hai đĩa ở độ pha loãng 10-4 và hai đĩa ở độpha loãng 10-5

 Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1 g mẫu được tính như sau:

A (CFU/g) =

Trong đó:

A: số tế bào vi khuẩn ( khuẩn lạc ) trong 1 g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n : số lượng đĩa cấy tại các độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f : độ pha loãng tương ứng

Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu phân tích là:

BÀI SỐ 2: ĐỊNH LUỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS

TRONG THỰC PHẨM

2.1 Định Nghiã Coliforms

khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 c trong vào 24-48 h Nhóm coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên trong, ruột người và động vật

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị :số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm ,nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

2.2 Nguyên Tắc

 Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose Sau khi ủ 370C 10C trong 24-48 h ,đếm số

lượng khuẩn lac Coliforms điển hình Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng

.Môi trường chọn lọc coliforms là môi trường chứa lactose ,đây là nguồn

cacbon duy nhất ,đồng thời môi trường còn chứa muối mật như tác nhân chọn lọc và các tác nhân chỉ thị như neutral red, crystal violet.Khẳng định các dòng khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường canh chọn lọc như canh BGBL.

2.3 Môi Trường Sử Dụng

 Môi trường Triptone Soya Agar (TSA)

 Violet Red Bile Agar (VRB)

 Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)

25g mẫu + 225ml spm -> đồng nhất trong 30 giây -> độ pha loãng 10-1

Từ một độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng.Sau đó đổ môi

trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30 phút

Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Ủ nhiệt độ 370C trong 24h

2.6 Thuyết Minh Quy Trình

 Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petrixuông và ngược theo chiều kim đồng hồ Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1-2

h để phục hồi khả năng của Coliforms Đỗ thêm 10ml môi trường VRB Chờ

môi trường đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C trong 24 h

Ở mỗi đĩa chọn 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường BGBL

Tổng số coliforms ( cfu/g)

A=( N : nVf )* R

 Quy trình khẳng định được thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canhBGBL và ủ ở 370C trong vòng 24 h Phản ứng (+) khi vi sinh vật sinh khí ở ốngDurnham Tỉ lệ xác nhận là tỉ số khuẩn lạc cho kết quả (+) với số khuẩn lạc khẳng định.

2.6.5 Tính Toán Kết Quả

 Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỉ lệ xác định tính mật độ của Coliforms

theo công thức:

Trong đó:

A (CFU/g hay CFU/ml) = ( N : (n1vf1 +…+ nivfi )) * R

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi chỗ pha loãng

v : thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm

R: tỉ lệ xác nhận

Số ống BGBL (+)

R= số ống (+) : số ống thử nghiệm

Tổng số BGBL thử nghiệm

2.7 Kết Luận Và Nhận Xét

 Trong mẫu đã thử nghiệm không có sự hiện diện của trực khuẩn Coliforms

BÀI SỐ 3 : ĐỊNH TÍNH E.COLI

3.1 Định nghĩa :

khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37°C trong 24-48giờ

sinh hơi ở nhiệt độ 44°C trong 24-48 giờ

môi trường trypton dương tính

Ủ ở 44°C ± 0,5 trong 24 giờ

Các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB

Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E.Coli

Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E.Coli trên EMB : tròn , dẹt đường kính < 0,5 mm ,

có ánh kim tím

Cấy chuyển sang TSA  Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24giờ

Cấy vào môi trường 1Trypton , 2 MR-VP , 1 Simmons Citrate

Ủ ở 37°C ± 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC

Kết luận : phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 25g mẫu

3.6 Thuyết minh quy trình :

3.6.1 Chuẩn bị mẫu :

Lấy mẫu:

 Tên mẫu: thịt bằm

 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu

 Thời gian lấy mẫu: 6h hoặc 37h sáng ngày 9/5/2011

 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao

 Cân chính xác 25g mẫu thịt bằm cho vao bao PE vô trùng , sau đó thêm vào 225ml dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫu không quá 2,5phút Tất cả các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó , ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1

 Tiếp tục chuẩn bị như bài 1

 Nhận dạng khuẩn lạc E.Coli : khuẩn lạc tròn , màu tím , có bờ đều , đường

 Chọn ít nhất 2 khuẩn lạc nghi ngờ từ môi trường phân lập cấy chuyển sang môi trường rắn không chọn lọc (TSA) , ủ ở 37°C trong 24 giờ

 Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau :

1.Thử nghiệm Indole

2 Thử nghiệm Methyl Red

3 Thử nghiệm Voges- Proskauer

4 Thử nghiệm Citrate

3.6.5.Báo cáo kết quả :

3.6h hoặc 37.5.1 Quan sát

nhiều khuẩn lạc tròn,dẹt, có tâm đen, có ánh kim tím

=> Có khả năng khuẩn lạc trên là E.coli

3.6h hoặc 37.5.2.Thử nghiệm sinh hóa

a Thử nghiệm Indole :

 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường Trypton

 Sau đó cho thuốc thử Kovac’s vào ống Trypton

=> xuất hiện vòng tròn màu đỏ => dương tính ( + )

b Thử nghiệm Methyl Red :

 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường MR-VP

 Sau đó cho thuốc thử Methyl red vào ống nghiệm chứa môi trường MR

=> xuất hiện vòng tròn màu đỏ => dương tính ( + )

c Thử nghiệm Voges Proskauer :

 Cấy khuần lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường MR-VP

 Cho vào ống nghiệm dung dịch KOH 40%

 Rồi cho thêm α- naphtol lắc đều rồi chờ khoảng 10phút

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết luận

++

=> môi trường không đổi màu => âm tính (- )

d Thử nghiệm Citrate :

 Cấy khuẩn lạc nghi ngờ E.Coli ở trên vào môi trường Citrate

 Sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ rồi quan sát

=> môi trường có màu xanh dương => dương tính (+)

Kết quả thực hiện nghiệm pháp IMViC :

 Kết luận : Trong 25g mẫu thịt bằm có sự hiện diện của vi khuẩn Coliform chịu

nhiệt nhưng không có sự hiện diện của vi khuẩn E.Coli

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS

AUREUS

4.1 Nguyên tắc

 Cấy trang là một luợng mẫu xác định trên bề mặt môi truờng thạch chọn lọc Sau khi ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và không đặc

trưng của S.aureus Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase

và các đặc trưng khác Kết quả đuợc xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, nồng độ pha lõang và hệ số xác nhận

4.2 Môi truờng sử dụng

 Môi truờng BP

 Môi truờng TSA

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

1234

Indole Methyl Red Voges Proskauer Khả năng sử dụng Citrate

++-+

 Huyết tuơng thỏ

4.3 Quy trình phân tích mẫu

4.4 Thuyết minh quy trình

4.4.1 Chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu:

 Tên mẫu: thịt bằm

 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu

Chọn 4 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyền trên môi trường TSA

Cấy chuyền vào ống nghiệm chứa 0,2ml huyết tương thỏ

Ủ ở 370C và theo dõi sau 24 giờ Xác định tỷ lệ ngưng kết R

Tổng số S.aureus (cfu/g) S=

25g mẫu + 225ml SPW đồng nhất trong 30 giây độ pha loãng 10-1

Lấy 1ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào đĩa môi trường BP có bổ

sung egg yolk cấy trang

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48h

Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, có tâm đen và

có quầng sáng bao quanh

 Thời gian lấy mẫu: 6h hoặc 37h sáng ngày 9/5/2011

 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao

o Dùng kéo cắt và cân chính xác 25 g mẫu thịt heo cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 225 ml dung dịch pha loãng mẫu BPW Thao tác trên ta thực hiện trong tủ cấy Tiến hành đồng nhất mẫu bằng tay Thời gian đồng nhất mẫu khoảng 30 giây Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1

4.4.2 Cấy mẫu

o Dùng micropipette chuyển 0,1ml dịch mẫu đã pha loãng vào môi trường BP.Dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô Thực hiện lặplại 3 đĩa BP ở mỗi nồng độ pha loãng, ủ ở 370C trong 48 giờ đối với môi trường BP

4.4.3 Đọc kết quả

o Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc S aureus có đường kính

khoảng 0,5-1mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1-2mm bao quanh Một số khuẩn lạc có tâm đen quá lớn bít kín khuẩn lạc

o Có tâm đen là do môi trường BP có gốc S mà S.A có enzyme

desunfuehydrase có khả năng phân giải S, tác dung với Fe trong môi trường tạo nên FeS có màu đen

o Quầng sáng có trong mẫu là do BP có bổ sung egg yolk tellurite mà egg yolk có lecithin, vi khuẩn có lecithin nase sẽ phân giải lecithin tạo ra quầng sáng

=> Kết quả: Khuẩn lạc thu đuợc tròn, lồi, có tâm đen nhưng không có quầng sáng

xung quanh

Hình 4.1 Khuẩn lạc trên môi truờng BP 4.4.4 Khẳng định

Trên môi truờng BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng

từ môi truờng BP cấy vào môi truờng TSA Ủ ở 370C trong 24h Cấy sinh khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi truờng huyết tuơng thỏ Ủ ở 370C Theo dõi phản ứng đông tụ huyết tuơng trong 2,4,6h hoặc 37,8,24 h Tính tỷ lệ khẳng định trên các khuẩn lạc đặc trưng

=> Kết quả: không có sự đông tụ huyết tuơng trong môi truờng TSA  Không có

sự hiện diện vi khuẩn Staphylocosccus aureus.

Hình 4.2 Thử nghiệm đông tụ huyết tuơng trên môi truờng TSA

 Môi truờng XLD

 Môi truờng TSI

 Môi truờng Mannitol Phenol Red broth

 Môi truờng Urea broth

 Môi truờng LDC

5.3 Quy trình thực hiện

25g mẫu + 225 ml BPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây 

độ pha lõang 10-1

Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h

Lấy 0,1ml canh truờng cho vào 10ml môi truờng RV

Ủ ở 420C  0,5 trong 24h

Cấy chuyền trên môi truờng XLD và ủ ở nhiệt độ 370C, 24h

KL đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm đenđôi khi tâm đen quá lớn bao trùm của KL, môi truờng quanh chuyển sang

màu đỏ

Cấy chuyển sang môi truờng TSA

Ủ ở 370C trong 24h

Cấy chuyển vào môi truờng thử nghiệm sinh hóa: môi truờng

TSI, Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC broth

5.4 Thuyết minh quy trình

5.4.1 Tiền tăng sinh

Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thuờng:

Lấy mẫu:

 Tên mẫu: thịt bằm

 Địa điểm mua: Chợ Bà Chiểu

 Thời gian lấy mẫu: 6h hoặc 37h sáng ngày 9/5/2011

 Nhận xét về mẫu: màu đỏ, có nhiều mỡ trắng, mẫu để ở trên bàn cao

 Cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng Thêm 225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu Thời gian đồng nhất mẫu trong 30 giây Ủ 370C trong 24h

5.4.2 Tăng sinh chọn lọc

 Trộn môi truờng sau khi đã ủ 24h truớc khi cấy chuyển 0,1ml sang môi truờng tăng sinh chọn lọc RV Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24h

5.4.3 Phân lập

 Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối VSV từ môi truờng tăng sinh

chọn lọc RV cấy ria lên môi truờng chọn lọc cho Samonella như:

XLD,BPLS, BSA, HE… Cuờng độ chọn lọc mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc Samonella trên từng môi truờng khác nhau

 Trong thí nghiệm này sử dụng môi truờng XLD

+ Môi truờng XLD: khuẩn lạc Samonella tròn, lồi,có tâm đen, môi trường xung quanh

có màu hồng, có tâm đen Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc Môi truờng XLD chuyển sang màu hồng

=> Kết quả quan sát khuẩn lạc trên môi trường XLD: Khuẩn lạc tròn, lồi, không

có tâm đen, môi trường xung quanh có màu hồng

 Tất cả các đĩa môi truờng sau khi cấy đuợc ủ ở nhiệt độ 370C/24h Sau khi ủ,

chọn những khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella để khẳng định bằng các thử

nghiệm sinh hóa và thử nghiệm các đặc tính kháng nguyên

5.4.4 Khẳng định

 Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải đuợc kiểm tra sinh hóa và kháng

huyết thanh Từ mỗi môi truờng phân lập, cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghingờ sang môi truờng không chọn lọc (môi truờng TSA), ủ ở 370C trong 24h, các khuẩn lạc xuất hiện trên môi truờng này đuợc sử dụng để thử nghiệm sinhhóa

 Các thử nghiệm sinh hóa chính đuợc sử dụng cho Samonella là lên men

glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, Indol, VP, ODC, LDC, Mannitol Các

chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau:

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

1 Thử nghiệm trên môi truờng TSI - Nghiêng đỏ,sâu vàng => chỉ sử dụng

nguồn đuờng glucose

- Có sinh H2S, có sinh hơi

5.4.5 Báo cáo kết quả

a Thử nghiệm trên môi truờng TSI:

o Nghiêng vàng, sâu vàng => sử dụng 2 nguồn đường là glucose và lactose

o Môi trường dưới phần đáy ống nghiệm có màu đen => có sinh H2S

o Sau khi nuôi cấy,tạo ra sản phẩm acid => làm thay đổi màu chất chỉ thị => màu vàng.

Hình 5.1 Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Samonalle (từ trái qua): thử nghiệm

TSI, thử nghiệm LDC (+), thử nghiệm Urea (-), thử nghiệm Mannitol (+)

Kết quả thử nghiệm

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

1 Thử nghiệm trên môi truờng TSI - Nghiêng vàng, sâu vàng =>sử dụng 2

nguồn đuờng là glucose và lactose

- Có sinh H2S, có sinh hơi

=> Kết luận: Không có Samonella trong 25g mẫu thịt bằm trên.

BÀI SỐ 6: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH

PHẨM MÀU ĐỘC VÀ KHÔNG ĐỘC

6.1 Nguyên Lý

 Phẩm màu kiềm tính (chromobase ) dẫn xuất từ than đá có tính chất độc hại khôngđược phép sử dụng trong thực phẩm Phẩm màu acid dẫn xuất từ than đá được phép sử dụng

 Phẩm màu dẫn xuất than đá có tính kiềm tan được trong nước hay trong cồn

 Dung dịch phẩm màu này nếu cho tác dụng với 1 chất kiềm mạnh (NH3) sẽ làm giải phóng chất màu của kiềm phẩm