BÁO cáo THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH học ỨNG DỤNG TRONG bảo vệ THỰC vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT GVHD: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu TS Hồ Bảo Thùy Quyên Nhóm sinh viên thực hiện: Nhóm Trần Hồng Ngọc Huyền 1753010090 Thái Thị Thúy Kiều 1753010106 Lê Thị Ý 1753010310 Ngày 31 tháng năm 2020 Bài 1: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN NỘI SINH I Các bước thực Thu thập xử lý mẫu (Khử mẫu) Mẫu cúc xuyến chi Rửa vòi nước chảy mạnh Lấy phần làm mẫu khử (Cắt đoạn – 4cm) Ngâm mẫu ethanol 70%, phút Ngâm trung dịch javel, 3-5 phút Ngâm ethanol 70%, 30s – phút Rửa mẫu với lần nước cất vô trùng Kiểm tra mẫu (200µl nước cất vơ trùng rửa mẫu lần trang lên đĩa môi trường NA PDA, ủ 370C 24 Đặt mẫu lên giấy thấm vô trùng cho nước Phân lập làm Chọn mẫu khử trùng đạt yêu cầu + 10ml nước cất vô trùng Dùng chày vô trùng nghiền mịn mẫu 200µl dịch nghiền mẫu cho vào ống mơi trường NA bán đặc ủ 300C, 1-3 ngày Lấy sinh khối vi khuẩn tăng sinh, cấy ria đĩa môi trường NA ủ 300C, 1-3 ngày Chọn khuẩn lạc rời cấy cấy ria đĩa môi trường NA (làm lần 1) Tiếp tục làm đến có loại khuẩn lạc đĩa Cấy giữ chủng vào ống thạch nghiêng NA (40C) II Kết Kiểm tra mẫu khử trùng A B C Hình 1: Kết kiểm tra mẫu khử trùng A: Kiểm tra mẫu khử trùng môi trường PDA NA Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kiểm tra mẫu khử trùng môi trường PDA NA Thái Thị Thúy Kiều C: Kiểm tra mẫu khử trùng môi trường PDA NA Lê Thị Ý  Nhận xét: - Trên đĩa mơi trường NA có diện số khuẩn lạc  Đại diện nhóm khử mẫu nên việc thao tác chưa thực  Có thể cịn số vi khuẩn bề mặt xử lý chưa đạt  Do thao tác thực gây vấy nhiễm VSV khác - Trên đĩa mơi trường PDA khơng có diện nấm  Mẫu khử trùng chưa loại bỏ nấm bề mặt  Vì có mẫu nước khử để sử dụng nên đĩa C đốt que trang nóng nên đĩa NA PDA khơng có xuất khuẩn lạc hay nấm Phân lập làm a Kết trình tăng sinh mẫu cần phân lập Có xuất lớp màng mỏng pellicle cách mơi trường ni khoảng 0.5cm thị có xuất vi sinh vật nội sinh Hình 2: Kết trình tăng sinh mẫu b Kết trình phân lập vi khuẩn sau tăng sinh A B C Hình 3: A: Kết trình phân lập vi khuẩn Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết trình phân lập vi khuẩn Thái Thị Thúy Kiều C: Kết trình phân lập vi khuẩn Lê Thị Ý c Kết trình làm A B Hình 4: A: Kết trình C làm lần Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết trình làm lần Thái Thị Thúy Kiều C: Kết trình làm lần Lê Thị Ý  Nhận xét: - Trên đĩa phân lập A xuất khuẩn lạc có hình thái giống nhau, cần nhuộm gram để so sánh với mẫu Bacillus PTN - Đĩa B C có khuẩn lạc có hình thái giống d Kết trình giữ chủng A B C Hình 6: A: Kết cấy giữ chủng Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết cấy giữ chủng Thái Thị Thúy Kiều  Nhận xét: - Kết trình cấy giữ chủng không bị xâm nhiễm bới sinh vật lạ III Khảo sát số đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus sp phân lập Quan sát hình thái khuẩn lạc trạng thái sống Hình 7: Hình thái khuẩn lạc môi trường thạch Nhuộm gram a Các bước nhuộm gram Nhỏ giọt nước lên phiến kính Tạo huyền phù với vi khuẩn Hơ nóng nhẹ, cố định mẫu Nhuộm với Crystal violet (1-2 phút), rửa nước Nhỏ dung dịch lugol (30 giây), rửa nhẹ lại với nước Tẩy cồn 960 (15-30 giây), rửa lại với nước Nhuộm với safarin O (1 phút), rửa lại với nước Thấm khơ phiến kính, quan sát kính hiển vi 10 b Kết nhuộm gram B A C Hình A: Kết nhuộm gram chủng Bacillus sp phịng thí nghiệm Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết nhuộm gram chủng Bacillus sp phòng thí nghiệm Thái Thị Thúy Kiều C: Kết nhuộm gram chủng Bacillus sp phịng thí nghiệm Lê Thị Ý A B C Hình 9: A: Kết nhuộm gram chủng phân lập Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết nhuộm gram chủng phân lập Thái Thị Thúy Kiều C: Kết nhuộm gram chủng phân lập Lê Thị Ý 11 Thử nghiệm catalase a Cách thực Nhỏ giọt H2O2 3% lam kính Dùng que cấy lấy sinh khối khuẩn lạc hòa vào giọt H2O2 b Kết Hình 10: Kết thử nghiệm catalase chủng Bacillus sp phịng thí nghiệm A B C Hình 11: A: Kết thử nghiệm catalase chủng phân lập Trần Hồng Ngọc Huyền B: Kết thử nghiệm catalase chủng phân lập Thái Thị Thúy Kiều C: Kết thử nghiệm catalase chủng phân lập Lê Thị Ý 12 IV Báo cáo kết Bảng 1: So sánh tiêu quan sát đại thể vi thể vi khuẩn Chủng Các tiêu Khuẩ Hình dạng Màu sắc n lạc Bề mặt Hình thái Hiển vi Cách bắt màu Bào tử Di động Catal ase Dương/âm Bacillus sp phịng thí nghiệm Mép cưa Vàng nhạt Nhăn nheo Hình trực ngắn Tím Hình bầu duc Có Chủng phân lập Chủng phân lập Trần Hồng Thái Thị Ngọc Huyền Thúy Kiều Mép tròn, lồi Trắng đục Trơn Mép cưa Vàng xanh Hơi nhăn Hình cầu Hình trực ngắn Tím Tím Chưa xác định* Chưa xác định* Chưa xác Chưa xác định** định** + + + Chủng phân lập Lê Thị Ý Mép cưa Vàng xanh Hơi nhăn Hình trực ngắn Tím Chưa xác định* Chưa xác định** + *: Cần phải thực kỹ thuật nhuộm bào tử xác định có bào từ hay khơng **: vi khuẩn q nhỏ nên quan sát đc 13 Bài 2: ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH ( DNA BARCODE) HỖ TRỢ DDIHJ DANH CƠN TRÙNG I: Quy trình thực Dùng dao cắt chân trùng Ly trích (ngâm mẫu cồn tuyệt đối) Thấm khơ mẫu Nghiền mẫu 20µl NaOH 50% Ủ 95°C, 15 phút Làm trung tính mẫu 2µl strip HCL 14 II: phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR - Master mix: 6µl - Mồi xi COI 1490 ( 10µM/ml): 0.75µl - Mồi ngược COI 2198 ( 10µM/ml): 0.75µl - DNA: 4µl - H2O: 0.5µl - Tổng: 12µl Chu kỳ cho phản ứng PCR Bước Nhiệt độ (°C) 95 95 72 72 4 Thời gian phút 30 giây 30 giây 30 giây 10 phút Số chu kỳ 35 1 Đổ gel chạy điện di a Đổ gel 1g agarose + 100 ml dung dịch TAE 15 Đun lị vi sóng đến tan Để nguội 60°C đổ vào khn có để sẵn lược Để nguội chô khuôn vào bể b Chạy điện di Đổ đầy TAE 1X ngập khay điện di Hút 1µl dung dịch Gelred + 4µl DNA trộn mảnh paraffin ( thang chuẩn: 1µl thang chuẩn ladder + 1µl Gelred) Cắm điện cực cho dịng điện chạy từ (-) sang (+) III: Kết Kết đo OD Hình 12 A: Kết đo OD Trần Hồng Ngọc Huyền A B: Kết đo OD Thái Thị Thúy Kiều B C C: Kết đo OD Lê Thị Ý - Hàm lượng DNA: Huyền: OD260 × 50 × nồng độ pha lỗng = 0,358 ì 50 ì 100= 1790 àg/ ml í: OD260 × 50 × nồng độ pha lỗng = 0,598 × 50 × 100 = 2990 µg/ ml Kiều: OD260 × 50 × nồng độ pha loãng = 0,378 × 50 ì 100 = 1890 àg/ ml 16 - tinh DNA: Tỉ lệ 260/280 < 1,8: Mẫu bị tạp nhiễm OD 260 nm 280 nm 260/280 - Huyền 0,358 0,367 0,97 Ý 0,598 0,419 1,43 Kiều 0,378 0,367 1,03 Kết quả: Cả ba mẫu có tỉ lệ 260/280 < 1,8 => Mẫu bị tạp nhiễm, chưa tinh - Biện luận: + Mẫu nhiễm tạp chất sai sót q trình thao tác, dụng cụ đo mật độ quang chưa vệ sinh kĩ + Trong sản phẩm chứa nhiều protein cần phải sử lý thêm Protease K Kết điện di A C B 17 Hình 14: A: Kết điện di mẫu DNA côn trùng Ngọc Huyền B: Kết điện di mẫu DNA côn trùng Thúy Kiều A: Kết điện di mẫu DNA côn trùng Lê Thị Ý  Kết quả: - Mẫu DNA C xuất sản pahmar 700 bp giống với kích thước lúc khảo sát, mẫu A B xuất smear, chưa khuyếch đại thành công gen mong muốn  Biện luận: - Nguyên nhân là: Mẫu bị tạp nhiễm, nhiệt độ bắt cặp DNA không đảm bảo  Giải trình tự - Các sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen COI có kết dương tính (kích thước khoảng 700 bp với COI gửi giải trình tự cơng ty) 18 ... pellicle cách mơi trường ni khoảng 0.5cm thị có xuất vi sinh vật nội sinh Hình 2: Kết trình tăng sinh mẫu b Kết trình phân lập vi khuẩn sau tăng sinh A B C Hình 3: A: Kết trình phân lập vi khuẩn Trần... Cần phải thực kỹ thuật nhuộm bào tử xác định có bào từ hay khơng **: vi khuẩn q nhỏ nên quan sát đc 13 Bài 2: ỨNG DỤNG DNA MÃ VẠCH ( DNA BARCODE) HỖ TRỢ DDIHJ DANH CƠN TRÙNG I: Quy trình thực Dùng... phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR - Master mix: 6µl - Mồi xi COI 1490 ( 10µM/ml): 0.75µl - Mồi ngược COI 2198 ( 10µM/ml): 0.75µl - DNA: 4µl - H2O: 0.5µl - Tổng: 12µl Chu kỳ cho phản ứng PCR