Báo cáo thực hành vi sinh đại cương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH *** BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG Giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Hồng Thủy Nhóm sinh viên thực hiện: Võ Phạm Danh Trần Đình Đức Đặng Võ Phong Trần Thị Tuyết Nguyễn Hữu Xuân 17111020 17111028 17125215 17111164 17111177 11 – 2018 MỤC LỤC BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG BÀI 2: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG .6 BÀI 3: PHÂN LẬP GIỐNG THUẦN KHIẾT .7 BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP CẤY VI KHUẨN BÀI 5: 11 CÁCH QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT 11 BÀI 6: 14 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM 14 BÀI 7: 18 PHƯƠNG PHÁP THỬ PHẢN ỨNG SINH HÓA 18 BÀI 8: 23 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 23 BÀI 9: 25 PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT .25 MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT VSV: Vi sinh vật VK: Vi khuẩn THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG I   MỤC ĐÍCH Khử trùng (Sterilisation) khu vực thí nghiệm, dụng cụ thiết bị xung quanh Làm chết hồn tồn mầm móng VSV, kể VSV có bào tử Tránh phát triển lẫn lộn hệ VSV ngoại lai vào giống VSV nghiên cứu II CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG Phương pháp vật lý: 1.1 Khử trùng nhiệt: 1.1.1 Nhiệt khô: Hơ lửa đèn cồn: dụng cụ cấy kim loại (que cấy), thủy tinh Flaming (đốt cháy) - Tủ sấy Lò sấy: ống thủy tinh, ống nghiệm, bình tam giác… Gói sấy 160 180 30 phút 1.1.2 Nhiệt ẩm: Phương pháp Pasteur: diệt VK gây bệnh, không diệt bào tử VK hoại sinh Nhiệt độ 70-750C 10-15 phút Phương pháp Tyndall (chưng cách thủy nhiều lần): nhiệt độ 70-800C ngày, tiến hành ngày liên tiếp - Nước sôi: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết VSV Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử Nhiệt độ 1000C, phút Dùng Autoclave (hơi nước bão hòa áp suất cao): 1210C/20 phút: mơi trường có VK 105-1150C /15-20 phút: môi trường dinh dưỡng 1.2 Diệt trùng cách lọc Dụng cụ lọc thường màng xốp sứ, aminate, cellulose,… có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45 µm, thường dùng để lọc vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt Máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ VK để khử trùng khơng khí 1.3 - Diệt trùng xạ Tia tử ngoại hay UV: sát trùng bề mặt, không xuyên sâu Tia âm cực: dùng diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm gói kính 2.1 2.2 III - Phương pháp hóa học: Sát trùng ngồi da: cồn, xà phòng, iode, phẩm màu (như xanh methylene) Diệt khuẩn, tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor… CÁC BIỆN PHÁP AN TỒN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Những người khơng có nhiệm vụ khơng vào phòng thí nghiệm Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng Rửa tay kỹ với xà phòng (hoặc cồn) trước sau thực thao tác cấy Cẩn thận bảo vệ mắt vùng da bị trầy xước để tránh nhiễm khuẩn Trước sau kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn cồn 70% dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) lau khô giấy vệ sinh - Sử dụng mẫu xét nghiệm, gốc VK cách cẩn thận tránh ngoại nhiễm - Sau dùng phải khử khuẩn tất dụng cụ Không hút thuốc hay ăn uống phòng thí nghiệm Đối với phòng vơ trùng hay tủ cấy vơ trùng có trang bị đèn cực tím (tia UV): mở đèn trước làm việc phải khỏi phòng tránh bị ảnh hưởng làm hỏng mắt da Lưu ý: Cần đọc trước để hiểu nội dung công việc làm Thực thí nghiệm theo hướng dẫn giảng viên, gặp vướng mắc, không rõ cẩn hỏi lại giảng viên hướng dẫn THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 2: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG I PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG Dựa vào cơng dụng - Môi trường bản: môi trường dùng để nuôi cấy hầu hết loại VSV hoại sinh - Môi trường tiềm tăng sinh: môi trường tăng sinh không chọn lọc Môi trường tăng sinh: môi trường tăng sinh chọn lọc Môi trường phân lập: môi trường chọn lọc dạng đặc Môi trường phân biệt: môi trường phân lập bổ sung chất thị - Mơi trường thử phản ứng sinh hóa: mơi trường chẩn đốn phản ứng phân biệt dùng để xác định vài tính chất sinh hóa dòng VK phân lập Dựa vào thành phần Môi trường tự nhiên Môi trường bán tổng hợp Mơi trường tổng hợp Dựa vào tính chất lý học Môi trường dạng lỏng hay môi trường dịch thể: tăng sinh, tiềm tăng sinh, giữ giống (môi trường canh thịt, pepto) Môi trường đặc: cấy phân lập, cấy truyền, đếm tế bào VSV Môi trường bán lỏng: nghiên cứu di động VSV → định danh VSV THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 3: PHÂN LẬP GIỐNG THẦN KHIẾT I MỤC ĐÍCH Giống khiết giống VSV tạo từ tế bào ban đầu Mục đích: Tách rời khuẩn lạc để tạo giống VSV khiết Bảo tồn VSV ni khiết Để nghiên cứu hình thái, tính chất vật lý, sinh hóa VSV II CÁCH TIẾN HÀNH Tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể VSV ban đầu Phân lập VSV khiết Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc Các phương pháp: Pha lỗng Cấy ria (thơng dụng nhất) Pha lỗng dàn lên mơi trường đặc Phân lập bình chân khơng Sau ni cấy nhiệt độn thích hợp, tùy thuộc vào đặc điểm nhóm VSV cần phân lập, sau 24-48h thu khuẩn lạc riêng rẽ cho dòng VSV Kiểm tra độ tinh khiết khuẩn lạc Phương pháp kiểm tra độ khiết: kiểm tra với cấy môi trường thạch đĩa, kiểm tra độ khuẩn lạc, kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc so với khuẩn lạc chủng mẫu, kiểm tra hình dạng VSV phương pháp làm tiêu nhuộm soi kính hiển vi, tiến hành thực số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng Phương pháp lưu trữ: bảo quản môi trường thạch nghiên, phương pháp lạnh sâu, phương pháp đông khô III KẾT QUẢ THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP CẤY VI KHUẨN I MỤC ĐÍCH Cấy truyền VK từ mơi trường chúng sống sang mơi trường để chúng tiếp tục phát triển điều kiện thuận lợi Mục đích: Bảo tồn VK ni khiết Ly trích VK có nước, mẫu đất, mẫu thực phẩm, mẫu bệnh lý II CÁCH TIẾN HÀNH Các bước cấy truyền: Lau bàn rửa tay, khử trùng alcol Ngồi đối diện đèn cấy Giá ống nghiệm để bên trái Tất dụng cụ lại bên phải Chuẩn bị ống môi trường để cấy: ghi tên VK cần cấy ngày cấy Tay phải cầm que cấy cầm bút viết khử trùng lửa đèn cồn nóng đỏ dây cấy Tay trái cầm ống nghiệm có VK xi theo lòng bàn tay Tay phải nắm nút bơng ngón út cạnh bàn tay, tay trái xoay nghẹ ống nghiệm, kéo nút bơng Hơ nóng để khử trùng khơng khí miệng ống nghiệm Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với VK ống giống Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng ống nghiệm dậy nút lại Lấy ống môi trường mới, mở nút khử trùng miệng ống nghiệm Thực cấy VK Khi cấy xong, hơ nóng lại đầu ống nghiệm đậy nút lại đặt lên giá ống nghiệm Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong Nếu ống giống mơi trường lỏng có VK dùng pipet hút mơi trường thay que cấy THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG 10 BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM I   MỤC ĐÍCH Quan sát hình dạng kích thước tế bào vi sinh vật Nhằm phân biệt lồi VK thành hai nhóm Gram (-) Gram (+) dựa đặc tính hóa lý thành tế bào II CÁCH TIẾN HÀNH Bước 1, dàn tiêu cố định tiêu bản: - Dùng que cấy vô trùng lấy VK từ ống thạch nghiêng (hoặc dịch thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hòa vào giọt nước muối sinh lý nước vơ trùng phiến kính, để khơ khơng khí Cố định tiêu cách hơ nhanh lửa đèn cồn 2-3 lần, để giết chết VK, gắn chặt VK vào phiến kính làm vết bôi bắt màu tốt (do VK chết bắt màu tốt VK sống) Bước 2, nhuộm màu: Thứ nhất, nhuộm tiêu Crystal violet phút, rửa nước Thứ hai, nhuộm lugol phút, rửa nước Thứ ba, khử màu: Tẩy cồn 30s (cho đến vừa thấy màu), rửa nước Thứ tư, nhuộm tiếp Fucshin phút, rửa nước Bước 3, quan sát kết quả: Thấm khô quan sát vật kính 100 giọt dầu III Thứ tự KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH Thuốc thử Grystal Violet Lugol Tẩy màu Fuchsin Gram (+) Tím Tím Tím Tím Gram (-) Tím Tím Khơng màu Hồng 14 Kết Tím Hồng Bắt màu tím: Gram (+) Bắt màu hồng: Gram (-) a) E coli: trực khuẩn, màu hồng, Gram (-) b) Bacillus: trực khuẩn, màu tím, G (+) c) Staphylococcus: trực khuẩn, màu tím (G+) d) Streptococus: cầu khuẩn, màu hồng (-) 15 e) Aeromonas hydrophila: trực khuẩn, màu hồng, G(-) f) Nấm men: cầu khuẩn (thành cụm), nhuộm đơn Giải thích: Gram (+) có vách tế bào dày (15-50 mm), dạng lưới, cấu tạo peptidoglycan có khả giữ phức hợp tím tinh thể iode 16 Trong Gram (-), vách tế bào peptidoglycan mỏng có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngồi Sau nhuộm với phức hợp tím tinh thể iode, mẫu xử lý tiếp với hỗn hợp khử màu, làm núc lớp peptidoglycan vách tế bào Gram dương, từ làm giảm khoảng trống phân tử khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể iode bên tế bào 17 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 7: PHƯƠNG PHÁP THỬ PHẢN ỨNG SINH HĨA I MỤC ĐÍCH Phân loại định danh VK Khảo sát tính chất sinh lý VK II CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA Phản ứng SIMMON CITRATE (SC) Dùng để thử phản ứng phân giải Citrate Giải thích: Một số VK có khả sử dụng citrate nguồn Carbon môi trường tổng hợp vô Khi Citrate bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối CO2 có thăng ion (sự phóng thích NH3) làm mơi trường bị kiềm hóa, chuyển từ màu xanh sang màu xanh dương đậm Môi trường: môi trường thạch Simmons citrat (dạng đông khô) điều chế theo thể thạch nghiêng Thành phần môi trường chứa thị màu xanh bromtymol Kết quả: (Sau ủ 37 48h) - Kết dương(+): VK mọc mặt thạch nghiêng với đổi sang màu xanh dương hàn toàn, chút hay không Kết âm(-): VK không mọc thạch không đổi màu môi trường Phản ứng KIA Môi trường KIA (Kligler’s iron agar) dùng để quan sát lên men đường glucose, lactose khả sinh khí H2S, khí H2 CO2 VK Trong mơi trường có thị màu phenol red dùng để phát khả lên men đường VK Đây môi trường đặc, chuẩn bị ống nghiệm thể thiêng sâu Kết quả: 18 - Phần sâu phần nghiêng giữ màu đỏ: lactose âm (Lac-(K)), Glucose âm - (Glu-(K)), kí hiệu (K/K) Phần sâu bị acid hóa đổi màu vàng, phần nghiêng giữ màu đỏ: Lac-(K), Glu+ (A), kí hiệu: K/A Phần nghiêng sâu đổi màu vàng: Lac+(A), Glu+(A), kí hiệu A/A Có khả sinh khí, nứt thạch Phản ứng indol Gỉa thích: Một số VK có khả thủy giải trytophan môi trường thành indol Nhân pyrol kết hợp với p-dimetylamino benzaldehyt thuốc thử Kovacs tạo thành phức chất dạng quinon màu đỏ tía mặt thống môi trường Kết quả: sau ủ 37 48h, nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovacs vào - Phản ứng Indol dương (+): vòng màu đỏ sẫm xuất bề mặt môi trường Phản ứng Indol âm (-): bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng thuốc thử III Kết AE môi trường Simmon citrate (SC) Môi trường SC xanh → xanh dương → Phản ứng SC (+) - AE môi trường Simmon citrate (SC) Môi trường từ xanh → xanh dương, 2/3 ống nghiệm → Phản ứng SC (+) 19 AE môi trường KIA Trên màu đỏ, màu vàng cam Đẩy đáy, nứt thạch Váng tạo đục → Sinh (+); Sinh H2S (-); Glu (+); Lac (-) Stephylococcus môi trường KIA: làm nứt thạch, tạo sợi trắng → Glu (-), Lac (-), sinh (+), sinh H2S (-) 20 Staphylococcus mơi trường KIA Váng tạo đục Trên có chút màu đỏ, vàng, nứt thạch → Sinh (+); sinh H2S (-); Glu (+); Lac (-) Phản ứng indol - Streptococcus: mặt thoáng màu vàng → Indol (-) 21 22 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 8: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI I Mục đích: Sử dụng kính hiển vi để quan sát đếm tế bào VSV: nấm mốc, nấm men, VK II Cấu tạo: Cấu tạo kính hiển vi III - Cách sử dụng Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh nguồn sáng để ảnh sáng thị trường Bao xem mẫu vật vật kính nhỏ trước 10 Đặt tiêu lên bàn kính kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào tâm nguồn sáng 23 - Nhìn kính mang vật (lame), vặn nhẹ ốc sơ cấp xuống đến đầu vật kính 10 sửa chạm nhẹ lame Sau đó, nhìn vào thị kính, vặn nhẹ ốc sơ cấp lên đến nhìn thấy rõ hình ảnh mẫu vât Nếu chưa rõ chi tiết vặn nhẹ ốc vi cấp để thấy rõ Muốn xem độ phóng đại lớn 40 đưa phần muốn xem vào thị trường Nhìn bên ngồi lame, vặn sang vật kính lớn 40 cho khơng đụng lame Vặn nhẹ ốc sơ cấp lên dùng ốc vi cấp để chỉnh rõ hình ảnh Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại lớn 100: Đầu tiên ta dùng vật kính có độ phóng đại nhỏ để xác định vi trí cần tìm tiêu Sau nhỏ giọt dầu cèdre lên tiêu bản, đổi sang vật kính có độ phóng đại lớn 100 Điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh mẫu vật vật kính chìm giọt dầu Vai trò dầu cèdre sử dụng vật kính 100 Khi sử dụng vật kính 100 phải nhỏ giọt dầu cèdre lên mẫu vật dầu cèdre có tác dụng tập trung ánh sáng vào vật kính giúp cho quan sát ảnh rõ (vì dầu cèdre tạo mơi trường đồng chiết suất với thủy tinh n = 1,5) Một số lưu ý: - Khi thấu kính bẩn lau nhẹ vải bơng mềm, sạch, tránh làm xước thấu kính Khi quan sát, cần thường xuyên nhấp nháy ốc vi cấp để thấy đầy đủ mặt phẳng khác Vì ảnh thấy kính hiển vi ln ngược chiều vật quan sát Để cho hình ảnh thuận chiều muốn xem, dễ quan sát đặt tiêu phải để ngược chiều Nên mở hai mắt để quan sát Ở độ phóng đại lớn cần nhiều ánh sáng Khơng tự ý mở tháo kính, bật tắt làm cháy đèn Dùng sau phải lau kính sẽ, tắt điện trả lại vị trí cụ Q trình di chuyển cầm chắn khung tay cầm, tránh va chạm 24 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 9: PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH Nhằm xác định số lượng VSV thể tích hay trọng lượng mẫu định II CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM THƯỜNG DÙNG Có phương pháp thường dùng: - Đếm trực tiếp phòng đếm hồng cầu (đếm tế bào nấm men) Đếm gián tiếp số lượng VSV cách đếm số khuẩn lạc mọc mơi trường - đặc Phương pháp pha lỗng tới hạn Cả phương pháp đầu trải qua giai đoạn: Thu mẫu Lấy mẫu có tính chất đại diện Mẫu lấy xong phải phân tích ngày Tất dụng cụ chứa mẫu phải khử trùng Pha loãng mẫu 25 Bước 1: cắt 1g mẫu bệnh, giã mẫu cho nát cho vào 99ml muối sinh lý hay nước cất vô trùng khuấy Bước 2: chuẩn bị số ống chứa 9ml nước muối sinh lý nước cất vô trùng Bước 3: lấy 1ml dung dịch mẫu gốc cho vào ống nghiệm chuẩn bị, ta dung dịch có hệ số pha lỗng 10-1 Bước 4: lấy 1ml dung dịch mẫu gốc có hệ số pha loãng 10-1, cho vào ống nghiệm khác , ta dung dịch có hệ số 10-2, tiếp thục làm để thu dung dịch có hệ số pha loãng 10-3… III TIẾN HÀNH QUAN SÁT ĐẾM SỐ LƯỢNG (BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU) Cách thực Lắc ống nghiệm chứa mẫu pha loãng mẫu Đặt kính lên lưới đếm Dùng ống hút vơ trùng lấy giọt đưa vào mép kính, giọt mẫu qua kính tự trải lưới Cơng thức tính = đó: A: số tế bào đếm ô lớn b: số ô vuông nhỏ ô lớn 103: hệ số chuyển đổi mm3 ml 10n: hệ số pha loãng 26 Lưu ý: Chỉ đếm tổng số tế bào, biết tế bào sống, tế bào chết Nồng độ dịch pha loãng cho mật độ ô nhỏ không 10 tế bào Sử dụng xong phải rửa lau khô buồng đếm Để đạt độ xác cao, số tế bào trung bình đếm ô nhỏ : a 10 Để quan sát đếm số lượng tế bào VSV, ta dùng thêm phẩm màu IV Kết Pha lỗng 10-2 lần Đếm lớn: - Ô 1: 28 27 - Ô 2: 25 Ô 3: 27 Ô 4: 30 Ô 5: 55 Tổng cộng: 165 Ta có: = = 206.250.000 tế bào/ml Pha lỗng 10-3 lần Đếm lớn: Ơ 1: Ô 2: Ô 3: Ô 4: Ô 5: Tổng cộng: 18 = = 237.500.000 tế bào/ml Cách làm nút bông: - Làm nút không thấm nước, loại sợi dài Mục đích: Ngăn ngừa chất từ môi trường nuôi cấy vào miệng tránh nhiễm tạp 28 ... dùng pipet hút môi trường thay que cấy THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG 10 BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 5: CÁCH QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT I MỤC ĐÍCH Quan sát đại thể Vi khuẩn: quan sát khuẩn lạc đĩa petri... bên tế bào 17 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 7: PHƯƠNG PHÁP THỬ PHẢN ỨNG SINH HĨA I MỤC ĐÍCH Phân loại định danh VK Khảo sát tính chất sinh lý VK II CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA Phản... → Sinh (+); sinh H2S (-); Glu (+); Lac (-) Phản ứng indol - Streptococcus: mặt thoáng màu vàng → Indol (-) 21 22 THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 8: CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI