Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên phương pháp sắc ký cột

Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên phương pháp sắc ký cột

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 3

NỘI DUNG ……….………… 4

Chương 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ ……… 4

1 Lịch sử sắc ký ……… 4

2 Định nghĩa sắc ký……… 4

3 Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký ……… 5

4 Phân loại sắc ký……… 6

4.1 Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng ……… 6

4.2 Phân loại theo bản chất tương tác……… 7

4.3 Phân loại theo cấu hình ……… 8

Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ ……… ………… 10

1 DỤNG CỤ - HÓA CHẤT ……… 10

1.1 Cột……… 10

1.2 Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột ……… 10

1.2.1 Silica gel ……… 10

1.2.2 Alumina ……… 14

1.2.3 Kieselguhr – Celite ……… 14

1.2.4 Gel ……….14

1.3 Dung môi ……… 15

1.3.1 Các dung môi thường dùng cho sác ký cột ……… 15

1.3.2 Cách chọn dung môi thích hợp……… 15

1.4 Mẫu sắc ký ……… 15

2 KỸ THUẬT TIẾN HÀNH ……… 16

2.1 Chuẩn bị cột ……… 16

2.2 Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký ………17

2.2.1 Nạp mẫu dạng dung dịch ……… 17

2.2.2 Nạp mẫu dạng bột khô ……… 18

2.3 Giải ly chất ra khỏi cột ……… 19

2.3.1 Các phương pháp giải ly ……… 19

2.3.2 Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly ……… 20

2.3.3 Vận tốc giải ly ……….……… 21

2.3.4 Theo dõi quá trình giải ly cột ………22

2.3.5 Ghi nhận kết quả sắc ký ………23

2.4 Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất ……… 23

3 ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ ……… 24

3.1 Ưu điểm ……… 24

3.2 Nhược điểm ……… 24

3.3 Ứng dụng ……… 24

Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC ……… 25

1 Sắc ký cột khô ……… 25

2 Sắc ký cột nhanh ……… 27

3 Sắc ký nhanh cột khô ……… 29

KẾT LUẬN ………32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ……… 33

MỞ ĐẦU

Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trămnghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ chonhiều lĩnh vực của cuộc sống Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấpcác hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường đểtổng hợp ra các loại thuốc mới Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, cácnhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao

Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết

Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ Mộttrong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký Phương phápsắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanhchóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa họccác hợp chất thiên nhiên Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, chophép ta ứng dụng nó ở mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện Ngày nay, phương pháp sắc kýđược sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượngphân tử nhỏ hay lớn

Do các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớnnhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuậtsắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau Trong bài báo cáo này, tôi xin giới

thiệu một phương pháp sắc ký thường dùng trong phòng thí nghiệm đó là Phương pháp Sắc ký cột Đối với người nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên thì việc

tìm hiểu sơ bộ về sắc ký cột cũng như việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột là một việc vôcùng cần thiết, có thể sử dụng hiệu quả vào trong công tác nghiên cứu của mình

NỘI DUNG Chương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ

1 Lịch sử sắc ky

Từ ngữ sắc ký trong tiếng Anh là “chromatography” có xuất xứ từ chữ “chroma”trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu Năm 1903 nhà thực vật học người NgaMikhail Semyonovich Tsvett đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxicacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lácây Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặttên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghimàu vì đã tách được những chất có màu

Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứunhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cáchkhác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau Đồng thời, kĩ thuật thực hiệnsắc ký cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau Sự pháttriển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩaban đầu của nó Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chungnhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chấtbất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sựchuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động)

Trong những năm 1930, hàng loạt các nhà hóa học đã được vinh danh bằng giảithưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ vào những thành công trongviệc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ:

- 1937, P KARRER (Thụy Sĩ) về hóa học Carotenoid đặc biệt là vitamin A vàvitamin B

- 1938 R.KUHN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin

- 1939 L.RIZICKA (Thụy Sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid

- 1940 MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớpsilica gel và về sau phát triển sang sắc ký giấy Hai ông được giải thưởng Nobel năm

2 Định nghĩa sắc ky

- Định nghĩa của Mikhail S Tsvett (1906): sắc ký là một phương pháp tách trong

đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thốngđang chảy

- Định nghĩa của IUPAC (1993): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu

tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên cònpha kia chuyển động theo một hướng xác định Trong sắc ký cột, pha tĩnh được giữtrong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc dotrọng lực

- Hiện nay: sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sựphân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh

3 Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ky

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗnhợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh

Trạng thái cân bằng, các thành phần của hỗn hợp đã phân bố giữa hai pha theo một tỉ lệ nhất định

Nhận xét:Hợp chất ( ) có ái

lực mạnh hơn đối với pha tĩnh

Hệ số phân chia là sự phân bố thí dụ: của 2 loại hợp chất ( ) và ( ) trong một hệ thống gồm có hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hĩa học đối với các chất trong quá trình sắc ký, cột cĩ thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi là “cột”với chất hấp phụ đĩng vai trị pha tĩnh, dung mơi rửa cột đĩng vai trị pha động chảyqua chất hấp phụ

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhơm, silica gel, CaCO3, thanhoạt tính, polyamid, các loại cĩ gắn nhĩm ion,… Các chất này phải được tiêu chuẩnhĩa

Dung mơi dùng cĩ thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung mơi cĩ tỉ lệ thíchhợp Quy trình rửa giải nĩi chung là sử dụng dung mơi cĩ tính chất hướng về một phíahoặc tăng hoặc giảm về tính chất Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung mơi

sử dụng cĩ độ phân cực tăng dần

Việc tách hai hợp chất nào đĩ ra riêng cĩ đạt kết quả tốt hay khơng là tùy thuộcvào hệ số phân chia (partition coeffiicient) Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vàomột hệ thống gồm cĩ 2 pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạngthái cân bằng, hợp chất đĩ sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệnày thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha

Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:

s m

C Nồng độcủacác hợp chất trong pha tĩnh K

C Nồng độcủa hợp chất trong pha động

Mỗi hợp chất sẽ cĩ ái lực riêng của nĩ đối với hai pha, vì thế sẽ cĩ tương tácmạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang quapha tĩnh với một vân tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký cĩ thể tách riêng các loạihợp chất

4 Phân loại sắc ky

4.1 Phân loại theo bản chất hai pha sử dụng

Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹthuật sắc ký khác nhau

- Pha tĩnh: cĩ thể là chất rắn hoặc chất lỏng Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đĩ là nhờ vào tính chất hấp phụ của nĩ

+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chấtmang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn.

- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí

+ Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc

ký cột

4.2 Phân loại theo bản chất tương tác

 Sắc ký phân chia:

* Pha động: chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

* Pha tĩnh là chất lỏng, đó là một lớp chất lỏng với chiều dài thật mỏng, chấtlỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có trơ

 Sắc ký hấp phụ:

* Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồitrong một cái ống Những hạt rắn trơ này cũng giống như những hạt rắn trong sắc kýphân chia, nhưng không có phủ chất lỏng bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh

Tiêu biểu của sắc ký hấp phụ Pha tĩnh rắn là những hạt rắn, nhuyễn, trơ

 Sắc ký trao đổi ion:

Tiêu biểu của sắc ký trao đổi ion

* Pha động là chỉ có thể là chất lỏng

* Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học gọi làpolyme, nên được gọi là các hạt nhựa Bề mặt của các hạt mang nhóm chức ở dạngion

4.3 Phân loại theo cấu hình

 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng:

Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấpphụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặtphẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong mộtdung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thínghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

Chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường lànước) được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký Nhờ các xoangrỗng trong sợi cellulose của tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dungmôi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất Khitiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp

 Sắc ký cột

Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giốngnhư cái buret định phân trong phòng thí nghiệm

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng

ở đây pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều

hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh

Trong sắc ký cột pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột Tùy theo tính chấtcủa chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cộthấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố)

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất

khí quyển Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước

tương đối lớn (50-150μm), được nạp trong một cột

bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt phía

trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên

bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt Dung môi giải ly

được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới

cột, rồi đem cô quay đuổi dung môi, dùng sắc lý lớp

mỏng để theo dõi quá trình giải ly

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường thì hợp chất không hoặckém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau

Còn trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽgiải ly ra khỏi trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly sau.

Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫuchất cần phân tách

- Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn

25-50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký Tuy nhiênvới những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêngthì cần sử dụng số lượng chất hấp phụ nhiều hơn(lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấpphụ ít hơn

- Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính trong của cột vào khoảng10:1

Muốn biết lượng chất hấp phụ có phù hợp với cột thì cho chất hấp phụ khô vàocột để quan sát

1.2 Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột

1.2.1 Silica gel

* Silica gel pha thường: được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác

dụng với acid sulfuric) để thành polysilisic, tiếp theo là ngưng tụ và polyme hóa để đạtcác chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt,diện tích bề mặt, … như yêu cầu

Silica gel

Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng40-200µm, các lỗ rỗng có đường kính trung bình khoảng 40-300A°, diện tích bề mặtkhoảng 100-800 m2/g

Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là các nhóm silanol, mỗi nhómcách nhau 5A° Đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh vớinhững hợp chất được sắc ký Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, nhữnghợp chất phân cực (có mang nhóm chức -OH, -NH2, -COOH ) có khả năng tạo nốihydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra chậm hơn so với nhữngchất khác có tính kém phân cực như alkan, terpen (là những hợp chất không chứanhững nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cộtsớm

- Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bỏnước Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạtđộng trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốn silica gel hoạt tínhtrở lại, chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước Đây là quá trình thuận nghịch, muốn làmgiảm hoạt tính silica gel thì chỉ cần cho thêm nước vào Tuy nhiên, khi đun nóngkhoảng 400-500°C, quá trình thuận nghịch biến mất, silica gel bị mất vĩnh viễn hoạttính bề mặt, do hai nhóm silanol kề bên mất một phân tử nước, tạo thành nối eter,không còn tính sắc ký

Mô tả bề mặt hạt silica gel

- Hoạt tính của silica gel là khả năng hấp phụ nước, được đo bởi số Brockmann.Silica gel có số Brockmann càng lớn thì bề mặt càng kém hoạt tính

- Có thể hiệu chỉnh tính của silica gel bằng cách cho silica gel kết hợp với

những hợp chất khác như base, các dung dịch đệm ở mức pH xác định Cũng có thểthêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là alken

Tuy nhiên cũng cần nhớ là với một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lạitrong cột, giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không cũng còn tùy vào việc sử dụngdung môi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu Dung môi nào có thể tạo nối hydrogenmạnh sẽ là dung môi thích hợp để giải ly các hợp chất phân cực mạnh ra khỏi cột silicagel Hơn nữa, muốn đuổi hết các hợp chất phân cực thí dụ các flavonoid, triterpenglycosid nên dùng 1-2% acid axetic trong metanol

* Silica gel chế hóa: được điều chế bằng cách cho các nhóm chức silanol của

silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những loại chất hấpphụ mới, với các đặc tính vật lý đổi khác, được gọi là silica gel-tạo nối Có thể chế hóathành silica gel-tạo nối dùng cho pha thường hoặc pha đảo

- Silica gel tạo nối dùng cho pha đảo: Cho silica gel tác dụng với

clorodimetylalkylsilan R-Si(CH3)2-Cl để tạo silica gel mới có tính không phân cực.Dây alkyl R thường là C-1, C-2, C-4, C-6, C-8, và C-18 Tuy nhiên, thường hay chếtạo dây C-8 và C-18 Silica gel pha đảo có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực

và giữ chặt các hợp chất này lại trong cột Pha động thường là nước, sau đó thêm vàocác dung môi hữu cơ để làm giảm độ phân cực của dung môi giải ly, như thế chất phâncực sẽ giải ly ra khỏi cột trước, và những chất kém phân cực sẽ ra sau

Cấu trúc bề mặt silica gel pha đảo

- Silica gel tạo nối dùng cho pha thường: Điều chế tương tự như silica gel tạo

nối dùng cho pha đảo với R thường là: phenyl, cyano, amino, diol,…Ưu điểm của nó

là bền đối với tất cả các loại dung môi kể cả các dung môi có tính phân cực mạnh nên

có thể sử dụng dung môi phân cực mạnh để giải ly ra khỏi cột tất cả các hợp chất cótính phân cực mạnh, trong khi đó silica gel thường sẽ giữ rất mạnh các hợp chất cótính phân cực, nhiều khi hợp chất bị dính luôn trong cột, không thể giải ly ra khỏi cột

Cấu trúc và tên gọi một số loại silica gel-tạo nối dùng cho pha thường

- Silica gel tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính:

Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa học lậpthể của chúng Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khi đối phân còn lại không cóđược tính đó, mà lại có khi còn độc hại, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng Nhưnghai đối phân có đặc tính vật lý giống nhau, cùng độ hòa tan vào cùng một loại dungmôi nào đó, nên không thể sử dụng sắc ký để tách chúng được, cho dù sử dụng silicagel pha thường hay pha đảo, cột thường hay cột hiệu năng cao HPLC

Có nhiều loại silica gel thương phẩm sử dụng cho sắc ký thủ tính với cơ chế lưugiữ chất khác nhau, một số những chất đó sử dụng silica gel làm chất nền

Bảng 1: Phân loại một vài pha tĩnh thủ tính

Loại pha thủ tính Cơ chế bắt giữ chất của pha tĩnh

Polymer hình xoắn ốc - thủ tính

(polysaccarid) Các nối kỵ nước (hydrophobic bond)

Tương tác giữa chủ-khách (tương tác giữa chất

1.2.3 Kieselguhr-Celite

Kieselguhr và Celite là loại đất sét diatomit Nguyên liệu này có các lỗ rỗnglớn, diện tích bề mặt lớn và có tính hấp phụ rất yếu Khả năng hấp phụ còn có thể giảmhơn nữa bằng cách cho tác dụng với dung dịch HCl 3%, rửa sạch clor và sấy khô ở

80oC Với các tính chất trên, nó được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân chia

1.3.1 Các dung môi thường dùng cho sắc ky cột: hexan, benzene, chloroform,

aceton, etanol, methanol, butanol, nước

Thứ tự độ phân cực tăng dần: Ete dầu hỏa < hexan < xiclohexan < CCl4,<benzen < toluen < diclometan < CHCl3 < dietyl ete < etyl axetat < axeton < pyridin <propanol < etanol < nước < axit axetic

Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với 1 loại dung môi giải ly khác nhau,

kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử Với đơn dungmôi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp Từ kết quả đó, cố gắng tìm mộthỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này chosắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cựccho dung môi giải ly

Lưu ý:

- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau

- Phải chỉnh tỉ lệ dung môi giải ly cột sao cho có tính kém phân cực 1 ít so với

- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân

cực so với hệ dung môi pha động VD: Pha động là benzen-EtOAc thì tốt nhất là hòatan mẫu trong benzene, nếu mẫu không tan trong benzene thì dùng dung môi phân cựchơn benzene một chút

- Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol,

thêm vào silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu đượcmẫu ở dạng bột mịn tơi xốp

Mẫu dạng dung dịch đậm đặc Mẫu dạng bột khô

2 KỸ THUẬT TIẾN HÀNH

2.1 Chuẩn bị cột: Yêu cầu là chất rắn làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm

trong cột thành một khối đồng nhất

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch) Kẹp cột thẳngđứng trên giá

- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột Có 2 cách nhồi cột: nhồicột ướt và nhồi cột khô

+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như

sau:

Trong 1 becher có chứa sẵn dung môi, cho chất hấp phụ

từng lượng nhỏ và đều đặn vào becher, vừa cho vừa khuấy đều

Đặt lên đầu cột một phễu lọc đuôi dài, rót hỗn hợp sệt vào

cột, mở nhẹ khóa bên dưới cột cho dung môi chảy qua, hứng

dung môi vào một becher trống, dung môi này được sử dụng lại

để rót lên đầu cột

Rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng 1 thanh cao su

gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột