Xác định và đánh giá khả năng phát hiện tồn dư kháng sinh nhóm tetracyclines và quinolones trong thịt lợn bằng phương pháp hai đĩa mới (new two plate test

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - - PH M DUY LU N VĂN TH C S XÁC ð NH VÀ ðÁNH GIÁ KH NĂNG PHÁT HI N T N DƯ KHÁNG SINH NHÓM TETRACYCLINES VÀ QUINOLONES TRONG TH T L N B NG PHƯƠNG PHÁP HAI ðĨA M I (NEW TWO PLATE TEST) CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH SAU THU HO CH Mà S : 60.54.10 Ngư i hư ng d n khoa h c: TS PH M KIM ðĂNG TS NGUY N TH THANH TH Y HÀ N I – 2013 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan s li u k t qu nghiên c u lu n văn b n thân tr c ti p ti n hành s c ng tác v i k thu t viên Phịng Thí Nghi m Trung Tâm – Khoa Chăn nuôi Nuôi tr ng Thúy s n, th y cô giáo Khoa Công ngh th c ph m ð i h c Nông nghi p Hà N i Các tài li u ñã trích d n c a tác gi ñ u ñư c li t kê ñ y ñ , không chép b t c tài li u mà khơng trích d n Hà N i, ngày 05 tháng 09 năm 2013 H c viên Ph m Duy Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii L I C M ƠN L i đ u tiên, tơi xin bày t lịng kính tr ng s bi t ơn t i TS Ph m Kim ðăng, TS Nguy n Th Thanh Th y, ngư i t n tình hư ng d n giúp đ tơi c trình th c hi n lu n văn t o u ki n cho tơi hồn thành t t lu n văn Tôi xin g i l i c m ơn sâu s c t i th y cô giáo Khoa Công ngh th c ph m ñ c bi t th y cô thu c B môn Th c ph m – Dinh dư ng, v lịng nhi t tình s đóng góp ý ki n h t s c quý báu cho su t th i gian h c t p hoàn thành lu n văn Tôi xin g i l i c m ơn t i th y cô giáo Khoa Chăn nuôi Nuôi tr ng th y s n k thu t viên t i Phịng thí nghi m Trung tâm, Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i, nh ng ngư i ln t o u ki n cho tơi v th i gian nghiên c u, nhi t tình giúp đ tơi q trình th c hi n lu n văn Cu i cùng, xin g i l i c m ơn đ n gia đình, b n đ ng mơn đ ng nghi p ñã ch d a v ng ch c, ngu n ñ ng viên to l n cho su t th i gian h c t p th c hi n lu n văn, giúp tơi trư ng thành bư c nh ng ñư ng m i Hà N i, ngày 05 tháng 09 năm 2013 H c viên Ph m Duy Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iii M CL C L I CAM ðOAN i L I C M ƠN iii M C L C .iv DANH M C B NG .vii DANH M C HÌNH viii PH N TH NH T: M ð U 1.1 ð t v n ñ 1.2 M c đích - u c u .3 1.2.1 M c ñích 1.2.2 Yêu c u PH N TH HAI - T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Gi i thi u chung v kháng sinh 2.1.1 L ch s v kháng sinh 2.1.2 Gi i thi u nhóm kháng sinh Tetracyclines Quinolones 2.1.3 Vai trò tác h i c a vi c s d ng kháng sinh chăn nuôi 2.1.4 Nguyên t c s d ng kháng sinh chăn ni 2.2 Tình hình s d ng kháng sinh chăn nuôi 10 2.2.1 Tình hình s d ng kháng sinh chăn nuôi th gi i 10 2.2.2 Tình hình s d ng kháng sinh chăn ni Vi t Nam 12 2.3 V n ñ t n dư kháng sinh s n ph m chăn nuôi 13 2.3.1 Các khái ni m v t n dư kháng sinh 13 2.3.2 Tình hình t n dư kháng sinh s n ph m chăn nuôi nư c th gi i Vi t Nam 15 2.3.3 M i nguy liên quan ñ n t n dư kháng sinh s n ph m ñ ng v t 18 2.3.4 Nguyên nhân gây t n dư kháng sinh s n ph m ñ ng v t 21 2.3.5 M t s quy ñ nh liên quan qu n lý t n dư kháng sinh th t 22 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv 2.4 Phân lo i phương pháp phát hi n ñ nh lư ng kháng sinh s n ph m có ngu n g c đ ng v t .24 2.4.1 Phương pháp sàng l c 24 2.4.2 Phương pháp h u sàng l c 25 2.4.3 Phương pháp kh ng ñ nh ñ nh lư ng xác 25 PH N TH BA: V T LI U – N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U .27 3.1 Nguyên v t li u hóa ch t .27 3.1.1 M u th t l n 27 3.1.2 D ng c hóa ch t 27 3.1.3 Gi ng vi sinh v t, môi trư ng nuôi c y 30 3.2 N i dung nghiên c u .30 3.2.1 ðánh giá kh phát hi n c a phương pháp hai ñĩa m i .30 3.2.2 So sánh kh phát hi n m t s kháng sinh d i di n hai nhóm Tetracyclines Quinolones c a phương pháp hai ñĩa m i v i phương pháp Premi – Test 30 3.2.3 So sánh kh phát hi n m t s kháng sinh thu c nhóm Tetracyclines c a phương pháp hai ñĩa m i v i kit Tetrasensor 30 3.2.4 Th nghi m phương pháp hai đĩa m i đ phân tích m u th t ñư c l y th trư ng ba qu n huy n ñ i di n c a thành ph Hà N i 30 3.3 Phương pháp nghiên c u 31 3.3.1 Phương pháp l y m u x lý m u .31 3.3.2 Quy trình tách chi t kháng sinh th t l n 31 3.3.3 Sơ đ b trí cách đ c k t qu phương pháp hai ñĩa .32 3.3.4 Phương pháp ñánh giá kh phát hi n c a phương pháp hai ñĩa m i 36 3.3.5 So sánh kh phát hi n m t s kháng sinh c a phương pháp hai ñĩa m i v i phương pháp sàng l c khác 38 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v 3.3.6 Th nghi m phương pháp hai ñĩa m i đ phân tích m u th t ñư c l y th trư ng Gia Lâm Hà N i 38 3.4 Phương pháp x lý s li u 39 PH N TH TƯ: K T QU VÀ TH O LU N 40 4.1 K t qu ñánh giá kh phát hi n c a phương pháp hai đĩa m i thơng qua ch t chu n m u c ng c ch t chu n 40 4.1.1.Th ñ i ch ng .40 4.1.2.Xác ñ nh ngư ng phát hi n 43 4.1.3.Các tham s ñ m nh c a phương pháp .45 4.2 K t qu so sánh kh phát hi n m t s kháng sinh ñ i di n hai nhóm Tetacycines Quinolones c a phương pháp hai ñĩa m i v i phương pháp Premi – Test 47 4.3 K t qu so sánh kh phát hi n m t s kháng sinh ñ i di n nhóm Tetracyclines c a phương pháp hai đĩa m i v i kít Tetrasensor 48 4.4 Bư c đ u th nghi m phương pháp hai ñĩa m i phân tích t n dư kháng sinh m u th t l n ñư c l y th trư ng thành ph Hà N i .49 4.4.1 K t qu sàng l c t n dư kháng sinh m u th t l n ñư c l y th trư ng Hà N i 50 4.4.2 K t qu đ nh nhóm ñ nh lư ng t n dư Tetracyclines Quinolones m u th t l n ñư c l y th trư ng Hà N i 51 PH N TH NĂM: K T LU N VÀ ð NGH 54 5.1 K t lu n 54 5.2 ð ngh .55 TÀI LI U THAM KH O 56 PH L C .63 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C B NG B ng 3.1 Cách ñ c k t qu phương pháp hai ñĩa m i (Dang el al, 2011) 35 B ng 3.2 Công th c ñư c dùng ñ xác ñ nh ñ xác th c, ñ ñ c hi u ñ nh y c a phương pháp 38 B ng 4.1 K t qu th đ i ch ng mơi trư ng pH 6,0 41 B ng 4.2 Ngư ng phát hi n c a phương pháp .44 B ng 4.3 Các tham s v ñ m nh c a phương pháp ñ i v i hai nhóm kháng sinh đư c th 45 B ng 4.4 K t qu so sánh kh phát hi n hai nhóm kháng sinh Tetracyclines Quinolones c a phương pháp hai ñĩa m i v i phương pháp Premi-Test 47 B ng 4.5 K t qu so sánh kh phát hi n nhóm Tetracyclines c a phương pháp hai đĩa m i v i phương pháp Tetrasensor 48 B ng 4.6 K t qu sàng l c t n dư kháng sinh th t l n ñư c l y t i m t s ch ñ a bàn thành ph Hà N i 50 B ng 4.7 K t qu phân tích đ nh nhóm Tetracyclines 51 B ng 4.8 K t qu phân tích đ nh nhóm Quinolones 53 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii DANH M C HÌNH Hình 3.1 Ngun lý Premi-Test 28 Hình 3.2 Quy trình tách chi t m u đ c k t qu phân tích c a kít Tetrasensor 29 Hình 3.3 Quy trình tách chi t kháng sinh 32 Hình 3.4 Sơ đ b trí phương pháp hai đĩa 33 Hình 3.5 Chi n lư c phân tích dư lư ng kháng sinh th t l n ñư c bán t i ch Hà N i 39 Hình 4.1 ðo vịng vơ khu n c a test đ i ch ng 40 Hình 4.2 Phân tích m u b ng phương pháp Tetrasensor .49 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… viii DANH M C CH CÁI VI T T T Ti ng Anh T vi t t t Ti ng Vi t An toàn v sinh th c ph m ATVSTP H s bi n ñ ng CV EU European Union Liên minh Châu Âu EC European Community C ng ñ ng Châu Âu Enzyme Linked Immunosorbent Assay Phương pháp mi n d ch enzyme Food and Drug Administration Cơ quan qu n lý thu c th c ELISA FDA ph m Four Plate Test Phương pháp b n ñĩa GC/MS Gas Chromatography / Mass Spectrometry S c ký khí kh i ph HPLC High Performance Liquid Chromatography S c ký l ng hi u cao Hight Performance Thin Layer S c ký b n m ng hi u cao FPT HPTLC Chromatography MRL MRPL Maximum Residue Limit Gi i h n t n dư t i ña Minimum Required Performance Limit Yêu c u t i thi u v hi u c a phương pháp NTPT New Tow Plate Test Phương pháp hai ñĩa m i LC/MS Liquid Chromatography / Mass Spectrometry S c ký l ng kh i ph LOD Limit Of Detection Gi i h n phát hi n FAO Food and Agriculture Organization T ch c lương th c th gi i WTO World Trade Organization T ch c thương m i thê gi i KFDA Korea Food and Drug Administration Cơ quan qu n lý thu c th c ph m Hàn Qu c TA TCN TCVN VSV Th c ăn Tiêu chu n ngành Tiêu chu n Vi t Nam Vi sinh v t Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ix PH N TH NH T: M ð U 1.1 ð t v n ñ Trư c s c ép v nhu c u nông s n, th c ph m nư c ta v i quy mô dân s 87 tri u dân, chăn ni thâm canh tr thành m t xu hư ng t t y u di n tích đ t nơng nghi p ngày thu h p Tuy nhiên xu hư ng ñã kéo theo s nhi m mơi trư ng, di n bi n d ch b nh ph c t p [55] Vi c s d ng kháng sinh chăn nuôi Tetracylines, Beta – lactams, Phenicols thu c có tác d ng kháng sinh ngày nhi u [6][26] ð c bi t l m d ng Tetracylines Quinolones r t ph bi n chăn nuôi l n Vi t Nam ði u gây nh hư ng x u ñ n h vi sinh v t, môi trư ng, s c kh e ngư i tiêu dùng, nh hư ng đ n cơng ngh lên men ch bi n th c ph m[16][20][46] ð ki m soát dư lư ng hóa ch t, ch t kháng sinh s n ph m th c ph m có ngu n g c ñ ng v t, nư c phát tri n EU, M ñã ban hành quy đ nh có liên quan đ n qu n lý, s n xu t kinh doanh, s d ng thu c thú y quy t ñ nh s 2377/90/EC c a y ban Châu Âu (s a ñ i thành Quy t ñ nh 37/2010) quy ñ nh gi i h n cho phép thu c thú y s n ph m ñ ng v t [30][31] Vi t Nam nư c khác có nhi u c g ng cơng tác qu n lý nhà nư c ñ i v i lĩnh v c này, ngồi quy đ nh qu n lý liên quan ñ n kinh doanh s d ng thu c thú y c a B Nông nghi p Phát tri n nơng thơn cịn có Quy t ñ nh s 46/2007/Qð-BYT B Y T ban hành quy ñ nh gi i h n t i ña dư lư ng kháng sinh Ngoài quy ñ nh c a lu t pháp, m t s phương pháp hóa lý hi n đ i phân tích kh i ph có đ xác cao đư c nghiên c u chu n hóa Nhưng tính ph c t p, giá thành cao địi h i trang thi t b ñ t ti n nên phương pháp r t khó áp d ng ch ñư c khuy n cáo s d ng c n kh ng ñ nh, ñ nh lư ng xác ð gi m thi u s lư ng, chi phí phân tích tăng s lư ng m u đư c ki m sốt vi c áp d ng phương pháp sàng l c trư c Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 4.4.1 K t qu sàng l c t n dư kháng sinh m u th t l n ñư c l y th trư ng Hà N i V i m c tiêu ñánh giá kh sàng l c c a phương pháp hai ñĩa m i bư c ñ u ñánh giá m c ñ t n dư kháng sinh B ng 4.6., 92 m u th t l n ñư c l y ch thu c ba qu n huy n Gia Lâm, Hà ðơng, Hồn Ki m đư c l y phân tích theo chi n lư c phân tích ba bư c (sàng l c, h u sàng l c kh ng đ nh) hình 3.5 K t qu sau sàng l c ñ ng th i b ng hai phương pháp Hai ñĩa m i Premi-Test phát hi n 24 m u nghi ng ch a kháng sinh (chi m kho ng 26%), s có 12 m u đư c phát hi n b i c hai phương pháp phương pháp hai ñĩa m i phương pháp premi-test, 10 m u khác ch ñư c phát hi n b i phương pháp hai ñĩa m u ch ñư c phát hi n b i Premi-Test (hay nói cách khác, 14 m u ñư c phát hi n b i premi-test có m u khơng đư c phương pháp hai ñĩa m i phát hi n) K t qu sàng l c m u nghiên c u th p k t qu nghiên c u t n dư kháng sinh th t l n vùng đ ng b ng sơng H ng th c hi n vào năm 2009-2010, t l m u th t l n nghi ng ch a kháng sinh sau bư c sàng l c 39% (Dang cs., 2013) [28] B ng 4.6 K t qu sàng l c t n dư kháng sinh th t l n ñư c l y t i m t s ch ñ a bàn thành ph Hà N i Phương pháp hai Premi-Test S ñĩa m i m u S S T l Qu n/huy n sàng m u T l m u nghi l c nghi nghi ng nghi ng (m u) ng (%) ng (%) (m u) (m u) Gia Lâm 34 26,47 17,65 Tính chung* S m u nghi ng (m u) 10 29,41 T l nghi ng (%) Hà ðông 28 21,43 17,86 25,00 Hoàn Ki m 30 23,33 10,00 23,33 Tính chung 92 22 23,91 14 15,22 24 26,09 * M u nghi ng m u đư c phát hi n b i nh t m t hai phương pháp K t qu sàng l c t n dư kháng sinh th t l n b ng 4.6 cho th y t l nghi ng m u có ch a kháng sinh hai nhóm Tetracylines Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 50 Quinolones ñ i v i t t c m u sàng l c c a phương pháp hai ñĩa m i 23,91% cao h n so v i t l nghi ng c a m u ch a hai nhóm kháng sinh 15,22% ði u m t l n n a kh ng đ nh tính ưu vi t c a phương pháp hai ñĩa m i phát hi n kháng sinh hai nhóm Tetracylines Quinolones so v i phương pháp Premi-Test 4.4.2 K t qu ñ nh nhóm đ nh lư ng t n dư Tetracycline Quinolones m u th t l n ñư c l y th trư ng Hà N i ð có đ nh hư ng cho phân tích kh ng đ nh, m u nghi ng có ch a kháng sinh sau bư c sàng l c đư c phân tích đ nh nhóm b ng phương pháp Tetrasensor (phát hi n kháng sinh nhóm Tetracyclines) ELISA (phát hi n kháng sinh nhóm Quinolones) B ng 4.7 K t qu phân tích đ nh nhóm Tetracyclines K t qu Ký hi u đ nh nhóm LC-MS kh ng đ nh Tetracyclines m u tetracycline Chlortetracycline & epiChlortetracycline