Thực hành di truyền đại cương cô Trà Mi (có đáp án)

Bài 1: TÁCH CHIẾT ADN Phần 1: Thao tác với micropipette Micropipette là thiết bị dùng để thao tác thể tích ở cấp độ micro lit µl.. Trong bài thực hành này, các bạn sẽ tập làm quen với c

LABORATORY & TUTORIAL MANUAL

ANIM 2503

ANIMAL BREEDING AND MOLECULAR GENETIC

MSc BUI THI TRA MI

MỤC LỤC

Bài 1 Tách chiết ADN 1

Phần I Thao tác với Micropipette 1

Phần II Tách chiết ADN từ máu heo 4

Bài 2 Polymerase Chain Reaction (PCR) 7

Phần I Pha loãng nồng độ ADN 7

Phần II Chạy phản ứng PCR 7

Bài 3 Điện di kết quả 10

Phần I Điện di 10

Phần II Phân tích kết quả 11

Bài tập tổng hợp

Bài 1: TÁCH CHIẾT ADN

Phần 1: Thao tác với micropipette

Micropipette là thiết bị dùng để thao tác thể tích ở cấp độ micro lit (µl) Trong bài thực

hành này, các bạn sẽ tập làm quen với cách sử dụng micropipette: cách cầm, điều chỉnh

thể tích, hút và nhả dung dịch sao cho chính xác

A Cách sử dụng:

Mỗi 1 micropipette có thể tích đo lường khác nhau Biên độ đo thể tích này được ghi rõ

trên pipette Khi điều chỉnh hút dung dịch phải chú ý chọn pipette phù hợp và điều chỉnh

thể tích nằm trong biên độ cho phép Tuyệt đối không được điều chỉnh thể tích vượt

ngoài biên độ

a Cái móc: cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách lỏng lẻo trên sống bàn tay khi

không sử dụng, như vậy sẽ làm cơ tay ít bị quá sức

b Cầm chặt bằng cả bàn tay Tránh cầm pipet quá chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai

sau khi sử dụng pipet lâu

c Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt thời gian để có thể kiểm soát thể

tích lấy ngay cả khi đang sử dụng

d Nút nhấn lớn: nhấn để đẩy đầu tip ra khỏi pipette

e Vặn điều chỉnh thể tích; nhấn/thả để hút/đẩy dung dịch

e

B Cách lấy mẫu

Mỗi micropipette có biên độ đo thể tích khác nhau sẽ sử dụng đầu tip khác nhau

- Chọn đúng loại đầu tip cho pipette tương ứng Ấn pipette vào đầu tip kết hợp

xoay nhẹ Nếu không xoay có thể có khe hở giữa đầu tip và pipette dẫn đến thể

tích hút thực bị sai và pipette bị nhỏ giọt

Cầm pipet

ở tư thế

thắng đứng

Ấn tới nấc dừng thứ nhất Nhúng đầu pipet tip khoảng 3 – 4

mm vào dung dịch

Thả pittông

ra từ từ

Để cho mẫu,

ấn tới nấc dừng thứ nhất

Chuyển tất cả phần còn lại của chất lỏng ở đầu pipet tip

ra, ấn tới nấc dừng thứ hai (để phụt hết dung dịch ra

Dung tích đo lường của từng loại đầu tip:

Tip trắng: 0 – 10 µl Tip vàng: 10 – 200 µl Tip xanh: 100 – 1000 µl

khỏi pipet tip)

Dưới đây là 1 số kích thước pipette thường sử dụng

Pipette Biên độ đo

lường (µl)

Lưu ý

P10 0.0 – 10.0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 0 hoặc trên 10

P20 2,0 – 20,0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 2 hoặc trên 20

P40 5,0 – 40,0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 5 hoặc trên 40

P100 10 - 100 Không được điều chỉnh thể tích dưới 10 hoặc trên

100 P200 20 - 200 Không được điều chỉnh thể tích dưới 20 hoặc trên

200 P1000 100 - 1000 Không được điều chỉnh thể tích dưới 100 hoặc trên

1000

a Dựa vào pipette thực tế của nhóm, hãy chọn pipette và đầu tip cho phù hợp để đo

lường các thể tích sau đây:

Thể tích Loại pipette Biên độ đo lường (µl) Màu sắc tip tương ứng

154.6 µl P200 (150) + P10 (4.6) 40 - 200; 0.5 - 10 Vàng; Trắng

36,2 µl P20 (18 + 18.2) 2 - 20 Vàng

C Thực hành thao tác với micropipette:

Mỗi 4 sinh viên sẽ được cung cấp 1 bộ dụng cụ gồm 3 pipette kích cỡ khác nhau, 3 đĩa

petrie có lót sẵn giấy thấm kích thước khác nhau, màu nhuộm

2 sinh viên/ nhóm: làm chung mẫu

Mỗi nhóm hãy hút dung dịch và nhỏ vào 1 bên của đĩa petrie theo các kích thước cho

bên dưới và quan sát dung dịch trong cùng đĩa petrie của nhóm đối diện

A: 250µl B: 90 µl C: 5µl

b Quan sát và ghi nhận vòng thấm lan trên giấy của 2 nhóm?

Kết quả ở 2 nhóm như nhau:

A: Vòng thấm lan thành hình elip chiếm gần 3/4 tờ giấy

B: Vòng thấm lan thành hình elip chiếm khoảng 1/4 tờ giấy

C: Vòng thấm hình tròn có đường kính khoảng 1 cm

Phần 2 Tách chiết ADN từ máu heo

A Tách lọc bạch cầu

Thông thường khi lấy mẫu về, trước khi tách chiết ADN, thường có các bước đầu thao

tác nhằm loại bỏ các thành phần tạp chất hay thành phần không có chứa ADN, nhằm

góp phần giúp thu được ADN tinh sạch sau khi hoàn tất quy trình tách chiết

Trong phần thực hành này, sinh viên sẽ thao tác tách chiết các thành phần không có

chứa ADN trong máu động vật hữu nhũ (heo)

Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)

2 SV làm chung 1 mẫu

Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác

Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, Ống nghiệm chứa 15ml chứa mẫu, micropippete các loại,

đầu tip các loại, lọ chứa dung dịch bỏ

Hóa chất: dung dịch NaCl 0,2%

Thao tác:

1 Hút 5ml NaCl 0,2% vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml máu heo, trộn đều, ly tâm

với vận tốc 3000 vòng/phút trong 3 phút

2 Hút bỏ phần nổi Tiếp tục cho vào 5ml NaCl 0.2%, trộn đều, ly tâm 3000

vòng/phút trong 3 phút

3 Lập lại thao tác 1 và 2 bốn lần

a Thành phần của máu bao gồm những gì?

- Các tế bào máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu

- Huyết tương

b Với mẫu là máu heo, ADN nằm ở đâu trong các thành phần kể trên?

Bạch cầu

B Tách chiết ADN

Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)

2 SV làm chung 1 mẫu

Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác

Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, ống nghiệm chứa mẫu, micropippete các loại, đầu tip các

loại, lọ chứa dung dịch bỏ

Hóa chất: Lysis Buffer, Proteinase K, Phenol, CIAA (Chloroform/Isoamyl Alcohol), Ethanol

95%, Ethanol 70%, TE 1X

Thao tác:

1 Cho 3ml Lysis Buffer + 30 µl Proteinase K vào ống mẫu ở trên, trộn đều, ủ 550C

qua đêm ( tối thiểu 8 tiếng)

c Proteinase K (PK) là gì? Tác dụng của PK?

Proteinase K (PK) là một serine protease phổ rộng Enzyme này có tác dụng phân

cắt protein, làm vỡ màng tế bào giải phóng ADN ra môi trường

2 Cho vào 3ml Phenol, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

d Ở bước này xuất hiện hiện tượng kết tủa? Kết tủa này là gì? Tại sao xuất hiện kết

tủa?

Kết tủa đó là protein biến tính và bạch cầu còn lại

Phenol không tan trong nước nhưng nhờ trộn đều sẽ tạo thành nhũ tương giọt

dầu trong nước Protein sẽ bị biến tính bởi phenol trong khi ADN vẫn còn nguyên

trong nước Khi ly tâm, hai lớp phenol và nước tách nhau ra, phenol nặng nên lắng

xuống dưới, protein biến tính và bạch cầu còn sót sẽ nằm tại ranh giới của phenol

và nước

3 Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml Phenol/CIAA,

trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

e ADN sẽ nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?

ADN tan trong nước và nằm ở trên Phần loại bỏ gồm protein biến tính còn sót và

các thành phần trong Lysis Buffer bị hòa tan trong CIAA

4 Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml CIAA

(Chloroform/Isoamyl Alcohol), trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

f ADN lúc này nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?

ADN tan trong nước và nằm ở lớp trên Phần loại bỏ là Lysis Buffer bị hòa tan

trong CIAA

5 Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 5ml Ethanol 95% lạnh

g Hiện tượng kết tủa sẽ xuất hiện Chất kết tủa đó là gì?

ADN

6 Ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút Hút cạn phần dung dịch bỏ đi Lưu ý đừng

loại bỏ ADN

7 Cho vào 3ml Ethanol 70% Trộn đều Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút

h Tác dụng của EtOH 70% trong bước này là gì?

Cho EtOH 70% vào để loại bỏ muối NaCl còn lại

8 Hút cạn phần dung dịch bỏ đi Làm ráo mẫu

9 Cho vào 200 µl TE 1X Ủ 370C qua đêm

i Tác dụng của dung dịch TE 1X?

Tách sợi ADN trong môi trường

Bảo quản mẫu

10 Chuyển dung dịch ADN vào eppendorf 1.5ml

11 Trữ mẫu ở 40C

Bài 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Phần I Pha loãng nồng độ ADN

Tùy theo lượng mẫu và thao tác, nồng độ ADN thu được sẽ không giống nhau sau khi

tách chiết (thường nồng độ này rất đậm đặc) Và trong mỗi một phản ứng PCR, lượng

ADN mẫu đưa vào cũng sẽ có sự khác biệt Vì vậy chúng ta cần phải pha loãng ADN theo

một nồng độ phù hợp trước khi thực hiện PCR nhằm đơn giản thao tác và phản ứng sẽ

xảy ra chính xác hơn

Chuẩn bị: ống eppendorf, micropipette, nước cất hoặc TE 1X

Thao tác:

1 Ghi nhận kết quả đo nồng độ mẫu ADN của nhóm vào cột C (Giáo viên sẽ cung

cấp số liệu cho bạn)

2 Hãy tính toán lượng ADN và lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có được

tổng thể tích mẫu là 200µl với nồng độ 100ng ADN/µl theo công thức sau:

Nồng độ ban đầu x thể tích mẫu gốc = nồng độ cần pha loãng x thể tích mẫu cần

pha

Hay ta có D = (A x B)/C

Lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có tổng thể tích 200µl với nồng độ 10ng

ADN/µl? E = B – D

Hiệu

chỉnh

Nồng độ cần pha loãng

Thể tích mẫu cần pha

Nồng độ gốc ban đầu

Thể tích mẫu gốc cần thêm vào

Thể tích nước/TE 1X cần thêm vào 100ng/ µl

10ng/ µl

200 µl

3 Trộn đều lượng nước tính được từ cột E với lượng ADN từ cột D vào ống

eppendorf

Phần II Chạy phản ứng PCR

Để phản ứng PCR xảy ra tốt hoặc có thể dễ dàng dự đoán điều chỉnh thành phần

để kết quả thu được rõ ràng hơn, chúng ta cần phải tính toán và trộn lượng hỗn hợp

tổng cho chính xác Hỗn hợp tổng được chuẩn bị sẽ bao gồm luôn cả mẫu đối chứng

(N)

1 Chuẩn bị 1 ống eppendorf 1,5ml để trộn hỗn hợp tổng Ghi số nhóm thực hiện

lên trên nắp ống

2 Tính toán các thành phần để chạy 4 phản ứng + 1 phản ứng đối chứng (N)

a Tính toán thể tích từng thành phần cho 1 phản ứng Điền kết quả vào cột C

Sử dụng các công thức sau để tính thể tích từng thành phần :

- Công thức tam suất

- C = B x V∑/A

- H2O = V∑ - Các thành phần đã biết

-

b Tính toán và điền kết quả từng thành phần tổng vào cột D

Thành phần A (Nồng độ gốc) B (Nồng độ

phản ứng)

C (Thể tích cho

1 phản ứng)

D (Thể tích cho

4 phản ứng +1)

Mồi xuôi F 10pmol/µl 30pmol 3µl 15µl

Mồi ngược R 10pmol/µl 30pmol 3µl 15µl

Enzyme (Taq DNA 5UI/ µl 1UI 0,2µl 1µl

*: đưa vào hỗn hợp cuối cùng; **: số liệu có thể thay đổi tùy theo nhóm thực hành

3 Hút các thành phần đã tính vào ống eppendorf 1,5ml Trộn nhẹ nhàng cho

đều

4 Chuẩn bị 5 ống eppendorf 200 µl Đánh số từ 1->4 và 1 eppendorf ghi chữ N

5 Dùng micropipette hút …15… µl hỗn hợp vào từng eppendorf 200 µl

6 Thêm …5…… µl ADN vào mỗi eppendorf Không cho ADN vào ống N

7 Phản ứng PCR sẽ được chạy theo quy trình sau:

Bước 1: tiền biến tính 940C, 10phút

Bước 2: Biến tính 940C, 30 giây

Bước 3: Ủ bắt cặp 550C, 45 giây Lặp lại 35 lần

Bước 4: Kéo dài 720C, 45 giây

Bước 5: Bù thêm 720C, 5phút

Bước 6: Giữ mẫu 40C

a Tổng thời gian chạy phản ứng PCR ở trên kéo dài ít nhất bao lâu?

1 tiếng 25 phút

b Tại sao cần phải có mẫu đối chứng N? Mẫu đối chứng này có thành phần

gì khác so với các mẫu thí xét nghiệm?

Ở đây mẫu đối chứng N là chứng âm (Negative control): Phân biệt có ngoại

nhiễm hay không

Đối chứng N này không cho ADN mà thay bằng nước cất

Ngoài ra còn có chứng dương (Positive control): Đảm bảo phản ứng tốt Có một

lượng ADN đã biết trong phản ứng

Tóm lại, phản ứng cần có cả chứng âm và chứng dương để loại trừ hiện tượng

âm tính giả hay dương tính giả

Bài 3: ĐIỆN DI KẾT QUẢ

Phần I Điện di

A Pha agarose nồng độ 1%

1 Cân 1g agarose + 100ml dd TAE 1X

Nếu muốn pha 100ml dd agarose có nồng độ 1,5%, cần bao nhiêu gram agarose?

1,5g

2 Microwave cho agarose tan đều, sôi khoảng 3 lần

3 Đợi dd agarose nguội, khoảng 500C, thêm 6 µl ETBr vào Chú ý lắc nhẹ bình

chứa agarose trên đá bào theo cùng chiều kim đồng hồ rồi lắc ngược lại để ETBr tan đều

trong gel và tránh bọt khí

a ETBr là gì? Tác dụng của ETBr?

ETBr (Ethidium bromide) là chất nhuộm sử dụng để phát hiện ADN/ARN trong điện

di trên gel agarose ETBr được kích thích bởi đèn UV và phát ra ánh sáng huỳnh

quang màu cam đỏ, quan sát được bằng mắt thường ETBr có thể phát hiện được

1 ng ADN trên 1 băng (Lưu ý: ETBr có khả năng gây đột biến mạnh)

b Tại sao phải tránh tạo bọt khí trong quá trình đổ gel?

Nếu để bọt khí xảy ra mà không làm nó vỡ trước khi gel đông cứng nó sẽ tạo

những biến dạng làm ảnh hưởng đến đường chạy của mẫu không còn thẳng đều –

tránh bọt, dẫn đến việc đo đạc, ước lượng kích thước của các phân tử ADN không

chính xác

4 Đổ gel vào khuôn đã gắn lược, chờ gel đông đặc

B Load mẫu:

1 Hút 5 µl Ladder 100 (ABM) cho vào giếng giữa

c Ladder là gì? Tác dụng của ladder? Ý nghĩa của con số 100?

Ladder (Marker), đây là tập hợp những đoạn ADN có kích thước xác định và biết

trước dùng làm thang chuẩn để ước lượng kích thước của phân tử ADN chưa rõ

khi tiến hành điện di

Ladder 100, con số 100 cho biết Ladder được thiết kế để đo kích thước của phân tử

ADN trong phạm vi là 100bp-1000bp (số 1000 tùy vào Ladder thiết kế), và độ chia

nhỏ nhất của dải tham chiếu là 100bp, tức 2 vạch chênh nhau 100bp

d Theo hình, Ladder 100 là giếng:………1 và 10………

e Xem hình bên dưới và hãy điền kích thước tương ứng với các band của ladder

2 Hút 5 µl mỗi mẫu cho vào các giếng khác nhau

- Điện di ở 100 V trong 30 phút

Phần II Phân tích kết quả

Mỗi nhóm sẽ được nhận 1 kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định vật nuôi có

nhiễm 1 trong 2 bệnh sau: PRRS và PED

f PRRS là viết tắt của:……… Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome…………

PRRS là bệnh: ……tai xanh………

Có tên gọi khác là……Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ………

xảy ra trên………heo (lợn)……… do virus……PRRS (PRRSV) ………

……… ……gây ra

g PED là viết tắt của………Porcine Epidemic Diarrhoea ………

PED là bệnh: ………tiêu chảy cấp……… xảy ra trên……heo (lợn) …

……… do virus………PED (PEDv) ………

……… gây ra

Để xác định bệnh, phản ứng PRC sẽ được thực hiện với 1 trong 2 cặp primer sau:

h F là viết tắt của……forward ………

R là viết tắt của…………reverse………

i Hãy tìm và gạch dưới trình tự Nucleotid quy định mồi xuôi và mồi ngược trong

đoạn gien được giải mã dưới dây:

(Lưu ý: Khi xác định trình tự mồi ngược, trước tiên các nhóm phải viết lại trình tự

Nucleotid bắt cặp theo chiều 3’.)

LOCUS AY612613

14281 GCAAAGTTGA GGTCGAAGGT CATCTGATCG ACCTCAAAAG AGTTGTGCTT GATGGTTCCG

14341 TGGCAACCCC TATAACCAGA GTTTCAGCGG AACAATGGGG TCGTCCTTAG ATGACTTCTG

14401 TCATGATAGC ACGGCTCCAC AAAAGGTGCT TTTGGCGTTT TCTATTACCT ACACGCCAGT

phát hiện

Vùng gen khuếch đại

Kích thước sản phẩm

ORF6-F GTGGCAACCCCTATAACCAGAG

PRRSV ORF6 780 bp ORF6-R ACGACAGACACAATTGCCGCTCAC

E pro-F CGCAGTTTACACACCTATAGGG

Coronavirus E&M 412 bp

M pro-R CCTGCGCCACAACCGAATGCTATT

14461 GATGATATAT GCCCTAAAGG TGAGTCGCGG CCGACTGCTA GGGCTTCTGC ACCTTTTGAT

14521 CTTCCTGAAT TGTGCTTTCA CCTTCGGGTA CATGACTTTC GCGCACTTTC AGAGTACAAA

14581 TAAGGTCGCG CTCACTATGG GAGCAGTAGT TGCACTCCTT TGGGGGGTGT ACTCAGCCAT

14641 AGAAACCTGG AAATTCATCA CCTCCAGATG CCGTTTGTGC TTGCTAGGCC GCAAGTACAT

14701 TCTGGCCCCT GCCCACCACG TTGAAAGTGC CGCAGGCTTT CATCCGATTG CGGCAAATGA

14761 TAACCACGCA TTTGTCGTCC GGCGTCCCGG CTCCACTACG GTCAACGGCA CATTGGTGCC

14821 CGGGTTAAAA AGCCTCGTGT TGGGTGGCAG AAAAGCTGTT AAACAGGGAG TGGTAAACCT

14881 TGTCAAATAT GCCAAATAAC AACGGCAAGC AGCAGAAGAG AAAGAAGGGG GATGGCCAGC

14941 CAGTCAATCA GCTGTGCCAG ATGCTGGGTA AGATCATCGC TCAGCAAAAC CAGTCCAGAG

15001 GCAAGGGACC GGGAAAGAAA AATAAGAAGA AAAACCCGGA GAAGCCCCAT TTTCCTCTAG

15061 CGACTGAAGA TGATGTCAGA CATCACTTTA CCCCTAGTGA GCGGCAATTG TGTCTGTCGT

15121 CAATCCAGAC CGCCTTTAAT

//

LOCUS JQ282909

25561 GCTTCACTTG TCACCGGTTG TGTAATAGCG CAGTTTACAC ACCTATAGGG CGTTTGTATA

25621 GAGTTTATAA GTCTTACATG CAAATAGACC CCCTCCCTAG TACTGTTATT GACGTATAAA

25681 CGAAATATGT CTAACGGTTC TATTCCCGTT GATGAGGTGA TTCAACACCT TAGAAACTGG

25741 AATTTCACAT GGAATATCAT ACTGACGATA CTACTTGTAG TGCTTCAGTA TGGCCATTAC

25801 AAGTACTCTG CGTTCTTGTA TGGTGTCAAG ATGGCTATTC TATGGATACT TTGGCCTCTT

25861 GTGTTAGCAC TGTCACTTTT TGATGCATGG GCTAGCTTTC AGGTCAATTG GGTCTTTTTT

25921 GCTTTCAGCA TCCTTATGGC TTGCATCACT CTTATGCTGT GGATAATGTA CTTTGTCAAT

25981 AGCATTCGGT TGTGGCGCAG GACACATTCT TGGTGGTCTT

//

j Sau khi khuếch đại đoạn gien bằng cặp mồi đã cho ở trên, kích thước sản phẩm