các phương pháp tách chiết nucleic acid

các phương pháp tách chiết nucleic acid

Các phương pháp tách chiết nucleic acid Phạm Hùng Vân Tách chiết DNA • Tách chiết thô, chưa tinh khiết được DNA từ mẫu một cách hoàn toàn. Phương pháp áp dụng cho các mẫu có nhiều DNA đích (canh cấy vi khuẩn, tách chiết các mẫu thuỷ sản ) • Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được DNA từ mẫu một cách hoàn toàn Tách chiết DNA bằng proteinase K  Là phương pháp tách chiết thô  Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng dung dịch proteinase K, chất tẩy và nhiệt độ để làm tiêu hóa protein bám trên DNA của virus cũng như vi khuẩn. Ngoài ra dung dịch cũng làm tiêu hóa các protein có mặt trong bệnh phẩm Tách chiết DNA bằng nhiệt  Là phương pháp tách chiết thô  Phương pháp dựa trên nguyên tắc dùng nhiệt để tách DNA từ các tế bào vi khuẩn hay KST (KSTRS) vào dung dịch, hay sử dụng shock nhiệt trong dung dịch kiềm và có chất tẩy (tách chiết mẫu thuỷ sản) Tách chiết DNA bằng silica  Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau  Phương pháp này do BOOM sáng chế ra. Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để phá hủy hoạt tính các nuclease, và các DNA trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được DNA từ mẫu thử  Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica, hay dùng các hạt từ bọc silica. Tách chiết DNA bằng P/C/I  Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau  Mẫu thử khi được trộn cùng với dung dịch Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (P/C/I) 25:24:1 thì các protein trong mẫu thử sẽ bị phenol làm biến tính và vón cục lại. Khi ly tâm, nhờ có sự hiện diện của chloroform nên các vón cục này sẽ bị tách ra và tập trung trong lớp phân cách giữa phase nước và phase P/C/I. Phase nước chứa DNA trong phase lỏng sẽ lấy ra và được làm kết tủa bởi ethanol ở nồng độ muối cao Tách chiết DNA bằng CTAB  Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho tách chiết bộ gene tế bào vi khuẩn  Đầu tiên vách tế bào vi khuẩn bị lysozyme làm yếu đi, rồi bị SDS ly giải. Sau đó các protein vi khuẩn sẽ bị proteinase K tiêu hóa, rồi các protein bị tiêu hóa nầy cùng các mảnh vỡ tế bào bị CTAB kết tủa lại dưới sự hiện diện của nồng độ muối cao. Các thành phần lipid của vi khuẩn lại bị chloroform/isoamyl alcohol lấy đi, bộ gen DNA của vi khuẩn trong phase lỏng sẽ bị kết tủa nhờ isopropanol. Tách chiết DNA bộ gene bạch cầu  Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho tách chiết bộ gene tế bàobạch cầu  Phương pháp nầy dùng đệm carbonat- ammonium lạnh có EDTA để ly giải các tế bào trong mẫu máu, sau đó ly giải nhân các tế bào bạch cầu bằng một dung dịch đệm kiềm có thêm SDS. Dùng thêm proteinase K để làm tan protein tế bào để phóng thích hoàn toàn bộ gen DNA vào dung dịch. Cuối cùng tủa bộ gen DNA bằng isopropanol. Tách chiết RNA • Không có phương pháp tách chiết thô • Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được RNA từ mẫu một cách hoàn toàn Tách chiết RNA bằng silica  Là phương pháp tách chiết tinh, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau  Phương pháp này do BOOM sáng chế ra. Nguyên tắc là dùng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để phá hủy hoạt tính các nuclease, và các RNA trong mẫu sẽ bám vào các hạt Silica, nhờ đó tách chiết được RNA từ mẫu thử. Nếu muốn loại bỏ hoàntoàn DNA thì có thể dùng DNAse  Được nhiều công ty áp dụng để chế các kit tách chiết sử dụng cột với màng lọc silica, hay dùng các hạt từ bọc silica. [...]... phương pháp  Thực hiện tách chiết trên chứng [-] là mẫu thật có thêm vào nucleic acid vi sinh vật đích có lượng tương đương LOD của phương pháp  Cho thêm vào mẫu thử nucleic acid của chứng nội tại có lượng tương đương LOD của phương pháp rồi cùng tách chiết với mẫu thử Phương pháp này kiểm tra được độ nhạy của tách chiết trên từng mẫu thử Kiểm chứng độ nhạy (LOD) của phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn.. .Tách chiết RNA bằng Trizol  Là phương pháp tách chiết RNA toàn phần, áp dụng cho nhiều loại mẫu thử khác nhau  Phương pháp dựa trên phương pháp do CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng chế Nguyên tác là dùng Guanidine 14M và urea, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ bị vón lại, DNA... sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen Kiểm chứng độ nhạy của bộ thuốc thử tách chiết nucleic acid  Thực hiện tách chiết trên chứng [+] là mẫu thật có chứa số copies biết rõ của rồi pha loãng các dịch tách chiết để thực hiện PCR để xác định LOD của phương pháp ... gồm cả kiểm tra chất lượng của các thuốc thử đang dùng có còn giữ được chất lượng hay không, kiểm tra các bước xét nghiệm có cơ sót không, và trong real-time PCR còn phải đánh giá độ chính xác của định lượng Bệnh phẩm Kiểm sóat nguy cơ ngọai nhiễm trong quá trình tách chiết NA Kiểm sóat nguy cơ ngọai nhiễm và ức chế trong quá trình khuếch đại Chuẩn bị Tách chiết nucleic acid Chạy PCR Phát hiện sản phẩm... Tất cả các thuốc thử được pha chế hay cung cấp phải được kiểm tra chất lượng và phải có bằng chứng kiểm tra chất lượng cho thấy phương pháp kiểm tra như thế nào, cách đánh giá thế nào là đạt, và kết quả kiểm tra chất lượng của thuốc thử đó  Phải có đủ các chứng ở dạng bền vững để giúp người sử dụng kiểm soát độ nhạy của các thành phần trong bộ thử nghiệm và qui trình thử nghiệm  Người sử dụng các thuốc... Thể tích huyền dịch để tách chiết là 100ul, thôi ra 100ul rồi lấy 10ul dịch tách chiết để chạy PCR phát hiện M tuberculosis trên PCR mix đã biết độ nhạy đạt 1 copy/thể tích phản ứng Một ví dụ kết quả kiểm tra chất lượng PCR mix dành cho PCR phát hiện HBV và PCR phát hiện M tuberculosis Đối với người làm xét nghiệm thì cũng phải có các chứng và chuẩn để kiểm tra chất lượng của các khâu làm xét nghiệm... Lạnh hay đông lạnh Để đảm bảo có mặt nucleic acid của tác nhân vi sinh vật cần phát hiện và nucleic acid này không bị ly giải hay bị ức chế Vật liệu lấy mẫu hi ệ PCR Kết quả T CR cid P ca lei Nhận mẫu Tá hự ch c ch iết ử h c c t Nu uố hiết i Th ch c h đạ Tá uếc iện h Kh át Ph Nu n P c Kh leic CR u a Ph ếch cid át đạ hiệ i n Các kiểm soát chất lượng tại phòng xét nghiệm Các thuốc thử làm xét nghiệm phải... Làm thế nào để áp dụng PCR một cách chính xác và hiệu quả? PCR và real-time PCR là một hệ thống mở do vậy đã cho phép người sử dụng tiếp cận bằng cách thiết kế và chế tạo các thuốc thử hay bộ xét nghiệm dùng trong chẩn đóan Tuy nhiên vì phải áp dụng cho chẩn đóan cho nên khi tiến hành thực hiện xét nghiệm PCR, người làm xét nghiệm phải chú ý các chuẩn mực kiểm soátt các sai lầm trong quá trình làm... (TB2), 100/10ul (TB3), 10/10ul (TB4), và 1/10ul (TB5) Kiểm tra bộ thuốc thử NK DNAPREP-BOOM cần kiểm tra và bộ NKDNAPREP-BOOM được sản xuất trước đó Thể tích huyền dịch để tách chiết là 100ul, thôi ra 100ul rồi lấy 10ul dịch tách chiết để chạy PCR phát hiện M tuberculosis trên PCR mix đã biết độ nhạy đạt 1 copy/thể tích phản ứng Mô hình phòng thí nghiệm real-time PCR dành cho chẩn đoán Mô hình phòng... dụng kết quả cũng phải quan tâm đến các chất lượng này cũng như quan tâm đến các đánh giá ý nghĩa của xét nghiệm Đảm bảo chất lượng của việc áp dụng PCR trong chẩn đoán Chỉ định xét nghiệm PCR Lấy và chuyên chở mẫu thử đến phòng xét nghiệm Thực hiện xét nghiệm PCR tại phòng thí nghiệm Phúc trình kết quả xét nghiệm đến lâm sàng Phân tích các kết quả xét nghiệm Sử dụng các kết quả trong chẩn đoán và điều . Các phương pháp tách chiết nucleic acid Phạm Hùng Vân Tách chiết DNA • Tách chiết thô, chưa tinh khiết được DNA từ mẫu một cách hoàn toàn. Phương pháp áp dụng cho các mẫu có nhiều. isopropanol. Tách chiết RNA • Không có phương pháp tách chiết thô • Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được RNA từ mẫu một cách hoàn toàn Tách chiết RNA bằng silica  Là phương pháp tách chiết tinh,. khuẩn, tách chiết các mẫu thuỷ sản ) • Tách chiết tinh sạch, tinh khiết được DNA từ mẫu một cách hoàn toàn Tách chiết DNA bằng proteinase K  Là phương pháp tách chiết thô  Phương pháp dựa