PHÚC TRÌNH THỰC TẬP HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Nghiên cứu phương pháp chiết xuất tinh dầu vỏ Khảo sát số vật lý, hóa học tinh dầu Tinh dầu vỏ cam, bưởi có thành phần limonene cao Limonene có khả gây ngán ăn sâu trùng, cịn có dược tính Limonene quan tâm nghiên cứu hoạt tính sinh học có khả gây độc tố lên tế bào ung thư II PHƯƠNG PHÁP: Thực hiên tách chiết tinh dầu học Chiết xuất tinh dầu chưng cất lôi nước trực tiếp Ôn phương pháp chiết Lỏng – Lỏng, làm khan hỗn hợp chất hữu III THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT: Thiết bị Bộ chưng cất cleavenger tách tinh dầu nhẹ Máy ly tâm Máy đo chiết xuất Tỷ khối kế Dung cụ thủy tinh Cân Nguyên liệu, hóa chất Diethyl eter Vỏ cam, bưởi Aceton Na2SO4 khan Etanol công nghiệp Nước cất Giấy quỳ, giấy pH IV TIẾN HÀNH Cân 100g nguyên liệu, xắt nhỏ, xay Chưng cất lôi nước • Đong nước cất, cho nguyên liệu vào chưng cất (tỷ lệ 1:1) • Khởi động máy tăng nhiệt, theo dõi quy trình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MƠN HĨA  PHÚC TRÌNH THỰC TẬP HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Giảng viên hướng dẫn: Thầy Nguyễn Trọng Tuân Nhóm sinh viên thực hiện: Trần Thị Hồng Đào B1806501 Huỳnh Tiến Đạt B1806503 Huỳnh Tấn Phúc Hậu B1806510 Lê Minh Hiếu B1806511 Cần Thơ, 4/2020 Bài 1: TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA TINH DẦU CAM, BƯỞI I MỤC TIÊU: Nghiên cứu phương pháp chiết xuất tinh dầu vỏ Khảo sát số vật lý, hóa học tinh dầu Tinh dầu vỏ cam, bưởi có thành phần limonene cao Limonene có khả gây ngán ăn sâu trùng, cịn có dược tính Limonene quan tâm nghiên cứu hoạt tính sinh học có khả gây độc tố lên tế bào ung thư II PHƯƠNG PHÁP: Thực hiên tách chiết tinh dầu học Chiết xuất tinh dầu chưng cất lôi nước trực tiếp Ôn phương pháp chiết Lỏng – Lỏng, làm khan hỗn hợp chất hữu III THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT: Thiết bị Bộ chưng cất cleavenger tách tinh dầu nhẹ Máy ly tâm Máy đo chiết xuất Tỷ khối kế Dung cụ thủy tinh Cân Nguyên liệu, hóa chất Diethyl eter Vỏ cam, bưởi Aceton Na2SO4 khan Etanol công nghiệp Nước cất Giấy quỳ, giấy pH IV TIẾN HÀNH Cân 100g nguyên liệu, xắt nhỏ, xay Chưng cất lôi nước • Đong nước cất, cho nguyên liệu vào chưng cất (tỷ lệ 1:1) • Khởi động máy tăng nhiệt, theo dõi quy trình • Chú ý: ml nước chưng cất thu phải để riêng • Tắt nguồn nhiệt sau 2h Sau hoàn thành, chờ nguội 20 phút để tháo làm vệ sinh chưng cất • Tắt nguồn nhiệt sau kể từ lúc nước chưng cất sơi Sau hồn thành, chờ nguội 20 phút để tháo làm vệ sinh chưng cất, đồng thời tiến hành tách chiết tinh dầu • Sử dụng eter dầu hỏa lắc tách tinh dầu, lần lắc-lóng, lần 30 mL eter dầu hỏa • Thu gom tinh dầu, làm khan với Na2SO4 Cô quay đuổi eter dầu hỏa • Ghi kết quả, thực khảo sát lý, hóa học • Xác định tính acid - base (thử giấy quỳ) V THU HOẠCH: • Thu tinh dầu màu vàng nhạt • Cơng thức phân tử: C10H16 • Cơng thức cấu tạo: • Tên IUPAC: 1-Methyl-4-(prop-1-en-2-yl)cyclohex-1-ene VI TRẢ LỜI CÂU HỎI: Câu 1: • Chưng cất lôi nước dựa thẩm thấu, hịa tan, khuếch tán lơi theo nước hợp chất hữu tinh dầu chứa mô tiếp xúc với nước nhiệt độ cao • Do đó: Phương pháp chưng cất lôi nước tinh duầ vỏ cam bưởi, thực điều kiện ngun liệu cịn ngun, dạng mãng lớn khơng bị ảnh hưởng nhiều nhiệt dộ cao Câu 2: • Các trái thuộc họ Rutaceace cam, chanh, bưởi, quýt,… có túi tinh dầu nằm sát mặt ngồi vỏ với hàm lượng cao nên dùng lực để giải phóng tinh dầu Sau vắt lấy tinh dầu Tinh dầu thu trường hợp có mùi tự nhiên không bị ảnh hưởng nhiệt độ Tuy vậy, hiệu suất theo cách khơng cao • Do đó: phương pháp tách tinh dầu vỏ lực học ép vắt, thực điều kiện nguyên liệu tười, dạng cắt nhỏ, mỏng Câu 3: Nguyên tắc lóng tách chất lỏng từ hỗn hợp: • Chất lỏng cho vào phải có khả hịa tan (lơi cuốn) chất cần chiết (tinh dầu) mạnh chất lỏng có sẵn hỗn hợp • Hai chất lỏng phải khơng hòa tan vào → Dựa vào chênh lệch tỉ trọng chất lỏng hỗn hợp, ta tách riêng chúng ra, từ lấy chất cần thiết (tinh dầu) khỏi hỗn hợp Làm bay dung môi ta thu dược tinh dầu Câu 4: Các chất thường sử dụng làm khơ: • • • • CaCl2 khan (trừ rượu phenol, este, amin ) MgSO4 khan làm khô nước tốt, nhanh chất hữu Na2SO4 khan làm khô tốt cho amin, este P2O5 làm khô tốt nhanh theo yêu cầu độ khô cao BÀI TÁCH CHẤT BÉO TỪ DẦU THỰC VẬT (HOẶC MỠ ĐỘNG VẬT) I ĐẠI CƯƠNG A Chất béo toàn phần (lipid) gồm nhiều hợp chất, chia thành nhóm lớn như: 1) Các chất béo dầu mỡ, 2) Sáp, 3) Phospholipid - Các chất béo dầu mỡ: gồm có acid béo (dạng dầu sệt), hydroxyacid, acetylenic acid hỗn hợp glycerid Các acid béo có số chẵn carbon Các acid béo dạng dầu có chứa từ đến nối đôi phân tử Trong thiên nhiên đa số acid béo không no, kể acid không liên hợp quan trọng (như acid oleic, acid linoleic, acid linolenic) có cấu trúc dạng cis - - - - Các acid béo no thường có dạng mỡ, sệt Acid caproic – C6, acid caprylic – C8, acid capric – C20, acid behenic – C22 acid montanic C28 Khi thực xà phòng hóa chât béo, acid béo tham gia phản ứng nên bị biến đổi hóa tính, tạo muối Acid acetylenic nhóm hợp chất acid carboxylic dạng dầu ln có chứa liên kết ba phân tử, (có liên kết ba liên hợp, có liên kết ba liên hợp với liên kết đơi) ngồi thêm liên kết đơi Nhóm gồm dẫn xuất có oxygen tương ứng Ví dụ: acid tairic CH3(CH2)10CC(CH2)4COOH, hợp chất có công thức phân tử acid stearolic CH3(CH2)7CC(CH2)7COOH Acid ximenynic CH3(CH2)5CH=CHC-CC(CH2)7COOH, Glycerid xà phịng hóa tạo glycerol muối acid béo Có loại glycerid: loại đơn glycerid loại hỗn hợp glycerid, ví dụ: Oleodistearin glycerid hỗn hợp Các chất sáp: chủ yếu gồm có acid béo dây hở, ester acid béo alcol monohydric, thường chứa từ 24 đến 36 carbon Ví dụ chất sáp thiên nhiên như: sáp ong (ngồi acid panmitic có chứa acid cerotic alcol melicssylic); mỡ sáp từ lông cừu (lanolin), mỡ sáp dầu cá nhà táng – spermaceti (có chứa alcol cetylic, acid oleic aicd panmitic) Các sáp chịu xà phịng hóa dầu chất béo Các chất béo hợp chất hữu biến dƣỡng thứ cấp, sphyngomyelin phospholipid Phospholipid có chứa acid phosphoric base nitơ (như cholin etanolamin serin) polyhydroxyalcol Sphyngomyelin có mạch acid béo hóa hợp với polyhydroxyamin mạch hở tạo nối amid, cịn có liên kết glycosidic với hydrotcarbon B Sterol Ngoài ra, cần kể đến chất béo sterol, nằm danh mục lipid kể Sterol dạng chất béo thuộc nhóm chất hữu bậc hai, khơng bị xà phịng hóa, có cấu trúc hệ vịng ciclopentano perhydrophenantren, với nhóm OH vị tró C-3 vịng.Nhờ cấu trúc mà cách định tính định lượng sterol có phương pháp riêng Sterol nhóm hợp chất phong phú, có động vật có xương sống, khơng xương sống, nhiều loại thực vật nấm men Sinh tổng hợp sterol từ chuyển hóa acetat thành squalen, đồng thời có phối hợp đóng vịng demethyl hóa Sterol thể tự hóa hợp ester glycosidic C Tính chất, vai trị cách khảo sát chất béo - Chất béo tan dung môi phân cực, khơng tan nước.Có thể sử dụng dung mơi hữu eter dầu hỏa, hexan, chloroform để tách lấy chất béo từ nguyên liệu khô, sử dụng dung mối chiết lỏng – lỏng để tách lấy chất béo từ dung dịch chiết alcol nguyên liệu - Vai trò chất béo với thể động vật, thực vật quan trọng Đặc biệt vai trò sterol khác hẳn lipid, không ảnh hưởng trực tiếp lên chủ thể mà có ảnh hưởng đến sinh vật khác có liên hệ đến chủ thể II MỤC ĐÍCH YÊU CẦU Khảo sát sơ thành phần chất béo dầu đậu nành sắc ký lớp mỏng (TLC) III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Chiết chất béo từ đậu nành - Chuẩn bị: Hạt đậu nành khô (300g) xay nhuyễn cối xay, thành bột mịn, cho vào túi vải, để lơi thể tích túi cột chặt miệng túi - Dùng eter dầu hỏa ngâm bột đậu chiết lấy hợp chất béo, ngâm chiết lần, với thể tích dung môi giảm dần từ 200ml, 150ml 100ml Khi cho dung môi vào ngâm túi, dùng đũa khuấy động lên túi 10 phút để yên phút, vắt lấy dịch eter dầu hỏa (mang bao tay nhựa để thực hiện) Gom dịch chiết, lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung mơi Chú ý: quay đến cịn thể tích 150ml lấy bình ra, chia làm phần: o Phần 1: 100ml nước cất vào erlen có nắp, bảo quản lạnh dành cho sau o Phần 2: 50ml cịn lại quay đến cạn (3ml) dùng chấm sắc ký Ngâm chiết phần bã đậu nành với cloroform lần, lần với 100ml dung môi Vắt, gom dịch chiết, lọc, cô quay thu hồi dung môi, đến thể tích cịn khoảng 3ml Phân tích sắc ký dung dịch chất béo đậu nành: - Chuẩn bị mỏng sắc ký, vạch đường xuất phát đường mốc đến dung môi - Trên mỏng chấm vết sắc ký ứng với loại dịch chiết thu được: dịch eter dầu hỏa (E) dịch chloroform (C) - Chuẩn bị giải ly mỏng loại hệ dung môi khác Dung môi giải ly (1): eter dầu hỏa: etyl acetate (0,5:1,5) Dung môi giải ly (2): chloroform: metanol =99:1 (dùng 2ml chloroform cho vào giọt metanol) - Ghi nhận kết sắc ký ứng với loại dịch chiết so sánh giải ly loại dung môi khác nêu IV KẾT QUẢ: - Chiết chất béo đậu nành: Dịch chiết (E) thu có màu vàng Dịch chiết (C) thu có màu vàng cam nhạt Phân tích sắc ký dung dịch chất béo đậu nành: Kết phân tích sắc ký dịch chiết eter dầu hỏa dịch chiết chloroform với hai hệ dung môi khác - Nhận xét giải thích Với hai hệ dung môi khác chất bảng mỏng có khác Với hệ dung mơi eter dầu hỏa: ethyl acetate (8,5:1,5) vết chạy cao chút so với hệ dung môi giải ly chloroform : metanol (99:1) nhiên chênh lệch không đáng kể độ phân cực hai dung môi gần Sự khác biệt hai hệ dung môi chloroform : metanol vết tách rõ hệ lại Điều chất dung môi, chloroform thường cho vết tách rõ Với hai vết bảng mỏng vết dịch chiết chloroform : metanol cao chút so với vết dịch chiết eter dầu hỏa Nguyên nhân chloroform có độ phân cực yếu eter dầu hỏa nên có chênh lệch Tìm hiểu báo cáo nhóm chất béo dầu mỡ, chất béo biến dưỡng thứ cấp - Chất béo toàn phần (lipid) gồm nhiều hợp chất, chia thành nhóm lớn như: Các chất béo dầu mỡ, Sáp, Phospholipid o Các chất béo dầu mỡ: gồm có acid béo (dạng dầu sệt), hydroxyacid, acetylenic acid hỗn hợp glycerid o Các acid béo có số chẵn carbon o Các acid béo dạng dầu có chứa từ đến nối đôi phân tử Trong thiên nhiên đa số acid béo không no, kể acid không liên hợp quan trọng (như acid oleic, acid linoleic, acid linolenic) có cấu trúc dạng cis o Các acid béo no thường có dạng mỡ, sệt Acid caproic – C6, acid caprylic – C8, acid capric – C20, acid behenic – C22 acid montanic C28 o Khi thực xà phịng hóa chât béo, acid béo tham gia phản ứng nên bị biến đổi hóa tính, tạo muối o Acid acetylenic nhóm hợp chất acid carboxylic dạng dầu ln có chứa liên kết ba phân tử, (có liên kết ba liên hợp, có liên kết ba liên hợp với liên kết đơi) ngồi thêm liên kết đơi Nhóm gồm dẫn xuất có oxygen tương ứng o Ví dụ: acid tairic CH3(CH2)10CC(CH2)4COOH, hợp chất có công thức phân tử acid stearolic CH3(CH2)7CC(CH2)7COOH o Acid ximenynic CH3(CH2)5CH=CHC-CC(CH2)7COOH, o Glycerid xà phịng hóa tạo glycerol muối acid béo Có loại glycerid: loại đơn glycerid loại hỗn hợp glycerid, ví dụ: Oleodistearin glycerid hỗn hợp - Các chất sáp: chủ yếu gồm có acid béo dây hở, ester acid béo alcol monohydric, thường chứa từ 24 đến 36 carbon Ví dụ chất sáp thiên nhiên như: sáp ong (ngồi acid panmitic có chứa acid cerotic alcol melicssylic); mỡ sáp từ lông cừu (lanolin), mỡ sáp dầu cá nhà táng – spermaceti (có chứa alcol cetylic, acid oleic aicd panmitic) Các sáp chịu xà phịng hóa dầu chất béo - Các chất béo hợp chất hữu biến dưỡng thứ cấp, sphyngomyelin phospholipid Phospholipid có chứa acid phosphoric base nitơ (như cholin etanolamin serin) polyhydroxyalcol Sphyngomyelin có mạch acid béo hóa hợp với polyhydroxyamin mạch hở tạo nối amid, cịn có liên kết glycosidic với hydrocarbon BÀI TÁCH CHIẾT STEROL TỪ HỖN HỢP KHƠNG BỊ XÀ PHỊNG HĨA CỦA CHẤT BÉO I ĐẠI CƯƠNG: - Sterol dạng chất béo thuộc nhóm chất hữu biến dưỡng thứ cấp, khác hẳn với chất béo dầu mỡ, khác nhóm phospholipid Sterol thường có cấu trúc hệ vịng cyclopentano perhydrophenantren, với nhóm – OH vị tró C-3 vịng số trường hợp có cấu trúc biến đổi hệ vịng Nhờ cấu trúc mà cách định tính định lượng sterol có phương pháp riêng - Sterol khơng bị xà phịng hóa nên giữ tính chất tan nước, không tan dung dịch chất béo xà phịng hóa, tách khỏi hệ dụng dịch cách chiết lỏng lỏng dung dịch với dung môi hữu phân cực II MỤC TIÊU: - Sử dụng soxhlet để xà phịng hóa chất béo vật liệu → tách rời sterol - Sử dụng bình lóng để chiết lỏng – lỏng, tách lấy sterol khỏi dầu thực vật - Khảo sát, so sánh sản phẩm sterol chất béo ban đầu sắc ký lớp mỏng - Thực cách kéo ống vi quản, sắc ký lớp mỏng III TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM: - Chuẩn bị từ trước chất béo đậu nành: Đã chuẩn bị số - Xà phịng hóa dung dịch chất béo đậu nành: 100ml dung dịch chất béo, thêm 100ml metanol 25g KOH, cho vào đun hồi lưu, đun - Sau thêm 50ml nước cất vào thu hỗn hợp Hỗn hợp chia làm phần, chiết lần, lần với 50ml eter dầu hỏa - Tinh chế hỗn hợp sterol - Dịch chiết eter dầu hỏa rửa với 50ml nước muối bão hòa, làm khan Na2SO4 khan, lọc Dung dịch eter dầu hỏa quay thu hồi dung mơi đến cịn – 5ml cho cốc, ngâm đá, thu lấy tủa Kết tinh lại: hòa tan kết tủa trở vào 3ml chloroform đun nhẹ (50oC), sau lọc qua phễu giấy lọc, ngâm lạnh đặt vào tủ hút để bay hơi, thu tủa sterol - Sắc ký mỏng khảo sát sơ thành phần sterol - Chuẩn bị mỏng sắc ký, vạch đường xuất phát đường mốc đến dung môi Chấm sắc ký vết: dung dịch chất béo đậu nành (1), dịch chiết eter dầu hỏa (2), dung dịch ngâm tủa sterol kết tinh (lấy ngâm vào 1ml eter dầu hỏa)(3) - Chuẩn bị hệ dung môi giải ly CHCl3 : CH3OH (2ml CHCl3 nhỏ giọt CH3OH) - Đặt mỏng sắc ký vào cốc giải ly, chờ đến dung môi dâng cao đến vạch mốc đến dung môi gạch sẳn Lấy giải ly xong hong khô bếp điện Xem kết giải ky mỏng: Bản mỏng soi đèn UV, hình vết: đem nhúng vào thuốc hình vết, hơ nhẹ sấy bếp điện (120oC) đến màu vết, ghi nhận kết IV KẾT QUẢ: Kết sắc ký Nhận xét: Sterol (2), (3) thu mỏng với vết trịn, rõ, khơng kéo vệt so với dung dịch chất béo đậu nành (1) Sterol trước sau kết tinh lại khơng có khác biệt nhiều, vết sterol sau kết tinh lại (3) rõ tạp chút so với trước kết tinh (2) Nguyên nhân q trình kết tinh lại, lọc nóng loại số tạp chất có sterol trước nên vết sterol sau kết tinh lại rõ tạp chất Tìm hiểu báo cáo nhóm chất sterol đậu nành Trong 100g dầu đậu nành có từ 300 – 400mg sterol thực vật Thành phần sterol đậu nành gồm có -sitosterol (53 – 56%), campesterol (20 – 23%) stigmasterol (17 – 21%) Cấu trúc hóa học sterol thực vật giống với cholesterol khác mạch nhánh Sitostreol có nhóm ethyl campesterol có nhóm methyl vị trí 24 cholesterol, Stigmasterol có liên kết đơi vị trí 22 – 23 sitosterol -sitosterol ▪ Cấu trúc 10 số nhiều phytosterol (sterol thực vật) có cấu trúc giống với cholesterol -sitosterol chất bột màu trắng, dạng sáp, mùi dễ chịu, không tan nước tan alcohol -sitosterol 11 • Ứng dụng Khi tồn dạng hợp chất với phytosterol tương tự, -sitosterol làm giảm lượng cholesterol dùng để chữa tăng cholsterol máu -sitosterol ngăn cản cholesterol hấp thu vào ruột Khi sterol hấp thu vào ruột, vận chuyển lipoprotein kết hợp với màng tế bào Các phytosterol phytostanol ngăn cản hấp thu cholesterol chế độ ăn uống cholesterol mật, làm giảm mức độ LDL cholesterol huyết tương Bởi cấu trúc (-Sitosterol giống với cấu trúc cholesterol, (-Sitosterol chiếm chỗ cholesterol mật chế độ ăn dạng hạt micelle tạo từ lumen ruột, điều làm cho lượng cholesterol hấp thu vào thể giảm • Kỹ thuật hóa học Trong nhiều năm, người ta sử dụng sitosterol chất hóa học trung gian thiếu hóa chất để công vào mạch nhánh để khử mạch nhánh Nhiều nhà khoa học nỗ lực để khám phá vi ống pseudomonas có hiệu việc chuyển đổi cấu trạng Sự lên men tiêu hóa tồn mạch nhánh no C-17 để tạo thành hỗn hợp sản phẩm 17-keto bao gồm dehydropiandrosterone • Tác dụng phụ ▪ Tránh dùng (-Sitosterol cho phụ nữ mang thai cho bú, có nhiều ảnh hưởng trẻ chưa sinh trẻ sinh ▪ Những người bị sitpsterolemia, bệnh dự trữ chất béo (Sitosterol Bởi người bị bệnh có nhiều (Sitosterol chất béo có liên quan, dùng thêm (Sitosterol làm cho tình trạng xấu ▪ Nồng độ (Sitosterol máu cao liên quan đến gia tăng bệnh tim nghiêm trọng người có tiền sử bị đau tim • Làm trật tự gene Trong sterol thực vật thường có ích, hấp thu nhiều phytosterol gây trật tự nhiễm sắc thể gene lặn Phytosterol tăng cao bị hấp thu mức mô gây hội chứng động mạch vành sớm gân xanthoma • Tiền chất đồng hóa steroid boldenone 12 ▪ Là steroid, (-Sitosterol tiền chất đồng hóa steroid boldenone Boldenone udecylenate thường dùng thuốc thú y để kích thích sinh trưởng gia súc steroid đồng hóa đước sử dụng nhiều thể thao Điều dẫn đến nghi ngờ vài vận động viên thử nghiệm dương tính với boldenone undeculenate khơng lạm dụng hormone mà dùng thực phẩn giàu Sitosterol Stigmasterol ▪ Cấu trúc: ▪ Stigmasterol (được biết đến nhân tố chống cứng Wulzen, Wulzen anti-stiffness factor) số sterol thực vật hay phytosterol, không tan nước mà tan hầu hết dung mơi hữu có chứa nhóm chức alcohol ▪ Hiện diện Stigmasterol sterol thực vật không no, có dầu thực vật hay dầu đậu nành, hạt nho nhiều cậy thực vật dược cỏ Trung Quốc Ophiôpgon japonicas (Mai men dong) Nhân sâm Mỹ Stigmasterol có nhiều lọa rau củ, họ đậu, hạt, hạt giống sữa chưa tiệt trùng Sự tiệt trùng làm bất hoạt Stigmasterol Dầu ăn chứa nhiều Stigmasterol rau củ Các phytosterol chủ yếu bị phân cắt mật 13 ▪ Ứng dụng Stigmasterol sử dụng làm tiền chất cho việc sản xuất progesterone bán tổng hợp, hormone có giá trị người, giữ vai trò sinh lý quan trọng chế điều tiết tái tạo mô liên quan đến ảnh hưởng estrogen chất trung gian sinh tổng hợp androgen, estrogen corticoid Stigmasterol dung tiền chất vitamin D3 ▪ Các nghiên cứu Các nghiên cứu cho thấy Stigmasterol có ích việc ngăn chặn ung thư buồng trứng, tuyến tiền liệt, vú ruột kết Các nghiên cứu cho thấy chế độ ăn nhiều phytosterol ức chế hấp thu cholesterol làm giảm mức cholesterol huyết cách cạnh tranh với trình hấp thu ruột Các nghiên cứu động vật phịng thí nghiệm cho thất động vật cho ăn Stigmasterol cholesterol sitosterol giảm tương ứng 23% 30%, thời gian tuần Các nghiên cứu chứng minh Stigmasterol ức chế nhiều chất trung gian viêm chất trung gian thối hóa chất liên quan mật thiết đến viêm xương khớp thối hóa sụn Stigmasterol cịn có khả chống oxy hóa, hạ đường huyết ức chế tuyến giáp ▪ Tiền chất boldenone Tương tự sitosterol, Stigmasterol steroid, đồng thời tiền chất đồng hóa steroid boldenone Boldenone udecylenate thường dùng thuốc thú y để kích thích sinh trưởng gia súc steroid đồng hóa đước sử dụng nhiều thể thao Điều dẫn đến nghi ngờ vài vận động viên thử nghiệm dương tính với boldenone undeculenate không lạm dụng hormone mà dùng thực phẩn giàu Stigmasterol 14 Campesterol ▪ Cấu trúc ▪ Campesterol phytosterol có cấu trúc tương tự cấu trúc cholesterol Campesterol có nhiều loại rau củ, trái cây, loại hạt hạt giống với hàm lượng thấp Trong chuối, ớt, thạch lựu, cà phê, bưởi, dưa leo, củ hành, lúa mạch, khoai tây cỏ chanh có chứa từ – mg Campesterol /100g phần ăn Trong dầu canola vfa dầu bắp có từ 16 – 100mg Campesterol / 100mg Hàm lượng Campesterol nhiều hay tùy thuộc vào ảnh hưởng điều kiện địa lý môi trường phát triển Sự khác giống gây nên khác sterol thực vật Nhiều giống nghiên cứu nhằm tạo nhiều giống có nhiều Campesterol sterol thực vật khác ▪ Campesterol cô lập lần từ hạt nho (Brassica campestris) tên đặt theo tên Campesterol có tính kháng viêm, có khả ức chế chất trung gian viêm chất trung gian thối hóa chất liên quan mật thiết đến viêm xương khớp thối hóa sụn ▪ Tiền chất đơng hóa steroid boldenone Tương tự sitosterol campesterol, stigmasterol steroid, đồng thời tiền chất đồng hóa steroid boldenone Boldenone udecylenate thường dùng thuốc thú y để kích thích sinh trưởng 15 gia súc steroid đồng hóa đước sử dụng nhiều thể thao Điều dẫn đến nghi ngờ vài vận động viên thử nghiệm dương tính với boldenone undeculenate không lạm dụng hormone mà dùng thực phẩn giàu Campesterol phytosteroid tương tự ▪ Hội chứng tim mạch o Những năm 1950, lần sterol thực vật chứng minh có ích việc làm giảm LDL cholesterol Kể từ đó, nhiều nghiên cứu ghi nhận lại lợi ích chế độ ăn uống có phytosterol, bao gồm campesterol o Các nhà nghiên cứu cho phân tử campesterol cạnh tranh với cholesterol, làm giảm hấp thụ cholesterol vào ruột Các sterol thực vật hoạt động trực tiếp tế bào ruột ảnh hưởng đến trình vận chuyển protein Thêm vào đó, có ảnh hưởng đến ựu tổng hợp cholesterol vận chuyển protein qua tế bào gan qua q trình gồm ester hóa cholesterol ester hóa lipoprotein, tổng hợp cholesterol khử lipoprotein có chứa apolipoprotein B100 o Hàm lượng huyết campesterol tỉ lệ campesterol cholesterol sử dụng để đo lường ảnh hưởng xấu tới tim mạch Một vài nghiên cứu cho thấy hàm lượng cao tim mạch gặp nguy hiểm Tuy nhiên, hàm lượng cao tiềm tang nguy hiểm cao hơn, ví dụ trật tự gene sitosterolemia Các nghiên cứu dựa hamg lượng huyết có mâu thuẫn Một phân tích meta gần cho thấy khơng có mối quan hệ rõ ràng nghiên cứu trước kết luận dựa nhân tố khác Ví dụ, người có hàm lượng campesterol cao liên quan đến chế độ ăn gồm nhiều trái cây, hạt theo thực đơn người Địa Trung Hải ngủy hiểm so với người khác ăn nhiều thực phẩm nhiều chất béo Sự hấp thu cholesterol ruột thay đổi cá nhân khác hấp thu nhiều sterol thực vật liên quan đến việc hấp thu nhiều LDL 16 o Mặc dù nghiên cứu người cho thấy việc tiêu thụ phytosterol làm giảm mức độ LDL, nhiên khơng có đủ chứng để đưa phytosterol vào điều trị tăng cholesterol máu Thực tế, cần nhiều nghiên cứu sâu để chứng minh cho lập luận tiến hành Các nghiên cứu động vật cho thấy campesterol phytosterol khác làm giảm kích thước mảng bám bị xơ vữa, chưa có lệu chứng minh tiêu thụ phytosterol tiện ích lâm sàng ví dụ giảm xơ vữa động mạch, bệnh tim mạch hay tử vong ▪ Các tác dụng phụ o Làm giảm hàm lượng beta-carotene o Làm giảm hàm lượng lycopene o Làm giảm hàm lượng vitamin E o Làm tăng nguy bệnh xơ vữa bệnh tim mạch 17 Bài 4: PHÂN TÍCH SẮC KÝ DẦU BÉO THỰC VẬT I ĐẠI CƯƠNG: - Trong số lồi thực vật có chứa nhiều hợp chất béo dạng dầu, số loài động vật có chất béo dạng mỡ sáp, số lồi nấm men có chất béo sterol - Tuy nhiên, chất béo, hợp chất phân cực khác tồn lại chất khác dạng dầu tetraterpene, xantopil hỗn hợp trích từ thực vật Trong hỗn hợp dầu béo thực vật, số lượng hợp chất thường nhiều chất - Các hợp chất dầu béo alcohol, acid béo ester hoa có vai trị tạo màu mùi thơm cho thực vật II MỤC TIÊU YÊU CẦU: - Phương pháo ngâm dầm: ngâm chiết hợp chất có cơm gấc - Phương pháp chiết lỏng-lỏng: tách chiết nhóm chất có tính phân cực khác từ dịch chiết alcohol tổng với dung môi hữu khác - Khảo sát sơ thành phần hợp chất dung môi chiết khác sắc ký lớp mỏng (SKLM, thin layer chromatography) - Phân tích sơ thành phần chất béo dạng dầu gấc sắc ký cột hở (SKC, open column chromatography) III TIẾN HÀNH: Chiết chất béo gấc - Chuẩn bị: cơm gấc (400g) gâm rượu (ngâm với cồn cao độ), rót cốc có dung tích 80mL Chia làm phần khơng nhau, phần (10ml) đem đun cách thủy khoảng 30 phút, để sử dụng cho sắc ký lớp mỏng Phần lại (70ml) cho chiết tách dầu gấc - Cho 30mL nước vào phần chứa 70mL rượu gấc, khuẩy Dùng ether dầu hỏa chiết tách với rượu gấc, lần chiết lần dùng 70mL ether dầu hỏa Gôm dịch chiết ether dầu hỏa, làm khan, cô quay thu hồi dung môi, thu dầu gấc 18 Chú ý: Cô quay đến cịn thể tích khoảng 10mL lấy bình ra, dùng 2mL chấm sắc ký lớp mỏng, phần cịn lại cạn cạn để sắc ký cột Ngâm chiết phần dung dịch rượu gấc tách béo với ethyl acetate lần, lần với 50mL dung môi Gom dịch chiết, cô quay thu hồi dung môi, thu cao Ea Chấm sắc ký dung dịch chiết có độ phân cực khác gấc: - Chuẩn bị mỏng sắc ký, chấm lên mỏng vết: dịch ngâm alcohol, dầu gấc dịch chiết ethyl acetate - Chuẩn bị hệ giải ly: Dung môi giải ly 1: ether dầu hỏa: ethyl acetate 1:1 Dung môi giải ly 2: dichloromethane: methanol 9:1 - Giải ly mỏng cho vết quan sát Kết quả: Màu sắc vết sắc ký lớp mỏng - Cao chiết ether dầu hỏa có màu vàng - Cao chiết với ethyl acetate có màu vàng cam Dung môi giải ly 1: Từ trái sang phải vết dịch ngâm alcohol, dầu gấc gấc dịch chiết ethyl acetate Dung môi giải ly 2: Từ trái sang phải vết của, dịch ngâm alcohol gấc dầu gấc dịch chiết ethyl acetate 19 5.Sắc ký cột dung dịch dầu béo gấc: - Chuẩn bị cột sắc ký, cho gịn vào cột, ngâm silica gel (5g) dung mơi eter dầu hỏa (20 ml), khuấy thành huyền phù đồng trước nạp cột - Nạp cột ướt, nạp mẫu dầu gấc cô sệt chừng 2ml - Dung môi giải ly cột (1): eter dầu hỏa, - Dung môi giải ly cột (2): eter dầu hỏa:etyl acetate = 1:1 - Dung môi giải ly cột (3): etyl acetate - Lần lượt hứng phân đoạn giải ly cốc khác - Lưu kết sắc ký cột - Chú ý: Sắc ký lớp mỏng đoạn giải ly so với mỏng mục → Nhận xét: Các vết có độ cao gần ngang nhau, hình dạng vết có khác biệt chiết dung mơi có độ phân cực khác 20 BÀI 5: TÁCH CHIẾT ALKALOID TOÀN PHẦN CHIẾT PIPERIN TỪ HẠT TIÊU ĐEN I MỤC TIÊU: - Nắm kiến thức liên quan đến alkaloid như: phương pháp tách chiết, tính chất hóa học, hoạt tính - Thực sắc ký mỏng - Ôn luyện kỹ kết tinh kết tinh lại II THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT: Cối xay phần xay khô/ máy xay sinh tố Cốc thủy tinh, ống đong loại Bộ chiết Shoxlet Cối, chày sứ Hạt tiêu đen (20g) Etanol 95o Metanol KOH III TIẾN HÀNH: - Hạt tiêu đen khoảng 20g tiến hành nghiền thành bột, sau chiết nóng với 150ml Etanol 95o Shoxlet Lọc lấy dung dịch thu được, cô cạn cách đun cách thủy đến thu dung dịch cặn (nước khan) - Thêm 20mL dung dịch 10% KOH metanol vào cặng trên, để yên 15 phút, lọc lấy dung dịch - Piperin kết tinh từ dung dịch sau đêm Muốn kết tinh nhanh piperin phải lọc nóng - Xác định hình dạng, màu sắc tinh thể đo nhiệt độ nóng chảy tinh thể thu - Tính tốn hiệu suất q trình - Sắc kí: hịa tan tinh thể diclorometan, chấm lên bảng mỏng sau giải ly diclorometan có giọt metanol Sấy khô mỏng nhúng bảng mỏng vào hỗn hợp H2SO4 20% CH3OH Sấy khô mỏng quan sát vết mỏng IV KẾT QUẢ: Tìm hiểu viết báo cáo nhóm alkaloid hạt tiêu: 21 - Alkaloid hạt tiêu nhóm hợp chất tự nhiên mà phân tử có chứa ngun tố Nitrogen dạng vịng (Alkaloid thật) khơng dạng vòng (protoalkaloid), diện nhiều họ thực vật với cấu trúc hoạt tính sinh học đa dạng - Piperine, với đồng phân – chavicine, alkaloid, chất tạo nên vị cay cho tiêu đen (Piper nigrum) tiêu lốt (Piper longum) Piperine có dạng hình kim đơn tà; tan nước tan nhiều dung môi hữu alcohol, ether, chloroform, Tỉ khối: 1.193 g/cm3 Công thức phân tử: C17H19NO3 - Piperine sử dụng dân gian thuốc diệt trùng Ngồi ra, cịn có số hoạt tính sinh học đa dạng chống trầm cảm chuột; ức chế nhiều enzyme quan trọng chuyển hóa vận chuyển thuốc (CYP3A4 P-glycoprotein) Piperine làm tăng tính sinh khả dụng (bioavailability) curcumin lên 2000% người Gần đây, nhà khoa học khám phá piperine kích thích sắc tố da, với việc tiếp xúc với ánh sáng UVB - Piperine lập suất tốt từ hạt tiêu đen mặt đất, tạo thành từ 5-9% alkaloid bao gồm piperidin, piperettine piperanine xuất phát từ trái sấy khô 22 Bài 6: TÁCH CHIẾT FLAVONOID CHIẾT HESPERIDIN TỪ VỎ CAM BƯỞI I MỤC TIÊU - Việc nghiên cứu, tách chiết chất thuộc nhóm flavonoid (thuộc nhóm chất hữu phân cực), cần có phương pháp riêng biệt so với tách chiết hợp chất hữu phân cực yếu thường gặp - Áp dụng tách tinh chế hesperidin (một lọai dược liệu quý từ vỏ cam) - Áp dụng phương pháp chiết flavonoid dung dịch kiềm II TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 1) Xay khơ ngun liệu 2) Chiết Flavonoid toàn phần phương pháp loại béo, ngâm alcol - 50g vỏ cam (bưởi) khô xay bột cho vào bình cầu lắp ống sinh hàn ngược Thêm vào 150ml eter dầu hỏa, đun nóng cách thủy 30 phút, để loại béo Sau dịch lọc đem quay thu lấy chất béo - Bột nguyên liệu để khô, thêm vào 0.5 lít metanol, đun hồi lưu 30 phút - Dung dịch thu đem lọc, cô quay đến thể tích 10ml dạng siro chứa flavonoid tồn phần 3) Tách hesperidin từ flavonoid toàn phần - Dùng 10ml acid HCl 2M đun nóng cho vào siro này, kiểm tra đến pH = 4-5, đun cách thủy phút, lọc nóng Hesperidin tách bột vơ định hình - Lọc, rửa với nước kết tinh lại dung dịch formamaid III BÁO CÁO KẾT QUẢ THU HOẠCH 1) Tính hiệu suất q trình chiết flavonoid thơ: Khơng tính kết khơng có tinh thể 2) Kết sắc kí thu được: Dung mơi giải ly: Diclorometan : metanol : acid acetic (7:3:2 giọt) 23 Tách chất 3) Phương pháp tách chiết flavonoid: Các flavonoid có độ hịa tan khác tùy theo số nhóm hydroxy nhóm khác có cấu trúc hóa học, nên khó có phương pháp chung để trích ly flavonoid khỏi Sau số phương pháp thông dụng: a) Tủa flavonoid dung dịch acetate chì (CH3COO)2Pb: - Cao chiết hòa tan vào dung dịch 10% ethanol/nước chứa erlen Từ từ rót vào erlen dung dịch nước 10% acetate chì, khuấy nhẹ có tủa flavonoid Lọc thu lấy tủa hòa tan tũa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành dung dịch treo đồng rót thêm vào dung dịch nước bão hịa Na2SO4 nhằm loại bỏ tủa chì PbSO4 Lọc lấy dung dịch nước trong, đuổi nước cô quay chân khơng thu cao thơ chứa flavonoid tồn phần sắc ký cột để tách riêng flavonoid b) Hấp thu flavonoid than hoạt tính: - Cho than hoạt tính vào dung dịch cao chiết nhằm hấp thu flavonoid Lọc lấy than Sử dụng dung môi hữu từ phân cực yếu đến phân cực mạnh, thí dụ ethyl eter, ethyl acetate, methanol, nước nóng, phenol 7% để chiết flavonoid có tính phân cực khác 24 c) Tách phân đoạn flavonoid dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau: Các flavonoid có mang nhiều nhóm –OH phenol nên tan dung dịch kiềm dựa vào nguyên tắc này, sử dụng dung dịch kiềm loãng nước vôi để chiết flavonoid khỏi cỏ, sau dung dịch chiết acid hóa để trả flavonoid dạng – OH tự - Tiến hành: Hịa tan cao chiết vào dung mơi hữu thích hợp thí dụ cloroform, ethyl acetate… Tiếp theo, thực chiết lỏng-lỏng dung dịch với dung dịch nước kiềm 5-10% như: dung dịch borat natri, NaHCO3, Na2CO3… Các dung dịch nước kiềm gộp chung lại, acid hóa Sử dụng dung mơi hữu phù hợp để chiết tách flavonoid khỏi dung dịch nước Làm khan nước CaCl2, Na2SO4… Đuổi dung môi thu cao thơ chứa flavonoid tồn phần Sắc ký cột để tách riêng flavonoid Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách flavonoid khỏi dung dịch acetate chì Hết 25 ... béo, hợp chất phân cực khác tồn lại chất khác dạng dầu tetraterpene, xantopil hỗn hợp trích từ thực vật Trong hỗn hợp dầu béo thực vật, số lượng hợp chất thường nhiều chất - Các hợp chất dầu... BÉO THỰC VẬT I ĐẠI CƯƠNG: - Trong số lồi thực vật có chứa nhiều hợp chất béo dạng dầu, số lồi động vật có chất béo dạng mỡ sáp, số loài nấm men có chất béo sterol - Tuy nhiên, ngồi chất béo, hợp. .. Câu 3: Nguyên tắc lóng tách chất lỏng từ hỗn hợp: • Chất lỏng cho vào phải có khả hịa tan (lơi cuốn) chất cần chiết (tinh dầu) mạnh chất lỏng có sẵn hỗn hợp • Hai chất lỏng phải khơng hịa tan