Báo cáo thực hành vi sinh đại cương

- Phương pháp Tyndall chưng cách thủy nhiều lần: ở nhiệt độ 70-800C trong 1 giờ mỗi ngày, tiến hành trong 3 ngày liên tiếp.- Nước sôi: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH

ĐẠI CƯƠNG

Giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Hồng Thủy

Nhóm sinh viên thực hiện:

MỤC LỤC

BÀI 1: 3

PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 3

BÀI 2: 6

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 6

BÀI 3: 7

PHÂN LẬP GIỐNG THUẦN KHIẾT 7

BÀI 4: 9

PHƯƠNG PHÁP CẤY VI KHUẨN 9

BÀI 5: 11

CÁCH QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT 11

BÀI 6: 14

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM 14

BÀI 7: 18

PHƯƠNG PHÁP THỬ PHẢN ỨNG SINH HÓA 18

BÀI 8: 23

CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 23

BÀI 9: 25

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT 25

MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT

VSV: Vi sinh vật

VK: Vi khuẩn

PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG

I MỤC ĐÍCH

 Khử trùng (Sterilisation) khu vực thí nghiệm, dụng cụ và thiết bị xung quanh

 Làm chết hoàn toàn mọi mầm móng VSV, kể cả các VSV có bào tử Tránh sự phát triển lẫn lộn giữa các hệ VSV ngoại lai vào giống VSV đang nghiên cứu

Flaming (đốt cháy) Tủ sấy

- Lò sấy: ống thủy tinh, ống nghiệm, bình tam giác… Gói và sấy ở 160℃ trong 2giờ hoặc 180℃ trong 30 phút

1.1.2 Nhiệt ẩm:

- Phương pháp Pasteur: chỉ diệt VK gây bệnh, không diệt bào tử và VK hoại sinh Nhiệt độ 70-750C trong 10-15 phút

- Phương pháp Tyndall (chưng cách thủy nhiều lần): ở nhiệt độ 70-800C trong 1 giờ mỗi ngày, tiến hành trong 3 ngày liên tiếp.

- Nước sôi: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật làmcho protein đông kết, dẫn đến giết chết VSV Chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn Nhiệt độ 1000C, 5 phút

- Dùng Autoclave (hơi nước bão hòa ở áp suất cao):

1.2 Diệt trùng bằng cách lọc

Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… có kích thước

lỗ lọc từ 0,2-0,45 µm, thường dùng để lọc những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được

Máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ VK để khử trùng không khí

1.3 Diệt trùng bằng bức xạ

- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu

- Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm được góikính

2 Phương pháp hóa học:

2.1 Sát trùng ngoài da: cồn, xà phòng, iode, phẩm màu (như xanh methylene).2.2 Diệt khuẩn, tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor…

III CÁC BIỆN PHÁP AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm

- Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng

- Rửa tay kỹ với xà phòng (hoặc cồn) trước và sau khi thực hiện thao tác cấy

- Cẩn thận bảo vệ mắt và vùng da bị trầy xước để tránh nhiễm khuẩn

1210C/20 phút: môi trường đã có VK

105-1150C /15-20 phút: môi trường dinh dưỡng

- Sử dụng các mẫu xét nghiệm, gốc VK một cách cẩn thận tránh ngoại nhiễm.

- Sau khi dùng phải khử khuẩn tất cả dụng cụ

- Không hút thuốc lá hay ăn uống trong phòng thí nghiệm

- Đối với phòng vô trùng hay tủ cấy vô trùng có trang bị đèn cực tím (tia UV):

mở đèn 2 giờ trước khi làm việc và phải ra khỏi phòng tránh bị ảnh hưởng làm hỏng mắt và da

Lưu ý: Cần đọc bài trước để hiểu nội dung và công việc sẽ làm Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên, khi gặp vướng mắc, không rõ cẩn hỏi lại giảng viên hướng dẫn

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH

BÀI 2:

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG

I PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG

1 Dựa vào công dụng

- Môi trường căn bản: là môi trường dùng để nuôi cấy hầu hết các loại VSV hoạisinh

- Môi trường tiềm tăng sinh: là môi trường tăng sinh không chọn lọc

- Môi trường tăng sinh: là môi trường tăng sinh chọn lọc

- Môi trường phân lập: là môi trường chọn lọc dạng đặc

- Môi trường phân biệt: là môi trường phân lập được bổ sung một chất chỉ thị nàođó

- Môi trường thử phản ứng sinh hóa: là môi trường chẩn đoán phản ứng phân biệtdùng để xác định một vài tính chất sinh hóa ở các dòng VK đã được phân lập

- Môi trường đặc: cấy phân lập, cấy truyền, đếm tế bào VSV

- Môi trường bán lỏng: nghiên cứu sự di động của VSV → định danh VSV

PHÂN LẬP GIỐNG THẦN KHIẾT

I MỤC ĐÍCH

Giống thuần khiết là giống VSV được tạo ra từ một tế bào ban đầu

Mục đích:

Tách rời khuẩn lạc để tạo giống VSV thuần khiết

Bảo tồn VSV nuôi thuần khiết

Để nghiên cứu hình thái, tính chất vật lý, sinh hóa của VSV

II CÁCH TIẾN HÀNH

Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể VSV ban đầu

Phân lập VSV thuần khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc

Các phương pháp:

1 Pha loãng

2 Cấy ria (thông dụng nhất)

3 Pha loãng rồi dàn đều lên môi trường đặc

4 Phân lập trong bình chân không

Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độn thích hợp, tùy thuộc vào đặc điểm của nhóm VSV cần phân lập, sau 24-48h thu được những khuẩn lạc riêng rẽ cho từng dòng VSV

Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.

Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết: kiểm tra với cấy trên môi trường thạch đĩa, kiểmtra độ thuần các khuẩn lạc, kiểm tra đặc điểm các khuẩn lạc so với khuẩn lạc chủng mẫu, kiểm tra hình dạng VSV bằng phương pháp làm tiêu bản nhuộm soi dưới kính hiển vi, tiến hành thực hiện một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng

Phương pháp lưu trữ: bảo quản trên môi trường thạch nghiên, phương pháp lạnh sâu, phương pháp đông khô

III KẾT QUẢ

PHƯƠNG PHÁP CẤY VI KHUẨN

I MỤC ĐÍCH

Cấy là sự truyền VK từ môi trường trong đó chúng đang sống sang môi trường mới để chúng có thể tiếp tục phát triển trong những điều kiện thuận lợi nhất

Mục đích:

Bảo tồn VK nuôi thuần khiết

Ly trích VK có trong nước, mẫu đất, mẫu thực phẩm, mẫu bệnh lý

II CÁCH TIẾN HÀNH

Các bước cấy truyền:

Lau bàn và rửa tay, khử trùng bằng alcol

Ngồi đối diện ngọn đèn cấy

Giá ống nghiệm để bên trái Tất cả các dụng cụ còn lại ở bên phải

Chuẩn bị ống môi trường để cấy: ghi tên VK cần cấy và ngày cấy

Tay phải cầm que cấy như cầm bút viết và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy

Tay trái cầm ống nghiệm có VK xuôi theo lòng bàn tay Tay phải nắm nút bông giữa ngón út và cạnh bàn tay, tay trái xoay nghẹ ống nghiệm, kéo nút bông ra

Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng ống nghiệm

Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với VK trong ống giống Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi dậy nút bông lại

Lấy ống môi trường mới, mở nút bông như trên và khử trùng miệng ống nghiệm Thựchiện sự cấy VK

Khi cấy xong, hơ nóng lại đầu ống nghiệm rồi đậy nút bông lại và đặt lên giá ống nghiệm

Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

Nếu ống giống là môi trường lỏng có VK thì dùng pipet hút môi trường thay que cấy

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH

BÀI 6:

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

I MỤC ĐÍCH

 Quan sát được hình dạng và kích thước của tế bào vi sinh vật

 Nhằm phân biệt các loài VK thành hai nhóm Gram (-) và Gram (+) dựa trên cácđặc tính hóa lý của thành tế bào

II CÁCH TIẾN HÀNH

Bước 1, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một ít VK từ ống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hòa vào một giọt nước muối sinh lý hoặc nước vô trùng ở giữa phiến kính, để khô trong không khí

- Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, để giết chết

VK, gắn chặt VK vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn (do VK chết bắt màu tốt hơn VK còn sống)

Bước 2, nhuộm màu:

Thứ nhất, nhuộm tiêu bản bằng Crystal violet trong 1 phút, rửa nước

Thứ hai, nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước

Thứ ba, khử màu: Tẩy bằng cồn trong 30s (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước.Thứ tư, nhuộm tiếp bằng Fucshin trong 1 phút, rửa nước

Bước 3, quan sát kết quả:

Thấm khô và quan sát ở vật kính 100 trong giọt dầu

III KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH

Bắt màu hồng: Gram (-)

a) E coli: trực khuẩn, màu hồng, Gram (-)

b) Bacillus: trực khuẩn, màu tím, G (+)

c) Staphylococcus: trực khuẩn, màu tím (G+)

d) Streptococus: cầu khuẩn, màu hồng (-)

e) Aeromonas hydrophila: trực khuẩn, màu hồng, G(-)

f) Nấm men: cầu khuẩn (thành cụm), nhuộm đơn

trong vách tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể iode bên trong tế bào.

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG

Phân loại và định danh VK

Khảo sát tính chất sinh lý của VK

II CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

1 Phản ứng SIMMON CITRATE (SC)

Dùng để thử phản ứng phân giải Citrate

Giải thích: Một số VK có khả năng sử dụng citrate như nguồn Carbon duy nhất trong môi trường tổng hợp vô cơ Khi Citrate bị biến dưỡng đến giai đoạn cuối cùng là CO2

có một sự mất thăng bằng về ion (sự phóng thích NH3) và làm môi trường bị kiềm hóa, chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương đậm

Môi trường: môi trường thạch Simmons citrat (dạng đông khô) được điều chế theo thể thạch nghiêng Thành phần môi trường chứa chỉ thị màu xanh bromtymol

Kết quả: (Sau khi ủ 37℃ trong 48h)

- Kết quả dương(+): VK mọc trên mặt thạch nghiêng với sự đổi sang màu xanh dương hàn toàn, chút ít hay không

- Kết quả âm(-): VK không mọc trên thạch và không đổi màu môi trường

2 Phản ứng KIA

Môi trường KIA (Kligler’s iron agar) dùng để quan sát sự lên men đường glucose, lactose và khả năng sinh khí H2S, khí H2 và CO2 của VK Trong môi trường có chỉ thị màu phenol red dùng để phát hiện khả năng lên men đường của VK Đây là môi

trường đặc, được chuẩn bị trong ống nghiệm ở thể thiêng sâu

Có khả năng sinh khí, nứt thạch

3 Phản ứng indol

Gỉa thích: Một số VK có khả năng thủy giải trytophan trong môi trường thành indol Nhân pyrol sẽ kết hợp với p-dimetylamino benzaldehyt trong thuốc thử Kovacs tạo thành một phức chất dạng quinon màu đỏ tía trên mặt thoáng của môi trường

Kết quả: sau khi ủ 37℃ trong 48h, nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovacs vào

- Phản ứng Indol dương (+): một vòng màu đỏ sẫm xuất hiện trên bề mặt môi trường

- Phản ứng Indol âm (-): bề mặt môi trường giữ nguyên màu vàng của thuốc thửIII Kết quả

1 AE trong môi trường Simmon citrate (SC)

Môi trường SC xanh lá → xanh dương ở giữa

→ Phản ứng SC (+)

2 AE trong môi trường Simmon citrate (SC)

Môi trường từ xanh lá → xanh dương, hơn 2/3 ống nghiệm

3 AE trong môi trường KIA

Trên màu đỏ, dưới màu vàng cam

Đẩy đáy, nứt thạch

Váng tạo đục

→ Sinh hơi (+); Sinh H2S (-); Glu (+); Lac (-)

4 Stephylococcus trong môi trường KIA: làm nứt thạch, tạo sợi trắng

→ Glu (-), Lac (-), sinh hơi (+), sinh H2S (-)

6 Phản ứng indol

- Streptococcus: mặt thoáng màu vàng → Indol (-)

CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

I Mục đích:

Sử dụng kính hiển vi để quan sát và đếm tế bào VSV: nấm mốc, nấm men, VK

II Cấu tạo:

Cấu tạo kính hiển viIII Cách sử dụng

- Cắm điện, bật công tắc, nhìn vào thị kính, điều chỉnh nguồn sáng để ảnh sáng đều thị trường

- Bao giờ cũng xem mẫu vật ở vật kính nhỏ trước 10×

- Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp vào thước kẹp tiêu bản, điều chỉnh mẫu vật vào đúng tâm nguồn sáng

- Nhìn dưới kính mang vật (lame), vặn nhẹ ốc sơ cấp xuống đến khi đầu vật kính

- Khi sử dụng vật kính có độ phóng đại lớn 100×: Đầu tiên ta cũng dùng vật kính

có độ phóng đại nhỏ để xác định vi trí cần tìm trên tiêu bản Sau đó nhỏ giọt dầu cèdre lên tiêu bản, đổi sang vật kính có độ phóng đại lớn là 100× Điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng để nhìn thấy ảnh của mẫu vật khi vật kính vẫn chìm trong giọt dầu

Vai trò của dầu cèdre khi sử dụng vật kính 100×

Khi sử dụng vật kính 100× phải nhỏ một giọt dầu cèdre lên mẫu vật vì dầu cèdre có tác dụng tập trung ánh sáng vào vật kính giúp cho nó quan sát ảnh rõ hơn (vì dầu cèdretạo được môi trường đồng chiết suất với thủy tinh n = 1,5)

Một số lưu ý:

- Khi thấu kính bẩn lau nhẹ bằng vải bông mềm, sạch, tránh làm xước thấu kính

- Khi quan sát, cần thường xuyên nhấp nháy ốc vi cấp để thấy đầy đủ các mặt phẳng khác nhau

- Vì ảnh thấy trong kính hiển vi luôn ngược chiều vật quan sát Để cho hình ảnh thuận chiều muốn xem, dễ quan sát thì khi đặt tiêu bản phải để ngược chiều

- Nên mở cả hai mắt để quan sát

- Ở độ phóng đại lớn cần nhiều ánh sáng hơn

- Không tự ý mở tháo kính, bật tắt làm cháy đèn Dùng sau phải lau kính sạch sẽ, tắt điện và trả lại vị trí cụ Quá trình di chuyển cầm chắc chắn khung tay cầm, tránh va chạm

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ LƯỢNG VI

SINH VẬT

I MỤC ĐÍCH

Nhằm xác định số lượng VSV trong một thể tích hay một trọng lượng mẫu nhất định

II CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐẾM THƯỜNG DÙNG

Có 3 phương pháp thường dùng:

- Đếm trực tiếp bằng phòng đếm hồng cầu (đếm tế bào nấm men)

- Đếm gián tiếp số lượng VSV bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc

- Phương pháp pha loãng tới hạn

Cả 3 phương pháp trên đầu trải qua 2 giai đoạn:

1 Thu mẫu

Lấy mẫu có tính chất đại diện

Mẫu lấy xong phải phân tích ngay trong ngày

Tất cả dụng cụ chứa mẫu phải được khử trùng

2 Pha loãng mẫu

Bước 1: cắt 1g mẫu bệnh, giã mẫu cho nát rồi cho vào 99ml muối sinh lý hay nước cất

vô trùng khuấy đều

Bước 2: chuẩn bị một số ống chứa 9ml nước muối sinh lý hoặc nước cất vô trùngBước 3: lấy 1ml dung dịch mẫu gốc cho vào một trong các ống nghiệm đã chuẩn bị, ta được dung dịch có hệ số pha loãng 10-1

Bước 4: lấy 1ml dung dịch mẫu gốc có hệ số pha loãng 10-1, cho vào 1 ống nghiệm khác , ta được dung dịch có hệ số 10-2, tiếp thục làm vậy để thu được dung dịch có hệ

Sử dụng xong phải rửa và lau khô buồng đếm.

Để đạt độ chính xác cao, số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ : 2 ≤ a ≤ 10

Để quan sát và đếm được số lượng tế bào VSV, ta có thể dùng thêm phẩm màu

IV Kết quả

Mục đích: Ngăn ngừa các chất từ môi trường nuôi cấy vào trong miệng và tránh nhiễm tạp.