Báo cáo thực hành vi sinh ứng dụng - các phương pháp phân lập nuôi cấy vi sinh vật

- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùngtrước khi thải bỏ vào các bải rác.. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần đượcngâm vào dung d

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

Báo cáo thực hành:

VI SINH ĐẠI CƯƠNG

Giảng viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

M C L C ỤC LỤC ỤC LỤC

BÀI 1: CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT 5

BÀI 2 : CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 6

2.1 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH 6

2.1.1 Dụng cụ thuỷ tinh 6

2.1.1.1 Ống nghiệm 6

2.1.1.2 Đĩa petri 6

2.1.1.3 Pipette và micropipette 7

2.1.1.4 Các dụng cụ bằng thuỷ tinh khác 7

2.1.2 Các dụng cụ và thiết bị khác 7

2.1.2.1 Dây cấy 7

2.1.2.2 Tủ ấm và autoclave 8

2.2 BAO GÓI DỤNG CỤ 8

2.2.1 Nguyên tắc 8

2.2.2 Phương pháp bao gói 8

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 9

2.3.1 Nguyên tắc 9

2.3.2 Các phương pháp khử trùng 10

2.3.2.1 Khử trùng bằng nhiệt khô 10

2.3.2.2 Khử trùng bằng sức nóng ướt 11

2.3.2.3 Khử trùng bằng phương pháp lọc 13

2.3.2.4 Khử trùng bằng bức xạ 13

BÀI 3 : MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 13

3.1 HÓA CHẤT – VẬT LIỆU – DỤNG CỤ 13

3.1.1 Hóa chất – vật liệu 13

3.1.2 Dụng cụ 13

3.2 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 14

3.2.1 Khái niệm 14

3.2.2 Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng 14

3.2.3 Phân loại môi trường dinh dưỡng 14

3.2.3.1 Dựa vào thành phần và nguồn gốc 15

3.2.3.2 Dựa vào tính chất lý học 15

3.2.3.3 Dựa vào công dụng 15

3.2.4 Phương pháp pha môi trường 15

3.2.4.1 Nguyên tắc pha môi trường 16

3.2.4.2 Các bước pha môi trường dinh dưỡng 16

3.3 CÔNG THỨC VÀ CÁCH PHA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG 19

3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ( cao thịt – pepton ) 19

3.3.2 Môi trường nuôi cấy nấm mem ( Hansen ) 20

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm mốc ( Czapek ) 21

3.3.4 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ( Gauze I ) 22

3.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 23

3.4.1 Nguyên tắc khử trùng 23

3.4.2 Một số phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng 24

Bài 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật 24

4.1Hóa chất - Vật liệu – Dụng cụ 24

4.1.1 Hóa chất - Vật liệu 24

4.1.2 Dụng cụ 24

4.2Phương pháp pha loãng mẫu 25

4.2.2 Nguyên tắc 25

4.2.3 Phạm vi áp dụng 25

4.2.4 Phương pháp thực hiện 25

4.2.5 Đối với mẫu chất lỏng 25

4.2.6 Đối với mẫu chất rắn 25

4.3Phân lập vsv 25

4.3.1 Nguyên tắc 25

4.3.2 Quá trình phân lập các vi sinh vật thuần khiết 25

4.3.3 Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường phân lập 26

4.3.4 Phân lập vsv trên môi trường thạch, đĩa petri 26

4.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập 26

4.4Quy trình phân lập 1 số chủng vi sinh vật 26

4.4.1 Quy trình phân lập Vi Khuẩn BACILLUS SUBTILIS 26

4.4.2 quy trình phân lập nấm mốc 27

4.4.3 Quy trình phân lập nấm men 27

4.4.4 Quy trình phân lập xạ khuẩn 28

4.5Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 28

4.5.1 khái niệm 28

4.5.2 Nguyên tắc 28

4.5.3 các pương pháp cấy 28

4.5.3.1 phương pháp chung của việc cấy chuyển 28

4.5.4 Phương pháp cấy trên thạch nghiêng 28

4.5.5 Phương pháp cấy trên thạch đứng 28

4.5.6 Phương pháp cấy trên đĩa petri 29

4.5.7 Kết quả của việc nuôi cấy 29

4.6Phương pháp bảo quản vi sinh vật 30

4.6.1 Phương pháp cấy chuyển bằng định kì trên môi trường mới 30

4.6.2 Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt 30

4.6.3 Phương pháp đông khô 30

BÀI 5: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI 30

5.1 NGUYÊN TẮC VÀ CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 30

5.1.1 Nguyên tắc kính hiển vi 30

5.1.2 Các bộ phận của kính hiển vi 30

5.1.3 cách sử dụng kính hiển vi 31

5.2 Hóa chất – vật liệu – dụng cụ 31

5.2.1 khái niệm thuốc nhuộm 31

5.2.2 Một số loại thuốc nhuộm 32

5.2.3 Nguyên liệu 32

5.2.4 Dụng cụ 32

5.3 Cách làm tiêu bản tạm thời 33

5.3.1 Đặc điểm của tiêu bản tạm thời 33

5.3.2 Cách lấy giống vi sinh vật làm tiêu bản 33

5.3.3 Cách làm tiêu bản giọt ép 33

5.3.4 Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu 33

5.3.4 1 Nguyên tắc 33

5.3.4.2 Cách nhuộm 33

5.4 Cách làm tiêu bản cố định 34

5.4.1 Đặc điểm của tiêu bản cố định 34

5.4.2 Các bước làm tiêu bản cố định 34

5.4.2.1 Làm vết bôi 34

5.4.2.2 Cố định vết bôi 34

5.4.3 Nhuộm tiêu bản cố định 34

5.4.3.1 Nguyên tắc 34

4.5.3.2 Cách nhuộm 34

5.5 Quan sát đặc điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật 34

5.5.1 Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn 34

5.5.1.1 Quan sát đại thể 34

5.5.1.2 Quan sát vi thể 35

5.5.2 Quan sát đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 36

5.5.2.1 Quan sát đại thể 36

5.5.2.2 Quan sát vi thể 36

5.5.3 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc 37

5.5.3.1 Quan sát đại thể 37

5.5.3.2 Quan sát vi thể 37

5.5.4 Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men 37

5.5.4.1 Quan sát đại thể 37

5.5.4.2 Quan sát vi thể 38

5.6 Phương pháp nhuộm kép 39

5.6.1 Phương pháp nhuộm Gram 39

5.6.1.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ 39

5.6.1.2 Nguyên tắc nhuộm Gram 39

5.6.1.3 Các bước tiến hành 39

5.6.2 phương pháp nhuộm từ bào tử 40

5.6.2.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ 40

5.5.2.2 Phương pháp nhuộm bào tử 40

BÀI 1: CÁC QUY T C AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHI M VI ẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI ỆM VI

SINH V T ẬTThao tác an toàn là yêu cầu cực kì quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật khi làmviệc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào visinh vật (ở mức 109 tế bào /ml) nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nên cầnluôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệmcủng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóa chất có độctính Do vậy, cần tuẩn thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an cho bản thân và chonhững người khác trong phòng thí nghiệm như sau:

- Nắm vững nguyễn tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm mang khẩu trang khi thaotác với vi sinh vật

- Mặc áo blouse trong thời gian làm việc

- Trươc khi bắt đầu cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700 hoặc dungdịch chất diệt khuẩn khác ( Lysol 5%, amphyl 10%, chlorol 10%), để khô Thực hiệntương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn khi hai tay chưa khô cồn lặp lại việc sáttrùng này sau khi hoàn thành công việc

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm llên tất cả các đĩa petri, ống nghiệm môitrương, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nới làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệtkhuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặcngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa.cần cócách bảo vệ tóc thích hợp khi trường hợp tóc dài

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằngmiệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang răng tay thu gom tất cả mảnh vỡvào một túi rác riêng

- Tách riêng chất thải rắng và chất thải lỏng

- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùngtrước khi thải bỏ vào các bải rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần đượcngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn ( nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng.

- Cần gói hoặc rang bằng băng keo khi đặt chồng các các đĩa petri lên nhau

- Không mở đĩa petri và dùng muỗi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đương hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật cần đặt vòng hoặc đầu que vào chân ngọn lửa để ranh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí

- Sát trùng và rửa tay sách sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

BÀI 2 : CÁC THI T B PHÒNG THÍ NGHI M VI SINH VÀ CÁC ẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC Ị PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC ỆM VI

PH ƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG NG PHÁP KH TRÙNG Ử TRÙNG

2.1 D NG C VÀ THI T B VI SINHỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH ỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH ẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC Ị PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC

2.1.1 D ng c thu tinhụng cụ thuỷ tinh ụng cụ thuỷ tinh ỷ tinh2.1.1.1 ng nghi mỐng nghiệm ệm

- Ống nghiệm được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật, có nút bằng gòn không thấm nước

hoặc nhựa chịu nhiệt Ống nghiệm được sử dụng để nuôi cấy, tăng sinh vi khuẩn trong môi trường lỏng

Hình 1.1: A: Ống nghiệm có nút nhựa vặn

B: Ống nghiệm có nút bông gòn

2.1.1.2 Đĩa petri

- Đĩa petri gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8 cm, 10 cm,

12 cm … Đĩa petri được sử dụng nhằm mục đích phân lập vi sinh vật

Hình 1.3 Pipette và micropipette các loại

2.1.1.4 Các d ng c b ng thu tinh khácụng cụ thuỷ tinh ụng cụ thuỷ tinh ằng thuỷ tinh khác ỷ tinh

- Becher

- Bình tam giác (Erlen)

2.1.2 Các d ng c và thi t b khác ụng cụ thuỷ tinh ụng cụ thuỷ tinh ết bị khác ị khác 2.1.2.1 Dây c yấy

- Dây cấy thẳng: Sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật trên môi trường thạch.

- Dây cấy vòng: Dùng cấy ria vi sinh vật trên trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật

trong môi trường lỏng hoặc môi trường thạch

- Dây cấy thước thợ: Dùng để cấy các loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Những loại

dây cấy này thường làm bằng kim loại không bị oxy hoá ở nhiệt độ cao

Hình 1.4: Các loại dây cấy sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật : a Dây cấy vòng

b Dây cấy thẳng

2.1.2.2 T m và autoclaveủ ấm và autoclave ấy

- Tủ ấm còn gọi là tủ thiết bị giúp ổn định nhiệt độ, được sử dụng để hoặc theo dõi sự

tăng trưởng của vi sinh vật

- Autoclave hay còn gọi là nồi hấp tiệt trùng áp suất cao là thiết bị được sử dụng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ

trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

2.2.2 Phương pháp bao góing pháp bao góiViệc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:

- Làm nút bông: Cho các ống nghiệm, bình tam giác, que trang.

- Bao gói: Cho hầu hết các dụng cụ khác

a Cách làm nút bông

- Với các ống nghiệm:

 Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại

 Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm

 Yêu cầu:

Nút có kích thước và độ chặt vừa phải

Đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong

Lấy nút hay đóng vào dễ dàng

- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng lượng bông nhiều hơn

- Với các pipet: Dùng một sợi dây thép nhỏ nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet để hạn chế không khí từ bóp cao su vào pipet

- Cắt các đoạn bang giấy hình chữ nhật với kích thước tuỳ theo dụng cụ cần bao bao gói

- Quấn quanh phần đầu có nút bông

- Cột lại thật chặt

Yêu cầu:

- Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín

- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô thì khử trùng ướt

Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dung giấy bao kín toàn bộ Có thể dung hộp nhôm để đựng các dụng cụ trên để khử trùng

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNGNG PHÁP KH TRÙNGỬ TRÙNG

2.3.1 Nguyên t cắc Sau khi khử trùng cần đảm bảo:

 Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm

 Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật

Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người

2.3.2 Các phương pháp bao góing pháp kh trùngử trùngKhi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:

Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt

2.3.2.1 Kh trùng b ng nhi t khôử trùng ằng thuỷ tinh khác ệm

Khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn

- Phương pháp này dung để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng

bình tam giác sau khi lấy nút bông ra

2.3.2.2 Kh trùng b ng s c nóng ử trùng ằng thuỷ tinh khác ức nóng ướt ướtt

Đun sôi trong nước

- Phương pháp này được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc …

- Cách tiến hành:

 Dùng nước sạch đổ ngập dụng cụ

 Đun sôi từ 10 phút đến 1 giờ

Đun cách thuỷ ở nhiệt độ thấp (phương pháp thanh trùng Pasteur)

- Phương pháp này được dung để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở nhiệt độcao

- Cách tiến hành:

 Đun nóng môi trường lên 65- 70oC trong 15 -30 phút

 Phương pháp này chỉ có tác dụng ức chế VSV không có bào tử

 Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển

 Hấp môi trường lần thứ hai ở 100 oC trong 30 – 40 phút tiêu diệt các bào

tử vừa nảy mầm

 Lặp lại quá trình này 3 – 4 lần

Khử trùng hơi nước bão hoà áp suất cao (Autoclave)

Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao Đó là thiết bịlàm bằng kim loại có tính chịu nhiệt cao có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ vàthời gian

Nguyên tắc hoạt động

- Làm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển Khi áp suất tăng làm nhiệt độ tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ

Mối quan hệ giữa áp suất và nhiệt độ của nồi được biểu hiện qua bảng sau:

00,51,01,52,0

100112121128134

Cách sử dụng:

- Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường cần khử trùng

- Cho 3 lít nước cất vào nồi hấp rồi kiểm tra mức nước cho phù hợp

- Lần lượt đưa các dụng cụ, môi trường cần hấp vào bên trong nồi

- Đóng chặt nồi hấp

- Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian và áp suất về vị trí mong muốn

- Cắm phích điện

- Bật công tắc khử trùng nồi hấp để tiến hành hấp

- Khi kết thúc quá trình hấp, nồi sẽ báo hiệu bằng còi

- Gạt công tắc khử trùng về vị trí dry

- Chờ kim áp suất trở về 0 mới mở nắp nồi lấy dụng cụ ra

- Rút phich điện

- Ghi nhãn ngày – tháng – năm vào dụng cụ sau khi khử trùng

CHÚ Ý: Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc khử trùng, người thực hiện cần

phải:

- Kiểm tra lại nồi hấp trước khi sử dụng

- Thực hiện đúng quy trình hướng dẫn

- Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ, nguyên liệu hoặc gây nổ nguyhiểm

- Trực tiếp theo dõi quá trình khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện

- Định kỳ kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế và van an toàn

Tóm lại, phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hoà ở áp suất cao là phương phápphổ biến và hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tếbào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật

2.3.2.3 Kh trùng b ng phử trùng ằng thuỷ tinh khác ương pháp bao góing pháp l cọc

Sử dụng cho môi trường lỏng, trong , có độ nhầy yếu, không chịu được nhiệt độ caohơn 60oC Cho môi trường đi qua một màng lọc xốp có đường kính lỗ nhỏ hơn đườngkính của vi khuẩn Khi đó, vi khuẩn sẽ bị giữ lại trên màng lọc còn dung dịch đi qua sẽ

vô trùng Màng lọc thường là màng nitrocellulose Hiện nay trên thị trường có 2 loạimànglọc thường được sử dụng là màng lọc có đường kính lỗ lọc là 0,22 µm và màng lọc0,45µm

2.3.2.4 Kh trùng b ng b c xử trùng ằng thuỷ tinh khác ức nóng ướt ạ

- Tia tử ngoại: Bức xạ thường dùng nhất là tia UV Dòng tia UV diệt trùng không khí

phòng bệnh viện, phòng vô trùng Tia UV chỉ khử trùng bề mặt mà không thấm sâu vào bên trong mẫu vật

- Tia âm cực: Diệt trùng các dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm, tia âm cực có thể tiêu diệt các vật đã cho vào bao gói kín

BÀI 3 : MÔI TR ƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT NG NUÔI C Y VI SINH V T ẤY VI SINH VẬT ẬT

3.1 HÓA CH T – V T LI U – D NG CẤY VI SINH VẬT ẬT ỆM VI ỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH ỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH

3.1.1 Hóa ch t – v t li uấy ật liệu ệm3.1.2 D ng cụng cụ thuỷ tinh ụng cụ thuỷ tinh

- Ống đong

- Phểu thủy tinh

- Giấy lọc, giấy bao gói

- Bông không thấm nước, bông y tế

Vì vậy, khi xây dựng các môi trường dinh dưỡng tổng hợp cần phải biết rõ nhu cầudinh dưỡng của vi sinh vật và đặc điểm trao đổi chất chủ yếu của chúng Cần lưu ý rằngnồng độ các chất dinh dưỡng đưa vào phải thích hợp để duy trì mức độ cân bằng về ápsuất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật Như vậy sẽ đảm bảo được sự pháttriển tốt của chúng trên môi trường nuôi cấy

3.2.2 Các yêu c u c b n c a môi trầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng ơng pháp bao gói ản của môi trường dinh dưỡng ủ ấm và autoclave ường dinh dưỡngng dinh dưỡngng

- Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

- Có độ pH thích hợp

- Có độ nhớt nhất định

- Không chứa các yếu tố độc hại

- Tuyệt đối vô trùng

3.2.3 Phân lo i môi trạ ường dinh dưỡngng dinh dưỡngng Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường

3.2.3.1 D a vào thành ph n và ngu n g cựa vào thành phần và nguồn gốc ầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng ồn gốc ốc

- Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoaitây, dịch chiết nấm men, đường, cám Thành phần hóa học của loại môi trường khôngđược xác định chính xa1cdo sự không ổn định của sản phẩm tự nhiên

- Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định

và định lượng một cách cụ thể và chính xác

- Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên

3.2.3.2 D a vào tính ch t lý h cựa vào thành phần và nguồn gốc ấy ọc

- Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử dụng

để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật

- Môi trường đặc: môi trường này chứa 1,5 – 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin Môitrường này được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật

- Môi trường bán rắn: chỉ chứa 0,3 – 0,7% agar

3.2.3.3 D a vào công d ngựa vào thành phần và nguồn gốc ụng cụ thuỷ tinh

- Môi trường cơ bản: thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau

- Môi trường chọn lọc: là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của một loài haymột nhóm loài vi sinh xác định nào đó

- Môi trường kiểm định: là môi trường cho phép phân biệt được một số đặc điểm củamột số loài vi khuẩn xác định Thông thường, người ta cho vào môi trường chất chỉ thịmàu để tạo ra những màu đặc trưng

3.2.4 Phương pháp bao góing pháp pha môi trường dinh dưỡngng Pha môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồngthời nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng

3.2.4.1 Nguyên t c pha môi trắc ường dinh dưỡngng

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinhdưỡng của từng loài vi sinh vật

- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và vi sinh vật nên cầnđiều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường dinh dưỡng

- Đảm bảo các điều kiện hóa, lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật

3.2.4.2 Các bướtc pha môi trường dinh dưỡngng dinh dưỡngng

 Cân các thành phần của môi trường cho vào nước cất

 Cân agar rồi cho vào dung dịch trên

b Làm trong môi trường

Việc làm trong môi trường giúp ta dễ dàng quan sát sự phát triển của vi sinh vật Vàcông đoạn làm trong môi trường chỉ thực hiện đối với môi trường lỏng bằng cách sửdụng vải thưa hoặc giấy lọc Còn đối môi trường thạch, muốn lọc trong thì phải tiếnhành lọc môi trường trước khi cho agar vào và cách lọc tương tự như môi trường lỏng

Ghi chú: Việc lọc trong này chỉ được thực hiện đối với những loại môi trường tự

nhiên Còn đối với môi trường tổng hợp và bán tổng hợp thì bước này không cần thiết

c.Điều chỉnh độ pH của môi trường

- Dùng HCl 1N hoặc NaOH 1N để điều chỉnh pH

- Muốn kiểm tra độ pH, ta sử dụng máy đo pH vì nó nhạy và cho độ chính xác cao Nếukhông có thể sử dụng giấy quỳ để đo pH nhưng không có độ chính xác cao

d Phân phối môi trường vào dụng cụ

Người ta thường phân phối môi trường vào đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác.Trình tự phân phối như sau:

- Đun cho môi trường hóa lỏng

- Một tay giữ dụng cụ chứa môi trường

- Tay còn lại kẹp nút bông và kéo ra

- Nhanh tay đổ môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại

Chú ý:

- Đối với ống ngiệm: Nếu môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần đượcphân phối chiếm ¼ thể tích ống ngiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cầnđược phân phối chiếm ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm

- Đối với bình cầu hay bình tam giác: lượng môi trường được phân phối chiếm ½ - ¾ thểtích bình

- Các thao tác phân phối phải nhanh gọn, khéo léo để môi trường không dính vào miệngdụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần được thực hiện xong trước khi môi trường

- Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn

- Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao

f Làm thạch nghiêng, thạch đứng và đổ thạch vào đĩa petri

- Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường và môi trườngchưa đông đặc

 Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng và không được để môi trườngchạm vào nút bông

 Để yên cho đến khi môi trường đông đặc Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn vàliên tục

 Mở bao giấy gói các đĩa petri

 Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường

 Tay còn lại mở nút bông và hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn

 Mở hé nắp đĩa petri Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri

 Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa

 Để yên cho môi trường đông đặc

 Lật ngược đĩa lại và bảo quản

Chú ý

-Thao tác đổ môi trường phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn

-Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm Thông thường cứ khoảng200ml môi trường sẽ phân phối được từ 22 – 25 đĩa

-Sau khi phân phối môi trường vào đĩa petri, kiểm tra lại xem môi trường có bịnhiễm khuẩn sau 1- 2 ngày ( nếu cần thiết )

-Ghi chú môi trường ( tên môi trường, ngày khử trùng, hạn sử dụng )

g Bảo quản và kiểm tra môi trường

- Môi trường chưa sử dụng được bảo quản ở chỗ mát ( 0 - 5ºC ) và không để môi trường

bị khô

- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt vào

tủ ấm 37ºC trong một thời gian nhất định Loại bỏ môi trường bị nhiễm khuẩn và chỉ sửdụng môi trường đạt yêu cầu

3.3 CÔNG TH C VÀ CÁCH PHA M T S MÔI TRỨC VÀ CÁCH PHA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG ỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG Ống nghiệm ƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬTNG THÔNG D NGỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH

3.3.1 Môi trường dinh dưỡngng nuôi c y vi khu n ( cao th t – pepton )ấy ẩn ( cao thịt – pepton ) ị khác Công thức:

- Cao thịt: 5g

- Pepton: 10g

- Nước cất: 1000ml

Cách pha môi trường nuôi cấy:

-Cân chính xác và cho các thành phần của môi trường vào trong cốc chứa sẵn 1 ít nước-Khuấy cho tan hết và thêm lượng nước theo yêu cầu

-Đun lên cho tan hoàn toàn

-Để nguội và lắng dung dịch vừa đun

-Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng

Hình: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

3.3.2 Môi trường dinh dưỡngng nuôi c y n m mem ( Hansen )ấy ấy Công thức:

- Glucose hoặc Maltose: 50g

Cách pha chế môi trường nuôi cấy:

- Cân chính xác và cho các thành phần của môi trường vào trong cốc chứa sẵn 1 ítnước

- Khuấy cho tan hết và thêm lượng nước theo yêu cầu

- Đun lên cho tan hoàn toàn

- Để nguội và lắng dung dịch vừa đun

- Hấp khử trùng chai môi trường